全 文 ：广 西 植 物 Guihaia 26(5)：510— 512 2006年 9月
外源 DNA导入糯玉米 自交系 Do代变异
植株过氧化物酶同工酶分析
庾韦花1，张慧英 ，韦家川2，吴子恺 ，郝小琴2，王小敏3
(1．广西农业科学院。广西 南宁 530007；2．广西大学 农学院 ，广西 南宁 530005；3．玉林师范学院，广西 玉林 537000)
摘 要：采用改 良浸种法分别将甘蔗总 DNA与孟加拉超甜玉米 自交系总 DNA导入糯玉米 自交系 12-9—10，
在 Do代分别获得变异植株 ，采用聚丙烯酰胺垂直电泳法对该植株及供受体进行了过氧化物酶同工酶分析 ，其
结果表明：植株 Do(mX~3oo)的过氧化物酶同工酶在迁移率 Rf5—0．33和 Rf6=0．40分别出现一条供体特有而
受体没有 的酶带 ，其 酶带强 弱与供体 相同；在迁移率 Rfa=0．61出现一条供 受体都 没 有的弱带。植株
Do(wX盂甜300)．2在迁移率 Rf6—0．59增加了一条供受体都没有的弱带。说明了外源 DNA(或 DNA片段)已转
移到糯玉米 自交系 12-9-10中，并得到了表达。
关键词：浸种法 ；外源 DNA；变异；过氧化物酶同工酶
中图分类号 ：Q943 文献标识码：A 文章编号：1000—3142(2006)05—0510—03
Study on the isoenzyme of the variant plants
derived from exoRenous DNA intr,Mucti,mlV t o UC On
into the inbreds of gl utinous maize
YU Wei—hua ，ZHANG Hui—ying ，WEI Jia—chuan ，
W U Zi—kai2，HAO Xiao—qin2，W ANG Xiao—rain3
(1．Guangxi Academy of Agricultural Sciences。Nanning 530007，China：2．Agricultural College，Guangxi
University，Nanning 530005。China；3．Yulin Teachers’College，Yulin 537000。China)
Abstract：Through the improved methods of soaking emgryo，the total DNA of sugarcane and inbreds of sweet
maize was successfully introduced into the inbreds of glutinous maize 12—9—10 respectively． And the variant
plants were obtained from Do generation． W e had analyzed the zymograms of the peroxidase isozyme by
PAGE．The results showed that a peroxidase-isozyme strip which was of donor but not of receptor appeared at
Rfs一 0．33 and Rf6— 0．4O of the plant Do(waxy×sug300)，a peroxidase—isozyme weak strip which was not of donor
and receptor appeared at Rf8— 0．61．For the plant Do(waxv×mt300)一2，a peroxidase—isozyme strip which was not
of donor and receptor appeared at Rf6— 0．59．Thus，it was confirmed that exogenous genes(or DNA seg—
ments)were introduced into glutinous maize 12-9—10 and on expression．
Key words：methods of soaking embryo；exogenous DNA；variation；peroxidase—isozyme
周光宇(1988)提出 DNA片段杂交假说，外源
总 DNA浸种法就是基于此理论发展起来的一种进
行 DNA片段“杂交”的可行方法。该技术已在水稻
(文锦芬等，2003)、大豆(江巨鳌等，2004)、烤烟(杨
丽娟等，2003)等多种农作物上取得了一定的成果，
实现了目标性状基 因的转移 。自2003年，我们将黑
收稿 日期：2005—03—28 修回日期 ：2005—1O-10
基金项目：广西 自然科学基金项 目(桂科基 0236005)；广西教育厅项 目(桂教科研[2oo21316)[Supported byNatural Science Foun—
dation of Guangxi(O236OO5)；Education Department of Guangxi([2oo21316)]
作者简介：庾韦花(1978一)，女 。广西永福人，硕士，助理研究员，主要从事作物育种工作。
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5期 庾韦 花等 ：外源 DNA导人糯玉米 自交系 D 代变异植株过氧化物酶同工酶分析 5l1
皮甘蔗总 DNA 和孟加 拉超甜 玉米 自交系总 DNA
4j-yJq导^糯玉米 自交 系 12-9—10后 ，在 代获得 果
穗叶片呈对 生型变异植 株 ． 和弯曲生 长及
叶片呈撕裂 状的变异植 株 D ) 。但在玉 米
变异后代的筛选 和鉴 定 上，以过氧化 物酶同工酶 为
生此指标进行研究 尚不多见 本文 对 D 代 变异 植
株的过氧化物酶同工酶进行分析，旨在探讨变异植
株与供受体之 间的 关系，为缦种法在 远缘杂交上 的
应用提供理论依据
1 材料与方法
1．1材 料
受体糯玉米自交系12-9一l0，由广西大学农学院
吴子恺教授提供。供体包括：(1)广西陆川县推广的
黑皮甘蔗；(2)盂加拉超甜玉米 自交系(超甜 2O号推
广种父本)
1．2方法
l_2．1取材方法 变异植株 D 与供受『奉在
2004年 5月 12日取材，变异植株 D 、．i H与供
受体在2004年 5月 1 8日取材，除黑皮甘蔗外，取材
时问均为孕穗期，上午 9：00～l0：00。取材部位
均为果穗上一功能吁的中上部，取材之后立即进行
同工酶的提取，提取液在一2CC冰箱中保存备用。
1．2．2同I酶的提取方法 称取叶片 1 g．并加 3
n1I 的 Tris—HC1(pH一8．0)缓 冲液及少许石英砂 在
冰浴中研磨成匀浆后，4 000 r／min离心 l5 min+取
上清液置 20℃冰箱中保存，电泳时取其置于冰上缓
慢溶解后即用 。
1．2．3电泳方法 采用垂直聚丙烯酰胺凝胶电泳
法，电投缓冲液为 pH一8．3的 Tris—Gly缓冲液，浓
缩胶浓度为 3 ，pI-I=6．7，分离胶浓度为 7．2 ，
PH一8．9，利用稳压直流电源，分离胶 200 V(30
mA)，浓缩胶l 00 V，4℃下进行电泳．以溴酚蓝为指
示剂，点样用量相同+均为 60 L，重复 2次。
J．2．4过 氧化斯酶 同I酶的染 色方 法 过氧化物 酶
同工酶 采用 醋 酸 联 苯 胺 ，37℃进 行 ，大约 3～ 5
I~in显邑，显色后 立即用 清水 洗净染 色料 ， 获得 最
佳染色效果 染色完毕后的胶置于 70 的醋酸液
巾保存 最后对胶进行拍照，Rf值的计算及模式图
的绘制。相对电泳率 Rf值参照 Rubus介绍的计算
方法，即Rf值为酶带迁移距离与溴酚蓝迁移距离的
比值 。
2 结聚与分祆
2．1黑皮甘蔗总 DNA处理后的 代变异植株的过
氧化物酶同工酶酶谱的变化
通过 对黑皮 甘蔗总 DNA处 理后的 D 代 变异
植株过氧化物酶同工酶的测定．其电泳结果见图 l
从图 1可看出，分类学 上不 同属 的供受件间的过氧
化物酶同工酶酶带总数有很大差异，供体黑皮甘蔗
7条，受体襦玉米 4条，酶带位置也呈显出较大差
异，供受体仅在迁移率 Rf 一0．s9有相似酶带．但强
弱不同。在该处植株 D一 一m 的酶带强弱与供体
相同．为中强带．受体为弱带 植株 D。 。 的过
氧化物酶酶带总数与供体相同，其位置也出现一定
的相似性，在迁移率 R 一0．33和 R 一0．40分别
出现一条供体特有而受体没有的酶带，其酶带强弱
与供体相 同，在迁移率 Rf =0．6 L出现一条供受件
都没有 的弱带 说 明了外 源 DNA(或 DNA 片段)
已转移到糯 】2-9—10中，并在过氧化物酶同工酶上
得到了表达。
受体 O0 H H加。-
~eee0to r DD⋯ ‘ m 。
U
迁移军
⋯ ng r a
Rf D 1
Rf 0 2
Rf 0 2
Rf． 0 3
Rf s 0 3
Rf B 0 4
圣体 D。 l0 供体
Reee o D。 ·⋯ |^．：0 0o1or
Rf- 0 59
Rf B 0 61
Rf 9 0 72
Rf 0 0 78
R÷．0 83
十一 模 式 图
The pat1．⋯ n f
pero~i dase i soz~,me
一 强带 中强带 弱带
sttong st r-P middI e st r eak st
酶 谱 图
he zy Dg ram of
pe r0 x da J s口 me
(下同 The ame beI ow
D
图 1植抹 <幅x It3d~)的过氧化物酶同工酶酶谱及模式图
Fig 】 The zymogr￡m and paI ern 【】f t~erxidase
isozyme。f the IJ[ant Da ⋯ 3E。
2．2孟加拉超甜玉米 自交系总 DNA处理后的 I)lJ代
变异植株的过氧化 物酶同工酶酶谱 的变化
经过检测 ，得出一株植 株过氯化物酶 同工酶酶
谱发生变异 ．如图 2 从图 2可看出，受体糯 12 9 l0
[二 ㈠¨ 二二H
[=|[=葛二二二_l_=====U
[二=-[=目二二=二二二二二=二二=U
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Sl2 广 西 植 物 26卷
与供体盂加拉超甜玉米的过氧化物酶同工酶酶 带在
迁移率 Rf ，R 、R 、R 都有相 同 的酶 带 (也称共
性带)，反映了玉米种的遗传保守性、专一性和同源
性．后代植株 ㈣ ．：在迁移率 RL一0．59增加
了一条供受体都没有的弱带，在 Rf 一0．68的酶带
较供受体粗 这说明该植株的过氧化物酶同工 酶发
生变异。
e
i ilia 00
’
2
2
O
m
o． o r
迁移率
M0vi ng rate
Rf． 0 15
Rf， 0 26
Rf 0 34
0 4I
Rf 0 51
科 B 0 59
R 0 68
3．2植株 Uafq 】性状变异
植株 ，# u 过氧化物酶同工酶发生 变异 ，从
陛状表现上观察也发生了变异．果穗 、1-I‘片均为对生
型 ，株高 93 CITt，比受体 l 3()CTI矮 37 cn1。这与l 秋
元等(1994)报道“株高小于 l70 cm 的对生玉米出现
过氧化物酶同工酶变异 ”的结果一致 ，在本研究中法
植株的过氧化物 酶同工 酶的变异是否与玉术的对生
性状表 现有 关还 需进一 步研究 。
3．3不同供体 DNA处理后的 代变异 植株过氧化
物酶同工酶的比较
黑皮甘 蔗 DNA导人糯 1 2 9 1O的 I 代变异植
株一D ㈣ 的过氧化物酶同工酶在迁移率 R^ 、
R 、Rf，、Rfn四条 酶带上 均发 生变 异；盂 加拉超甜
玉米 DNA 导 人 糯 12—9—10 的 I 代 变 异植 妹一
D哺 i 过氧化物酶同工酶在迁移率 Rfr、Rfn
两条酶带上发 生变异 ．可见 在属 问进行 处理 的 D
代变异植 株发生变异 的酶 带敬 多于种问处理=其共
同点是在迁 移率 RR与 RfH都发 生 丁变异 ，这说明
酶带发生变异 的位置 可能 与供受休的品种有关
} 参考文献：
周光宇 1 988 农业分子育种—— 授粉后外源 DNA导^植物
的技术[』]l中国农业科学工作者 21(3)：l一5
图2植株 D，(辐-盂甜 2过氧化物酶同工酶酶谱及模式图
Fig．2 The zymogram and pattern of peroxidase
soa
．
Ym e of mm ant plant Da(⋯ x nI 。∞ 2
3 讨论
3．I同工酶是基因作用的直接表达
D # 过氧化物同工酶酶谱出现供体特有
而受体没有的酶带，这可能由于外源 DNA中的某
一 完整韵过氧化物酶同工酶结构基因整合到受体基
因组中，引起与供体过氧化 物酶同工酶 有相同表达
类型的变化，即产生供体特有而受体没有的酶带。
D。：#¨ l¨ 、I)。 硎 Ⅲ．!都出现供受体都没有的酶
带．此种情况可能是外源 DNA片段调控序列整合
到受体 基因姐 中．打破受体基 因组原有 的过氧化物
酶同工酶的表达类型，出现与受体原过氧化物酶同
工酶不同的酶带．即产生供受体都没有的酶带(刘春
林 等．1 0 04) 至于是哪一种 DNA 功能片段整合到
了受体基嗣组内，还需从分子生物学方面进行深入
探 讨=
Jiang JA(江巨警)．Ma H(麻 浩 Zhou ZM(同惜霖 ． f．
20@1 Generic and hreedi rig eI[ects 0』int roduction of exoge—
r∞us DNA into soybeans b imprl⋯ d d- 1aking metliod
(应用改照浸种法将外源 DNA导 ^太豆的遗传育种效应研
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LIu CL(刘春林 )．Hong YH<洪亚辉 )．ZhaoY(赵 燕)，et n
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D2 generalion toha~co t ra~sformed ith foreign I) A by
seed msion method(应用提种诸导^外源 DNA转化烤
娴变异椿 D2代的氦基酸含量 丹所 )：J]．A lI＆ Te c^ (农
业与技术)．23(3)：69 72．
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