全 文 ：广 西 植 物 Guihaia 24(3)：270— 274 2004年 5月
去除转基因植物标记基因的研究进展
马三梅，王永飞
(暨南大学生物工程学系．广东广州 510632)
摘 要：得到转基因植物以后，标记基因就失去了筛选的作用。但它的存在引起公众对转基因植物的安全性
以及环境效应的担心，所以在 目的基因转入后，要去除标记基因。该文主要就利用共转化、转座子、同源重组、
位点特异重组酶等去除标记基因的方法进行了总结，并对各种方法的优缺点进行了比较，对该技术未来的发
展趋势也进行了展望。
关键词：转基因植物；标记基因；位点特异重组
中图分类号：Q785 文献标识码：A 文章编号：100O一3142(2004)O3一O27O—O5
The excision of marker gene in transgenic plants
MA San—mei．WANG Yong-fei
(Department o，B{oeng nee“ng．Jinan Uhiversity．Guangzhou 510632，China)
Abstract：Several methods were used to excise marker gene in transformed plants，for example co-transforma-
tion，transposable elements，homologous recombination and site-specific recombination．W e place particular
emphasis on a most recent development of inducible site-specific recombinase systems for efficient marker gene
deletion strategies．The relative advantages or disadvantages of the excising procedures presented here are dis-
cussed．Their development is prospected．
Key words：transgenic plant；marker gene；site-specific recombination
随着植物细胞全能性的发现和转基因技术的发
展，人类已经利用基因工程改变植物的性状，并且取
得了巨大的进展。但由于转化效率不高，在转化过
程中一般使用标记基因来鉴别转化细胞、组织和植
株。标记基因有的提供了对抗生素或除草剂的抗
性，有的使转化细胞具有代谢的优越性。在加人选
择试剂后，非转化细胞死亡 ，转化细胞存活。为避免
筛选标记基因例如抗生素基因等转移到环境，而造
成对生态环境的破坏 ，减少培育转基因植物的时间，
加快转基因产品推广的速度，省去对转基因植物的
安全性评价，降低大众对转基因植物的疑虑，因此，
在获得转基因植株之后，有必要将筛选标记基因去
除(Peter等，2002；舒庆尧等，2003)。本文主要就去
除标记基因的进展进行讨论，对该技术未来的发展
趋势进行展望。
1 去除标记基因的方法
目前，去除转基因植物中标记基因主要采用共
转化、转座子、同源重组、位点特异重组酶系统等方
法。
1．1共转化去除标记基因
共转化的原理是将 目的基因和标记基因单独组
装到两个质粒上 ，或一个质粒的两个不同 T—DNA
区段上，然后同时转化。由于二者可同时插入同一
细胞的不同染色体上，从而完成对转化细胞的筛选；
收稿日期：2003—07-25 修订日期：2003-09-21
基金项目：暨南大学引进人才启动基金(692016)
作者简介：马三梅(1971-)，女，河南平顶山人，博士，副教授，主要从事植物生殖生物学的研究。E-mail：tmsm(~jnu．edu．ca
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3期 马三梅等：去除转基因植物标记基因的研究进展 271
通过杂交使目的基因和标记基因在子代植株分离开
来，从而获得仅带目的基因的转基因植株。
Mcknight等(1987)用两个 T-DNA载体共转
化烟草，一个含有基因nptⅡ，另一个含 nos(Nopal—
ine synthase，胭脂碱合成酶)基因，在获得的 11株
nptⅡ阳性植株中，有 3株也整合了nO$基因。并且
在3株共整合植株的所有后代中，两个外源基因都
发生了分离，从而可以筛选出无标记基因的植株。
Komari等(1996)在研究共转化时，发现两个质粒在
转化前经体外同源重组产生了一个含两套 T—DNA
的双元载体，其中一套含有选择标记基因，另一套含
目的基因，该双元载体转化的植株，其后代的选择标
记基因与目的基因约有40 能独立分离。在Kom—
ari等(1996)的基础上，Lu等(2001)设计了双元载
体进行共转化。该载体含有一个 T—DNA的左边
界、目的基因和两个 T—DNA的右边界，标记基因在
两个 T—DNA右边界之间。用含该 T—DNA的质粒
转化水稻，获得转化子后，经过遗传分离，可以把两
种 T—DNA插入方式分开，一种含标记基因和目的
基因，另一种只含目的基因。其中 36 ～64 的转
基因后代标记基因与目的基因发生了分离。由于这
种质粒比含两个独立 T—DNA序列的质粒小，容易
操作，所以转化频率相对较高。Ebinuma和 Kom—
amine(2001a)利用分别在 T—DNA控制下的标记基
因和目的基因进行共转化，从转基因品系的后代中
筛选出不带标记基因的植株。
Depicker等(1985)发现用农杆菌共转化的效率
与单独转化的频率相同。DeBlock和 Debbrouwer
(1991)及 Mc Knight等(1987)利用共转化也获得
了较高的共转化效率，并且分别有 78 和 i00 的
共转化植株共整合在非连锁位点上。尽管他们使用
的转化载体、农杆菌株系、转化程序因作物不同而不
同，但说明共转化可用于产生不含有选择标记基因
的转基因植物。经过对各个转化参数的优化，在某
些植物中，共转化法中两个基因同时整合到受体植
物的效率已能达到用单一质粒转化方法的效率
(Daley等，1998；De Block和 Debbrouwer，1991；
Depicker和 Debbrouwer，1985)。不过，选择标记基
因和目的基因的遗传分离必须经过有性世代才能实
现，这不仅会增加育种时间，而且无法应用于无性繁
殖的植物品种。
1．2利用转座子去除标记基因
转座子是指一段特定的 DNA序列，它可以在
染色体组内移动，从一个位点切除，插人到一个新的
位点。它一般由特定的蛋白质来识别某一种 DNA
序列，识别位点之间的 DNA片段被插入到另外的
位点上去。把标记基因或 目的基因和转座子相连，
在转座子和标记基因或 目的基因一起移动的过程
中，标记基因和目的基因分开，子代植株通过遗传分
离，获得仅带目的基因的转基因植株。基于以上原
理，转座子系统可被开发用于转化系统来培育安全
的、无标记基因的转基因植株。例如玉米中的 Ds
转座子，可以把特定重复 DNA之间的基因切除，在
Ae转座酶的作用下将其转移到另一位置。将标记
基因或者目的基因和 Ds相连，转入植物中，随后往
初级转化子中导人 Ac转座酶基因，从而使目的基
因和标记基因分开；通过杂交，从后代中筛选出仅有
目的基因的植株。Ebinuma等(1997)利用这种途
径，把 ipt基因置于 Ds之间，利用重新整合到基因
组中的失败，切除标记基因，已得到了高转化频率且
是单拷贝的转基因烟草和葡萄。Goldsbrough等
(1993)以npt 1I为选择标记基因，以gus作报告基
因转化西红柿。利用上述方法在转基因植株后代中
发现无标记基因的转基因植株。
1．3利用同源重组去除标记基因
同源重组依赖于大范围的 DNA同源序列的联
会。负责DNA配对和重组的蛋白质无碱基序列的
特异性，只要两条 DNA序列相同或接近，重组就可
以在此序列中的任何一点发生。重组以后，DNA同
源序列间的 DNA片段可以被切除。把标记基因放
在两个 DNA同源序列之间，发生同源重组后，标记
基因可以被切除，这样的细胞经过再生，可得到无标
记基因的植株。Fischer等(1996)利用同源重组的
原理，在标记基因 aadA两端加上正向重复序列
(Direct repeats sequence)，在没有选择压的生长条
件下，经过几代的细胞分裂后可以将 aadA基因从
叶绿体中除去。在叶绿体转化烟草中，把标记基因
和重复序列相连，经过培养，标记基因也被切除
(Maliga，2002；Lamthan和 Day，2000)。
1．4位点特异重组酶系统去除标记基因
位点特异重组在原核生物中最为典型。这种重
组依赖于小范围同源序列的联会，重组时发生精确
的切割、连接反应。目前发现 4个位点特异重组系
统 ：Cre／Lox，FLP／FRT，R／RS和 Gin／gix(林忠平
等，2000)。在重组酶的介导下，在两个识别位点之
间的 DNA片段可以被切除，形成的切除环不能自
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主复制，在体内迅速丢失，没有重新插入的现象
(Zuo等，2001)。把标记基因放在两个识别位点之
间，在重组酶的作用下 ，标记基因可以被切除。所以
在真核生物中利用 Cre(Gleave等，1999；Hoff等，
2001)、FLP(Hohn等，2001)或 R(Sugita等，2000；
Ebinuma和 Komamine，2001)重组酶可以将不需要
的基因序列切除，从而把标记基因和目的基因分开。
Onouchi等(1995)用含 R重组酶基因的转化植
株与含标记基因位于 RS位点问的植株进行有性杂
交，获得了无标记基因而只含报告基因的拟南芥转
基因植株。Dale和 Ow(1991)利用该系统，先将一
种筛选标记插入 Lox位点之间，再与 目的基因相
连，转入植物细胞。在第二轮转化时，将另一种筛选
标记与 Cre基 因连接后再转入已转化的细胞，在
Cre重组酶的作用下，第一种筛选标记可被删除。
挑取已失去第一筛选标记的植株，待开花结籽后，从
后代分离群体中挑选没有第二种筛选标记的植株，
即为已完全剔除了筛选标记基 因的转基因植株。
Hohn等(2001)认为可直接将 Cre重组酶导人植物
细胞就可以使其作用于靶位点，从而达到剔除标记
基因的目的。
转化植株中的标记基因，如果两端有 lox位点，
与表达 Cre基因的转基因植物杂交，也可在后代中
删除标记基因。近期已经在植物中利用农杆菌介导
的转化或者受粉导人重组酶基因，诱导切除标记基
因。例如 Corneile等(2001)利用 Cr~lox系统把标
记基因从叶绿体的基因组中去除。具体方法是在最
初设计转化载体时，在标记基因的两端放人 Lox序
列，并在得到转化植株后，用转化植株作母本和含有
Cre基因的细胞核转基因植物的花粉进行杂交，即
可把标记基因去除，而细胞核的 Cre基因，可望在下
一 代中分离而去除。Hajdukiewicz等(2001)采用同
样的策略也将标记基因从叶绿体基因组中去除。
没有整合到基因组上的 Cre的瞬时表达也可以
将 lox位点之间的标记基因切除(Gleave等，1999；
Lyznik等，1996；Srivastava和 Ow，2001)。把植物
暂时用含重组酶基因的农杆菌处理，可以避免重组
酶和宿主基因组长时间互作而产生其它不 良后果，
使切除机制快速作用 ，快速失活，省去重新导人重组
酶基因所用的时间。但这种方法的缺点是效率太
低，而且已经被 Cre介导的基因切除，又被 Cre转化
的频率很高。在烟草中有 2／3的转基因植株被重新
转化(Gleave等，1999)。另外把标记基因、重组酶
基因、目的基因和重组位点相连，可以在转入外源基
因的同时切除标记基因。
低水平表达的重组酶可以降低细胞的再生能
力，所以把重组酶基因和它的识别位点连在一起，也
使重组酶的浓度一旦达到切割所须的浓度，就直接
切除重组酶基因，避免了过多重组酶的产生。但 目
前在几种植物中发现重组酶表达的自我消退现象，
细胞的再生能力受影响不大(Zuo等，2001；Sugita
等，2000；Ebinuma和 Komamine，2001)。
利用位点特异重组酶切除标记基因时，往往在
重组位点留下一个识别序列，经过几次去除标记基
因后，基因组中就分布着多拷贝的识别序列。由于
多拷贝的同一序列可使基因沉默，从而使 目的基因
不表达。按照顺序使用不同的重组酶或者利用特殊
设计的重组酶，使重组酶仅能识别作物基因组中的
一 个位点(Santoro和 Schuhz，2002)，可以避免相同
重组位点的残留，从而使残存的识别序列不会发生
分子内、分子间的重组，导致染色体缺失、倒位、易位
(Buchholz和 Stewart，2001；Sclimenti等，2001)。
另外在切除标记基因后 ，让启动子的 TATA box和
识别序列、目的基因直接相连，可避免基因沉默，促
进目的基因的表达。这是由于转录一般在 TATA
box下游大约 3O核苷酸处开始，在重组酶识别位点
末端几个核苷酸的转录不会使基 因沉默(Zuo等，
2001)。
利用位点特异重组酶去除转基因植物的标记基
因，在区分去除基因的体细胞和种系细胞时必须十
分小心。因为仅一部分细胞失去了标记基因，在可
再生的细胞没有去除的话 ，发生基因去除的转基因
植株的鉴别可能有错误。大多数研究表明 CLX系
统可以确保切除标记基因的转基因品系向后代传
递，在作物中应用潜力最大；而 FLP—FRT和 R—RS
系统诱导产生的基因去除向后代传递的能力有限或
者根本不传递(Zuo等，2001)。
1．5化学诱导启动子控制位点特异重组酶的表达
为加快去除标记基因的进程，使位点特异重组
酶只在进行基因切割时表达，重组酶基因还可与标
记基因连接到同一载体上，构建成双元载体导人植
物体中，通过化学诱导表达的启动子驱动重组酶基
因，在化学诱导剂的作用下，重组酶基因表达，标记
基因因其两边的同源序列重组而被剔除，这就是所
谓的 MAT载体系统。在缺少诱导剂时，重组酶不
表达；在发现所有转化子后 ，加入诱导剂，使 Cre在
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3期 马三梅等：去除转基因植物标记基因的研究进展 273
特定的时间内去除标记基因，从而减少重组酶对 自
身DNA的破坏(Zuo等，2001)。
Sugita利用 GST-MAT载体系统，将重组酶 R
与化学诱导表达的启动子 GST-Ⅱ-27(glutathione-
S-transferase，谷胱甘肽转移酶)融合，以ipt为选择
标记基因转化烟草，在转化当代就获得了单拷贝的
无选择标记基因的转化植株。在拟南芬中，把 Cre
放在 p-雌二醇诱导的XVE启动子控制下，在 lox位
点之间是重组酶基因和生物素抗性基因，Cre的表
达达到切割 DNA所需的浓度，含有 XVE启动子、
Cre和卡那霉素抗性的基因就被切去，从而激活下
游G10—90启动子控制的绿色荧光蛋白基因的表达
(Zuo等，2001)。利用该系统，在 19个初级转化子
的标记基因被切除。玉米 GST-I-27启动子可被
除草剂 Safener诱导，利用 GST-I-27启动子控制
R和ipt的表达，从而可以切除 R和ipt，得到无标
记基因植株。已经利用这种方法得到无标记基因的
转基因水稻、白杨、金鱼草(Ebinuma和 Komamine，
2001)。MAT载体系统免去了有性杂交或二次转
化的过程，在转化的当代就能获得无标记基因的转
化植株 因此，MAT载体系统特别适用于树木等
生育期长或以营养器官繁殖植物的遗传转化。
2 各种方法的比较
共转化方法所产生的共转化后代中只有 25
标记基因和外源基因被分离，因此需要从大量的转
基因植株中去筛选。与传统的转基因方法相比，它
需要4倍的工作量才能获得无标记基因的转基因植
株。另外，这一方法要求植物能进行有性生殖，不适
合于马铃薯、甘蔗等元性繁殖植物的转化。利用基
因枪进行共转化时，共转化频率很高，但获得的共转
化植株中目的基因和标记基因往往表现为紧密连
锁，从而较难获得分离株系。利用两个基因进行共
转化时，虽然在后代中可分离出不带标记基因的植
株，但由于发生共转化的频率很低、两个基因连锁的
程度很难控制，其利用价值受到影响利用同源重组
去除标记基因，要求两个 DNA分子的序列同源，而
且同源区越长越容易去除，同源区太短，越难去除。
但同源区太长，增加了导人基因的难度；此外这个方
法并不总有效；因为错误重组的发生，目的基因会发
生缺失(Zubko等，2000)。
利用转座子、位点特异重组酶系统等方法去除
转基因植物中标记基因，初级转化子一般需要通过
杂交或再次转化来导人Ac转座酶、Cre重组酶等基
因，然后对杂交后代进行选择，从而筛选出不含标记
基因的植株。杂交对于营养繁殖的作物或者生活周
期很长的作物来说，是很困难的或者所需时间太长；
反复进行组织培养，体细胞突变的频率提高。
从生产实践和研究看，要求切除标记基因的方
法必须快速、有效、劳动量小，而且基因去除后必须
向后代遗传。但从 目前的研究看，上述方法都有效，
而且向后代遗传，但均需要很长的时间，劳动量大。
因此需要进行深人的研究，加快去除标记基因的速
度，减少去除标记基因的工作量。
3 展望
虽然基因组学的发展为快速、有效的去除标记
基因提供了理论基础。但去除标记基因的方法仍然
需要深人的研究。例如精子细胞长期受 Cre作用，
可以引起染 色体重 排 (Schmidt等，2000)。Ow
(2002)也发现含有 Cre的植物，有皱叶、育性下降的
现象，但这并不是遗传物质改变引起的。目前我们
对 Cre是否仅在细胞核中引起植物细胞染色体畸变
仍不了解。所以有必要继续对去除标记基因进行深
人的研究，或者在转化时，不使用标记基因，来克服
去除标记基因的缺陷。一旦能够有效准确的去除标
记基因，生物技术就具有更大作用。例如通过化学
诱导的定位切除基因的方法可以使元组织特异启动
子的基因在特定的器官中表达(Keenan和 Stem-
mar，2002)，使抗性基因只在非食用器官中表达，而
在人类和动物食用器官中不表达。总之，在后基因
组时代作物改良的限制因素不是发现基因的种类不
够，而是转化方法的效率不高。一旦转化效率提高，
或者使用无标记基因的转化技术，肯定可以获得更
多的转基因植物，加快公众对转基因植物的接受步
伐。
参考文献：
林忠平，胡鸢雷．李 雷，等，2000．定位重组系统在外来
基因活性调控中的作用 [A]，见：林忠平，走向21世纪的
植物分子生物学[C]，北京：科学出版社，66—71，
舒庆尧，董志诚，2003．转基因水稻[A]，见：囝新甫，转基
因植物[C]，北京：科学出版社，214—238，
Buchholz F，Stewart AF， 2001，AIteration of Ere recombi-
nase site specificity by substrate-linked protein evolution
维普资讯 http://www.cqvip.com
274 广 西 植 物 24卷
[J]．Nat Biotechnol，19：1 o47—1 052． ated transcriptional induction system in transgenic plants
Corneille S。Lutz K，Svab Z，et a1．2001．Efficient elimina-
tion of selectable marker genes from the plastid genome by
the Cr~lox site-specific recombination system[J]．Plant
J，27：171—178．
Dale EC。0w DW ．1991．Gene transfer with subsequent re—
moval of the selection gene from the host genomeEJ]．Pro
ff Acad Sci USA 。88：10 558— 10 562．
Daley M 。Knauf VC，Summerfelt KR，et a1． 1998． Co-
transformation with one Agrobacterium tumefaciens strain
containing two binary plasmids as a method for producing
marker-free transgenic plants[J]．Plant C ff Report。17：
489——496．
De Block M 。Debbrouwer D．1991．Two T—DNA co-trans-
formed into Brassica napus by a double Agrobacterium in—
fection are mainly integrated at the same locusEJ]．Theor
Appl Genet，82：257— 163．
De picker A，Herman L，Jacobs A，et a1．1985．Frequencies
of simultaneous transformation with different T—DNA and
their relevance to the Agrobacterium plant cel interaction
[J]．MolGen Genet，201：477—484．
Ebinuma H ，Sugita K，Matsunaga E，et a1．1997．Selection
of marker-free transgenic plants using isopentenyl transfer—
ase gene[J]．ProcNatiAcad Sci USA，94：2 ll7—2 121．
Ebinuma H，Komamine A． 200la． MAT (Muhi-Auto-
Transformation) vector system， the oncogenes of
Agrobacterium as positive markers for regeneration and se—
lection of mark-free transgenic plants[J]．In Vitro ff
Dev Biol Plant，37：103一 ll3．
Ebinuma H。Komamine A．200 1 b． Systems for the removal
of a selection marker and their combination with a po sitive
marker[J]．Plant Cell Report，20：383—392．
Fischer N，Stampacchia O，Kevin R。et a1．1996．Selectable
marker recycling in the chloroplast[J]．Mol Gen Genet，
251：373——380．
Gleave AP，Mitra DS，Mudge SR，et a1． 1999．Selectable
marker-free transgenic plants without sexual crossing：
transient expression of cre recombinase and use of a condi-
tional lethal dominant gene[J]．Plant Mol Biol。40：223—
235．
Goldsbrough AP，Lastrella CN。YoderJI．1993．Transposi·
tion mediated re-po sitioning and subsequent elimination of
marker genes from transgenic tomato[J]．Biotechnology，
ll：1 286—1 292．
Hajdukiewicz PTJ，Gilertson L，Staub JM．2001．Multiple
pathways for Cre／lox-mediated recombination in plastids
[J]．PlantJ，27：161—170．
Hof T。Schnorr KM。Mundy J．2001．A recombinase-medi一
[J]．PlantMol Biol，45：41-49．
Hohn B。Levy AA。Puchta H．2001．Elimination of selection
markers from transgenic plants[J]．Curt Opin Biotechnol，
12(2)：139—143．
Keenan RJ，Stemmer WPC． 2002． Non-transgenic crops
from transgenic plants[J]．Nat Biotechnol，20：215—216．
Komari T，Hiei Y，Saito Y，et a1． 1996．Vectors carrying
two separate T—DNA for co-transformation of higher plants
mediated by Agrobacteruim tumefaciens and segregation of
transformants free from selection markers[J]．Plant J，10
(1)：165—174．
Lamthan S。Day A．2000．Removal of antibiotic resistance
genes from transgenic tobacco plastids[J]．Nat Biotechn一
0f，l8：1 172— 1 176．
Lu HJ。Zhou XR，Gong ZX。et a1．2001．Generation of se—
lectable marker-free transgenic rice using double right-bor—
ders(DRB)binary vectors[J]．Aust J Plant Physiol，28：
241—248．
Lyznik LA，Rao KV，Hodges TK．1996．FLP-mediated re—
combination of FRT sites in the maize genome[J]．Nucleic
AcidsRPs，24：3 784— 3 789．
M aliga P． 2002． Engineering the plastid genome of higher
plants[J]．Curr Opin Biotechnol，5：164—172．
Me Knight TK，Lillis MT。Simpson RB． 1987．Segregated
of genes transferred to one plant cel from two separate
Agrobacterium strains[J]．Plant Mol Bio，8：439-445．
Onouchi H ，Nishihama R，Kuodo M ，eta1．1995．Visualiza·
tion of site specific recombination catalyzed by a recombi-
nase from Zygosaccharomyces rouxi in Arabidopsis thali—
ana[J]．Mol Gen Genet，247：653—660．
0w DW ．2002．Recombination-directed plant transform ation
for the post—genomic era[J]．Plant Mol Biol，48：183—
200．
Peter DH 。 Nam-Hai Chua． 2002． Excision of selectable
marker genes from transgenic plants[J]．Nat Biotechnol，
20：575—580．
Santoro SW ，Schultz PG．2002．Directed evolution of the site
specificity of Cre recombinase[J]．Pro Natl Acad Sci
USA，99：4 185— 4 190．
Schmidt EE，Taylor DS，Prigge JR，et a1．2000．Illegitimate
Cre-dependent chromosome reaarrangements in trandgenic
mouse spermatids[J]．Proc Natl Acad Sci USA，97：13
702——13 707．
Sclimenti CR。Thayagarajan B。Calos MP．2001．Directed e—
volution of a recombinase for improved genomic integration
at a native human sequence[J]．Nucl Acids Res，29：5 044
(下转第 247页 Continue on page 247)
维普资讯 http://www.cqvip.com
3期 蒋昌顺等：柱花草RAPD反应体系的建立及其8个品种遗传多样性分析 247
O．5O n6o n 70 0．80 0
$imi Iai rty ooeffioient
图 1 八个柱花草品种的聚类树形图
Fig．1 Dendrogram obtained from RAPD data of
eight Stylosanthes varieties by UPGMA
参考文献：
Edye LA，Cameron DF． 1984．Prospects for Stylosanthes
improvement and utilization[A]．In；Stace HM，Edye
LA．The biology and agronomy of Stylosanthes[C]．North
Ryde，NSW ，Australia：Academic Press，571— 587．
Jiang CS(蒋昌顺)．1995．Utilization and studies of Stylosan—
thes in China(我国对柱花草属不同种的研究与利用)FJ]．
TropicalCropsResearch(热带作物研究)，61(3)：64—70．
Liang YC(梁英彩)，Lai ZQ(赖志强)，Teng SH(腾少花)，et
a1．1998．Studies on breeding of stylo 907(907柱花草的
选育研究)[J]．Pratacultural Science(草业科学)，15(2)：
27— 29．
Liu CJ，Musial JM．1997．Stylosanthes sp．Aff_S．scabra：a
putative diploid progenitor of Stylosanthes scabra(Fabace-
ae)[J]．Plant Syst Evol，208：99—105．
Rohlf HJ．1994．NTSYS-pc：Numerical taxonomy and multi-
variate analysis system[M]．New York：Applied Biostatis-
tica Inc．．1994．
W eeks DP．Beerman N，Grifrith 0M．1986．A smal-scale 5-
h procedure for isolating multiple samples of CsCI-purified
DNA：applications to isolations from mammalian，insect，
higher plant，algal，yeast，and bacterial sources[J]．Anal
Biochem，152：376——385．
Williams JGK，Kubelik AR，Livak J，eta1．1990．DNA pol-
ymorphisms amplified by arbitrary primers age useful as
genetic markers[J]．NucleicAcidRes，18：6 531—6 535．
Zou DM(邹冬梅)，Jiang CS(蒋昌顺)．2002．The Present
Status and Prospect of Tropical Forages Breeding in China
(我国热带牧草育种 的现状 与前景)FJ]．Grassland of
China(中国草地)。24(5)：65—68．
(上接第 274页 Continue from page 274)
一 5 O51．
Srivastava V．Ow DW．2001．Single-copy primary trans—
formants of maize obtained through the co-introduction
of a recombinase-expreesing contrast[J]．Plant Mol
Biol。46：561— 566．
Sugita K。Kasahara T。Matsunaga E。et a1．2000．A
transformation vector for the production of marker-free
transgenic plants containing．a single copy transgene at
high frequency[J]．Plant J。22：461-469．
Zubko E。Scutt C。Meyer P．2000．Intrachromosomal re-
J止J止 J止 “
combination between attP regions as fl tooI to remove
selectable marker genes from tobacco transgenes[J]．
Nat Biotechno1．18：442— 445．
Zuo J，Chua NH．2000．Chemical-inducible systems for
regulated expresion of plant genes[J]．Curr Opin Bio-
￡echnol。ll：146— 151．
Zuo J。Niu QW 。Moiler SG， a1．2001．Chemical-regu-
lated。site-specific DNA excision in transgenic plants
D]．Nat Biotechnol。19：157—161．
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