全 文 ：　1997-08-18收稿
　第一作者简介:唐绍清 , 男 , 1965年出生 , 博士 , 从事植物学教学研究工作。
＊广东省自然科学基金资助项目 950092
几种因素对山茶属植物 RAPD 分析
的 DNA 扩增的影响＊
　　　　唐绍清　　　　　　　　施苏华　　　　　林海波
(广西师范大学生物系 , 桂林 541004)　(中山大学生命科学学院)　(深圳市园林科学研究所)
摘　要　多种因素会影响 RAPD扩增 , 本研究试验了引物 、 Mg 2+和 dNTP 的浓度以及 Taq酶来
源对山茶属植物进行 RAPD分析的 DNA 扩增的影响 。结果表明这些因素对扩增结果都会产生影
响 , 通过比较分析 , 得到了一个对于山茶属植物进行 RAPD分析较理想的扩增条件 。
关键词　山茶属;RAPD;扩增条件　
The effects of amplification conditions on RAPD
amplification for Camellia
Tang Shaoqing
(Guangx i Normal University , Department of Biology , Guilin 541004)
Shi Suhua　　　　　　　　　　　Lin Haibo
(Zhongshan University , School of Lif e Sciences)　　　　(Shenzhen Instituteof Hort iculture)
Abstract　The effects of the sources of TaqDNA polymerase and the concentrations of magnesium , primer
and dNTP w ere tested.The results show ed that RAPD patterns w ere affected by those conditions of ampli-
fication reaction.The optical amplification conditions for Camellia w ere the following :lng total DNA/μl
reaction volume;2.0 mmol/L MgCl2;100μmol/L each dATP , dCTP , dGTP and dTTP;1U qualified
Taq DNA polymerase/20 μl reaction volume.
Key words　Camellia;RAPD;amplification conditions
随机扩增多态性 DNA (RAPD)分析具有花费少 、 快捷 、 要求少量的 DNA 、 不需要有关
DNA序列资料 、 不包括放射性的使用和能获得的标记位点数目不受限制等优点 , 已被广泛应用
于基因定位 、寻找特定基因连锁标记 、 研究植物分类和进化及种群遗传变异性等方面。但模板
DNA 量 、 引物浓度 、镁离子浓度 、 脱氧核苷三磷酸 (dNTP)浓度 、 Taq 酶的量和来源以及扩增
程序等都会影响 DNA扩增〔1 , 2〕 , 从而影响扩增产物的重复性 , 以致影响 RAPD 分析的可靠性。
本研究试验了各种因素对山茶属植物进行 RAPD分析 DNA 扩增的影响 , 目的在于得到一个对于
广西 植物 Guihaia　18 (2):185—188 1998年 5月　
山茶属植物进行 RAPD分析较理想的扩增条件。
1　材料与方法
1.1　材料　大样金花茶 (Camellia grandis (C.F.Liang et S.L.Mo)Chang et S.Y.Liang)、龙州
金花茶 (C.longzhouensis J.Y.Luo)、 东兴金花茶 (C.tunghinensis Chang)、 淡黄金花茶 (C.f la
vida Chang)和凹脉金花茶(C.impressinervis Chang et S.Y.Liang)。
图 1　几种因素对 RAPD扩增的影响
Fig 1.The effects of amplification conditions on RAPD amplification
a.引物浓度对 RAPD 扩增的影响 　1、2:20 ng 大金花茶总 DNA;3、4:20 ng 龙州金花茶总 DNA;5、6、7:20 ng
东兴金花茶总DNA 。不同的引物浓度:1 、3 、5:Operon公司指定的引物浓度;2 、4 、6:2/ 3倍指定的引物浓度;
7:1/ 2倍指定的引物浓度。M:1 kb Ladder DNA marker。
b.dNTP 和镁离子浓度对 RAPD扩增的影响　不同的 dNTP浓度:1、2:100μmol/ L dNTP;3、4、5、6、7、8:200μmol/ L dNTP。不
同的MgCl2浓度:1、3:1.5 mmol/ L MgCl2;2、4:2.0 mmol/ LMgCl2;5:2.5 mmol/ LMgCl2;6:3.0 mmol/ L
MgCl2;7:3.5 mmol/ L MgCl2;8:4.0 mmol/ L MgCl2。
c.Taq来源对 RAPD扩增的影响　1 、3 、5:20 ng总 DNA ;2 、4 、6 :对照 , 不加总 DND 。不同来源的 Taq酶;1 、
2:某公司的酶 1个单位;3、4:华美公司(SABC)的酶 1个单位;5、6:Promega公司的酶 0.5个单位。
a.Effect of the concen tration of primer on the amplification of RAPD Line 1 , 2:20 ng total DNA of Camellia grandis;Line 3 , 4:
20 ng total DNA of C.longzhouensis;Line 5 , 6, 7:20 ng total DNA of C.tungh inensis.Concentrat ion of primer varied as follow s:
Line 1 , 3 , 5: the concentrat ion of primer recomended by the manufacture (Operon Technologies); Line 2 , 4,
6 :2 / 3 times the concentration of p rimer recommended by the manufacture ;Line 7 :1 / 2 times the concentration
of primer recommended by the manufacture.M.1kb Ladder DNA.
b.Effects of the concentrat ion of dNTP and Mangnesium on the amplificationof RAPD.Line 1 , 2:100μmol/ L dNTP;Line 3 , 4 , 5,
6 , 7 , 8:200μmol/ L dNTP.The concentration of M gCl2 varied as follow s.Line 1 , 3:1.5 mmol/ L M gCl2; Line
2 , 4 :2 .0 mmol/ L M gCl2 ;Line 5 :2 .5 mmol/ L MgCl2 ;Line 6 :3 .0 mmol / L MgCl2 ;Line 7 :3 .5 mmol/ L
MgCl2;Line 8:4.0 mmol/ L M gCl2.
c.Effect of Tag DNA polymerase resure on the amplif icat ion of RAPD.Line 1, 3 , 5:20 ng total DNA of Camell ia
impressinervis ;Line 2 , 4 , 6 :no template.Line 1 , 2 :1 U Taq DNA polymerase from a company ;Line 3 , 4 :1 U Taq
polymerase from SABC;Line 5 , 6:0.5 U Taq polymerase from Promega.
186 广　西　植　物 18卷　　
1.2　方法
1.2.1　DNA提取
采用 CTAB法〔3〕提取总 DNA 。DNA 纯化按下列步骤进行:DNA TE溶液加入 1%体积的 RNA
酶(10 mg/ml), 37 ℃, 45 min;加入 3倍体积的 6 mol/L NaCl ,约 4 μl玻璃粉 TE溶液 ,混匀 ,放置 5
min(中间摇动几次);5 000 rpm离心 3 min ,去上清液;加洗液(含 0.2 mol/L NaCl;10 mmol/L T ris
-HCl ,pH8.0;1 mmol/L EDTA;50%乙醇)150 μl ,混匀 , 4 000 rpm离心 1 min ,去上清液 ,重复清洗
3次;凉干 ,加 50 μl 1×TE;50 ℃保温 20 min;10 000 rpm离心 10 min ,将上清液移至新管 ,弃沉淀 ,
-20 ℃保存 ,用于 PCR 。
1.2.2　引物浓度对 RAPD扩增的影响
共同的反应条件:20 μl反应体积 , 1 ×Taq 酶 buffer , 100 μmol/L dNTP , 1.5 mmol/L MgCl2 , 1
个单位 Taq酶 ,约 20 ng总 DNA(大金花茶 、龙州金花茶和东兴金花茶)。不同的 RAPD引物 OPA-
18(10 个核苷酸长 ,Operon 公司产品)浓度:1)Operon 公司指定浓度;2)2/3 倍指定浓度;3)1/2倍指
定浓度。
1.2.3　dNTP和 Mg2+浓度 RAPD扩增的影响
共同的扩增条件:20 μl反应体积 , 1 ×Taq 酶 buffer ,约 20 ng淡黄金花茶总 DNA ,Operon公司
指定的引物浓度(OPA-18), 1个单位 Taq酶。不同浓度的 dNTP 和MgCl2 :
1)100 μmol/L dNTP , 1.5 mmol/L MgCl2;　2)100 μmol/L dNTP ,2.0 mmol/L MgCl2 ;
3)200 μmol/L dNTP , 1.5 mmol/L MgCl2;　4)200 μmol/L dNTP ,2.0 mmol/L MgCl2 ;
5)200 μmol/L dNTP , 2.5 mmol/L MgCl2;　6)200 μmol/L dNTP ,3.0 mmol/L MgCl2 ;
7)200 μmol/L dNTP , 3.5 mmol/L MgCl2;　8)200 μmol/L dNTP ,4.0 mmol/L MgCl2 。
1.2.4　Taq酶质量对 RAPD扩增的影响
共同的反应条件:20 μl反应体积 , 1 × Taq 酶 buffer , 2.0 mmol/L MgCl2 , 100 μmol/L dNTP ,
Operon 公司指定的引物浓度(OPA-12)。不同公司生产的 Taq酶:1)某公司生产的 Taq酶 1单位 ,
20 ng凹脉金花茶总 DNA;2)某公司生产的 Taq酶 1个单位 ,空白对照(不加总 DNA);3)华美公司
的 Taq 酶 1个单位 , 20 ng 凹脉金花茶总DNA;4)华美公司的 Taq酶 1个单位 ,空白对照;5)Promega
公司的 Taq酶 0.5 个单位 , 20 ng凹脉金花茶总 DNA;6)Promega公司的 Taq酶 0.5 个单位 ,空白对
照。
以上扩增均在 PCR仪(Perkins-Elmer Cetus model 480),按下列程序进行扩增:94 ℃5 min ,一
个循环;接着 45个下列循环 , 94 ℃1 min※35 ℃1 min※72℃1 min;最后 72 ℃7 min ,一个循环 ,结
束。扩增完成后 ,取 10 μl样装在 1.4%琼脂糖凝胶上 ,在 1 ×TAE缓冲溶液中电泳 ,稳压(4 v/ cm)
电泳约 4 h 30 min , 1 kb Ladder DNA(美 ,生命技术公司产品)用作分子量标准。凝胶在 0.5 μg/ml
EB(溴化乙锭)溶液中染色约 40 min ,在紫外光下检测。
2　实验结果与分析
2.1　试验引物浓度对扩增效果的影响　结果表明(图版 1∶a),Operon公司指定的引物浓度(Operon公
司产品说明的使用浓度 ,即加 1/10于反应体积的标准浓度的引物)扩增的效果较好 ,得到的 DNA
片段多 ,量大。2/3倍 Operon公司指定浓度和 1/2 倍 Operon公司指定浓度引物扩增效果也可以 ,
但缺少其中少数带 ,有的带相对较弱。因此用 Operon 公司指定的引物浓度进行 DNA 扩增是较理
想的。
187　　2期 唐绍清等:　几种因素对山茶属植物 RAPD分析的 DNA 扩增的影响
2.2　试验不同 dNTP 浓度和MgCl2浓度对扩增的影响　结果表明(图版 1∶b),在 100 μmol/L 或 200
μmol/L dNTP浓度下 ,均能扩增到清晰的带型。对于 Mg2+浓度 ,从 1.5 mmol/L 至 2.5 mmol/L带
型无变化 ,但在 2.0 mmol/L 扩增产物量大。从 3.0 mmol/L 至 4 mmol/L产生两条新带 ,并且随着
Mg2+浓度增高而变得清晰。因此 100 μmol/L dNTP和 2.0 mmol/L Mg2+为较理想的 PCR反应条
件。这与 Ellsworth等〔4〕报道的镁离子浓度对扩增产物的影响结果有所不同 ,他们发现从 0 到 2
mmol/L扩增带型有变化 ,但超过 2.0 mmol/L ,一直至 7.0 mmol/L ,带型无变化。
2.3　酶的来源是影响扩增的另一个重要方面　用购自某公司(1 个单位)、华美生物技术公司(1 个单
位)和 Promega(0.5个单位)的 Taq酶作了比较(图版 1∶c)。华美生物公司和 Promega公司生产的
Taq 酶的空白对照无假带的产生 ,而某公司生产的酶有大量假带的产生。加总 DNA 后 ,华美公司
的酶的扩增产物比 Promega公司的酶的扩增产物多一条约 3 000 bp的片段 ,其他带一致 ,某公司的
酶与上述两家公司的酶的扩增产物大多数一致 ,但多了一条与假带相同的带。结果表明 ,Taq酶的
质量也是至关重要的 ,质量不好的酶 ,可能会有大量假带的产生 ,不同来源的酶可能会有某些带型
的变化。因此有必要选取质量较好的 Taq酶 ,用同一引物对不同材料进行 DNA 扩增 ,必须使用来
源相同的 Taq酶。
2.4　扩增程序也会对扩增结果产生影响 　使用常规的 RAPD 扩增程序:94 ℃1 min ※35 ℃ 1 min※
72 ℃2 min 45个循环;72 ℃7 min 1 个循环。与被 Yu 等〔5〕认为是耗时短 ,效果好的程序:94 ℃5
min 1个循环;94 ℃5 s※35 ℃30 min※72 ℃60 s 35个循环 ,接着 72 ℃7 min进行扩增比较。扩增
结果表明前一程序扩增效果良好 ,而后一种程序无任何扩增产物 ,可见后一种快速的扩增程序不一
定适合于所有的材料。
以上各因素都会影响到 DNA扩增 ,对于不同材料可能要求不同的最适的扩增条件。因此 ,为
了能得到重复性好可用于 RAPD分析的扩增 DNA 片段 ,研究前确定最适的各扩增条件 ,并对这一
条件加以固定 ,是非常重要的。经过上述试验后确定了对于山茶属植物进行 RAPD分析较理想的
扩增条件:2.0 mmol/L MgCl2;100 μmol/L dNTP;约 1 ng总 DNA/ μl反应体积;Operon公司说明的
引物浓度;1个单位质量较好的 Taq酶/20 μl反应体积。
参 考 文 献
1　Adams R P , Demeke T.Systematic relationships in Juniperus based on random amplified polymorphic DNAs(RAPDs).Taxon ,
1993, 42(3):553～ 571
2　Yu K , Pauls K P.Optimizat ion of DNA ex tract ion and PCR procedures for random amplif ied polymorphic DNA(RAPD)analysis
in plant.PCR Technology:Current Innovat ions.New York:CRC Press , 1994 , 193～ 200
3　Doyle J J , et al.A rap id isolat ion procedure for small quant it ies of fresh lea f t issue.Phytochem Bull , 1987 , 19:11～ 15
4　Ellsworth D L , Rittenhous K D , Honeycut t R L.Arti factual variation in randomly amplified polymorphic DNA banding
pat terns.Biotechniques.1993 , 14:214～ 216
5　Yu K , Pauls K P.Optimization of the PCR program for RAPD analysis.Nucleic Acids Research , 1992 , 20(10):2606
188 广　西　植　物 18卷