全 文 ：广 西 植 物 Guihaia 26(1)：97一 100 2006年 1月
黄山药愈伤组织的诱导与分化
马 林，杨国涛，李 军
(西南科技大学 生命科学与工程学院，四川 绵阳 621010)
摘 要；以黄山药 的叶片、茎段和叶柄作外植体，以 MS为基本培养基 ，试验 了不同激素组合对愈伤组织诱导
的影响，采用正交试验法研究 了愈伤组织的分化效果 。结果表明，以 MS+2，4一D l～2 mg／L+6-BA 2 mg／L
培养基对叶片的愈伤组织诱导效果最好 ，接种 l2 d后初见愈伤组织 ，2O d后可形成大量的愈伤组织，而茎段
和叶柄的诱导效果较差。分化试验结果表明，生根率最高可达 85．3 ，而出芽率最高仅达 29．6 。
关键词：黄山药 ；薯蓣；愈伤组织 ；诱导；分化
中图分类号 ：Q945．5 文献标识码 ：A 文章编号 ：1000—3l42(2006)0卜0097—04
Induction and differentiati0n of callus
in Dioscorea panthaica
MA Lin，YANG GUO—tao，LI Jun
(School of Life Science and Engineering，Soutll~x，est University of Science& Technology，Mianyang 621010，China)
Abstract：The leaf，stem segment and leaf stalk of the Dioscorea panthaica were used as explants to induce cal—
lus in different culture media．The results suggested that the better medium for inducing leave callus was M S
+2，4-D l～2 mg／L+BA 2 mg／I ，the callus formation was initially found after inoculating l2 days and there
were much more in 20th day．They could keep vigorous growth constantly in subculture．The calus induction
in stem segment and leaf stalk were inferior to that in leaf．In differentiation experiments，the highest rooting
rate could reach 85．3 ，but only 29．6 to bud production．
Key words：Dioscorea panthaica；Dioscorea；calus；induction；differentiation
黄山药 (Dioscorea panthaica Prain et Burkil1)，
属薯蓣科薯蓣属 ，生长于海拔 1 650～3 100 m 的灌
丛 、林缘、松栎林或杂木林 内，主要分布在云南 、贵
州 、四川I、湖 南、湖 北 等 地。根 茎 含 薯 蓣 皂 苷 元
1．7％～2．3％，为合成 甾体激 素类药物的原料之一
(中国科学院昆明植物研究所 ，1983)。
随着 医药工业对皂素的大量需求 ，黄山药的需
求量 日渐增 长，但作为种源的野生黄山药十分有限，
利用组织和细胞培养技术快速繁殖优质种苗和生产
黄山药有效成分薯蓣皂苷元是一个有益的尝试。
有关薯蓣属植物的组织和细胞培养 已有一定的
报道，如孟玲等(2000)、晏婴才等(2002)对盾叶薯蓣
组织培养技术和条件进行 了研究 ，何惠英等 (2000)
进行了菊叶薯蓣微 繁殖研究 ，张宗勤等(1998)对又
蕊薯蓣的微繁殖及微型薯蓣的离体诱导作了报道，
李明军等(2000)研究了不同因子对山药愈伤组织诱
导的影响，国外的研究报道主要集 中于三角 叶薯蓣
的细胞培养方 面(Drapeau，1986；Robertson，1989；
Kandarakov，2000)。黄 山 药 除 了 马林 等 (2003，
2004)报道了芽诱导快速繁殖的结果外，尚未见其它
研究报道。本文报道黄山药愈伤组织诱导条件、继代
培养及诱导分化方面的研究结果，为黄山药的快繁育
收稿日期 ：2004—08—1 6 修回 日期：2005—08—1 9
基金项目：四川省教育厅重点项 目(2oo3A1 22)；西南科技大学引进人才科研启动齄金(ZK033079)~Suppo九ed by Key Program of
Sichuan Provincial Education Department(2OO3A122)；Scientific Research Fund for Introducing the Talented Person 0f Southwest
University of Science and Technology(ZK033079)]。
作者简介：~ k(1964一)，男，四川绵竹人，理学硕： ，副教授，主要从事植物组织和细胞培养工作
。
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苗和进一步进行细胞培养提供一定的技术基础。
1 枕料 与方法
1．1材 料
黄 山药野生材料 由四川 省甘孜州农业学校提
供 ，采 自二郎山林场。
1．2外植体灭菌处理
将黄山药的枝条剪成 l0 cm 长 的小段，洗衣粉
溶液浸泡约 10 rain左右，在流水下冲洗数小时。将
叶片与茎段 、叶柄分开 ，用 0．1 的 HgC1 溶液浸泡
消毒，叶片处理 6 rain，茎段和叶柄处理 8 min，无菌
水冲洗 5～6次 。茎段和叶柄切成 0．5～0．8 cm 的
切段 ，叶片切为 0．5 Cm×0． cm 左右的小方块，无
菌操作下接种到培养基上。
1．3培养基及培养条件
以 MS为基本培养基 ，附加不同浓度 的外源激
素(6-BA、NAA、2，4一D和 KT)，加入 0． 8 琼脂和
3％的蔗糖，调 pH值为 5．8～6．0。将培养基分装
到 50 mL三角瓶 中，20 mL／瓶，在 l2l℃下高温灭
菌 20 rain。
培养温度 2 ±2℃，光照强度 l()(]0～l 500 lx，
每天光照时间 l0 h。
1．4愈伤组织继代培养
将诱导出的愈伤组织分为小块，接种于诱导愈
伤组织效果较好的培养基 中，观察愈伤组织继代培
养的效果 。根据第一次继代培养的结果 ，以后每 30
d继代一次，不同颜色的愈伤组织分别接种。
表 1 愈伤组织诱导分化正交试验设计
Table 1 Orthogonal experiment design of
differentiaLi0n 0f callus
表 2 不同激素组合对外植体愈伤组织诱导的影响
Table 2 Effects。f horm。ne c。mbinati。ns。n inducti。n。f ca11us in differenL expIants
1．5愈伤 组 织诱导 分化
设计 4因素 3水平 的 正交 试验，研究 6-BA
、
NAA、蔗糖和 pH值的不同组合对愈伤组织诱导分
化的影响(试验设计见表 1)。将继代 3次以上生长
一 致的愈伤组织接种到不同的分化培养基 ，接种后
每隔 5 d统计一次分化率 ，对 30 d后 的试验结果作
极差分析。
2 结果与分析
2·1不同激素组合对外植体愈伤组织诱导的影响
设 BA、2，4-I)和 KT不同浓度组合共 8个配方
处理(编号 1～8)，分别接人叶片、茎段和叶柄
，培养
30 d后 ，愈伤组织的诱导结果见表 2。
由表 2可见 ，培养基 不同浓度激素组合对 3种
外植体都有诱导反应 ，总的看来 以叶片的诱导效果
较好，叶柄和茎段仅在个别培养基的诱导效果较好
。
在叶片以 3号和 4号培养基的诱导效果最好 ，诱导
率达到 90％以上 ，l、2和 7号培养基的诱导效果也
较好 ，均达到 50 以上 ；茎段仅在 2号培养基的诱
导效果较好 ，诱导率达到 60 ；叶柄在 4号培养基
的诱导率最高，为4 ．8％，其余均在35／o。／以下；加入
KT的培养基除叶片在 7号培养基有较高的诱导率
外 ，其余的培养基诱导效果均较低 。
叶片接人培养基 12 d后初见愈伤组织，2O d后
形成大量的愈伤组织，愈伤组织在叶片边缘呈黄绿
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l期 马 林等 ：黄山药愈伤组织的诱导与分化 99
色，叶面长出的愈伤组织呈白色、疏松、长势旺盛。
但加 KT的培养基在接种 l5 d后才在叶片边缘初
见少量黄色愈伤组 织。接种 2O d后 ，有少量叶片出
现褐化现象，以后逐渐死亡。
叶柄和茎段的愈伤组织诱导速度较慢 ，接种 7 d
后始见有端部膨大现象 ，l5 d后才见从膨大部分的
边缘出现颗粒状愈伤组织 ，愈伤组 织呈黄绿色。培
养 3O d后 ，一部分膨大体仍然保持绿色但没有愈伤
组织出现。
2．2愈伤组织继代培养
3、4号培养基诱 导愈伤组 织效果相对较好 ，故
将所有诱导出的愈伤组织分别转接到这两种培养基
中作继代培养。观察发现，转接 l5 d后，从原愈伤
组织表面又长出新的 白色或黄色颗粒状愈伤组织 ，
30 d后愈伤组织生长达到高峰 ，体积可达接种量的
2～3倍 ，此后生长减慢 ，40 d后发现有部分愈伤组
织颜色开始变褐 ，有 的颜色 变为乳 白色呈水浸状。
因此，继代培养以30 d为～个周期。
2．3激素、蔗糖和 pH不同组合对愈伤组织分化的影响
接种 30 d后各处理愈伤 组织分化生根和出芽
的结果见表 3。对诱导生根最好的培养基为 2号和
4号培养基 ，其次为 l号和 3号培养基 ，诱导率均达
到 80 9／6以上，在其余培养基有不 同程度的诱导且存
在较大差异。对诱导出芽最好的培养基为 6号，但
表 3 黄山药愈伤组织分化培养正交实验结果
Table 3 Results of callus differentiation in Dioscorea panthaica
6-BA NAA 蔗糖 (rag／I) (rag／I) Sugar(g／I ) pH 接种数 生根率( ) 出芽率( )
No．of inoculation Rooting rate Budding rate
krl
kr2
kr3
Rr
kbl
kb2
kb3
Rb
0．5
0．5
0．5
1．0
1．0
1．0
2．0
2．0
2．0
82．9
55．4
33．4
49．5
6．7
14．7
11．7
8．0
0．1
0．2
0．5
0．1
O．2
0．5
0．1
0．2
O．5
67．7
63．3
40．7
27．0
10．7
9．3
13．2
3．9
1．2
5．9
10．0
5．9
8．6
29．6
21．9
13．3
0
诱导率仅为 29．6 9／6，其次为 7号培养基，其余培养
基的出芽诱导率均较低甚至没有诱导。总的看来，
在所试验的 9个处理中，生根均 比出芽明显。
从极差分析的结果可见 ，4个 试验 因素 中，对诱
导生根影响程度最大的是 6-BA，其次是 NAA，然后
是 pH 值，蔗糖 的影 响最 小 ，最 佳培 养 基为 6-BA
0．5 mg／L+ NAA 0．1 mg／I + 蔗 糖 30 mg／I
(pH6．6)。与直观分析相 比较 ，这 与 2号和 4号培
养基的结果基本一致 ，可以认为培养基 中 6-BA浓度
为 0．5～1．0 mg／L、NAA浓度为 0．1～0．2 mg／I 、蔗
糖浓度为 30 mg／L、pH值为 6．6时对诱导生根有较
好的效果。同样的处理中，对诱导出芽的影响从大到
小依次为 pH值、蔗糖 、6-BA和 NAA，最佳培养基为
6-BA 1．0 mg／L+NAA 0．5 mg／I +蔗 糖 2O mg／L
(pH6．2)，这与直观分析所得结果完全一致。
2．4正交试验不同处理分化率的动态变化
9个处理的生根率随时间的变化情况见图 l，出
芽率随时问的变化情况见图 2。
由图 l可见 ，生根率较好的 4个处理基本表现
出一致的变化 ，即生根 主要发生在接种后 5～ l5 d
内，接种后 lj～2O d生根率达到最大，以后 的变化
不明显 。其它处理也有相同的变化趋势 。出芽率的
变化除个别处理外 ，基本在接种后 lO～lj d即达最
大，出芽最好的 6号处理在接种后 l0 d即达最大出
芽率 ，以后不再增加 。
3 讨论
采用 6-BA 与 2，4-D 配合诱 导愈伤组织，在 3
种外植体均有一定的诱导效果，其中以n十片的诱导
O O 0 O O O O O O 7 ■ 9 2 3 4 3 4 2 4 2 3 叭 ¨ ¨
T 。 。
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效果最好，但在相同培养基中添加 KT反而降低了
诱导效果 ，这与李明军等 (1997)的报道结果有较大
的差异 ，他们用怀山药无菌试管苗茎段作为外植体 ，
以 MS+KT2+NAA 0．02～2作为培养基 ，可诱导
出大量愈伤组织。分析原因，这可能与激素种类组
合不同以及薯蓣种类不同具有不同的效应有关，但
KT在较低浓度下(0．2 mg／L)出现抑制效应 ，原因
有待进一步研究。
100
毫80
60
8 4o
诗 2O
0
5 1O 15 2O 25 3O
接种后天数 Days after inocu1ation(d
处理 1
处理2
处理3
处理4
处雕5
处理6
处理7
处 里8
处理9
图 1 正交试验不同处理生根率的动态变化
Fig．1 Trends of rooting rate in orthogonal experiment
5 1O 15 2O 25 3O
接种后天数 Days after inoculation(d】
处理1
处理2
处理3
处理4
处理5
处理6
处ItS7
处理8
图 2 正交试验不同处理出芽率的动态变化
Fig．2 Trends of budding rate in orthogonal experiment
晏婴才等(2002)对盾叶薯蓣进行愈伤组织诱
导 ，发现茎段在 MS+6-BA 0．5+2，4一D 2．0中的愈
伤组织诱导效果最好，在接种 lO d后，茎段出现膨
大，15 d后从膨大处长出少量黄色颗粒愈伤组织，
叶片在一周后开始卷曲膨大 ，一月后部分叶片边缘
形成少量 白色或褐色愈伤组织 。易志军(2001)以修
改的 MS培养基试验了不同激素组合对盾叶薯蓣幼
茎、幼叶和茎尖愈伤组织诱导的影响，发现 3种外植
体的诱导率分别为 57．97 、83．14 和 75．89％。
本研究表明，以黄山药茎段作为外植体，虽然也出现
了膨大现象 ，但随后愈伤组织的出现并不多，而以黄
山药的叶片作为外植体，能在 12 d后诱导出白色和
黄绿色颗粒状的愈伤组织，随后出现大量的愈伤组
织 ，这 与他人 的报 道不尽 相 同。薯 蓣科植 物多达
600余种，地理种系相对更多(中国科学院《中国植
物志 编辑委员会 ，1985)，引起上述结果差异可能与
薯蓣种类、生境及材料采取时问等有关 ，也与实验所
采用的培养基条件有关 ，还需作进一步的研究。
有报道表明，薯蓣零余子作为外植体的诱导效
果较好 ，李明军等(2000)发现 以零余子作外植体对
愈伤组织形成和分化都较易诱导 ，而且再生植株移
栽后生长健壮，对环境具有较好的适应性。在黄 山
药组织培养研究 中，也可尝试将零余子作为外植体
之一进行愈伤组织诱导试验。
参考文献 ：
中国科学 院 昆明植 物研 究所．1 983．云南植 物志 (第三 卷)
[M]．北京 ：科学出版社 ，717—71 8．
中国科学院《中国植物志》编辑委员会．1 985．中国植物志 (第
16卷第 1分册)EM]．北京 ：科学出版社 ，54．
Drapeau D．Blanch HW ，W ilke CR． 1 986． Growth kinetics of
Dioscorea deltoidea and C“￡^“r“ ￡^“ roseu5 in batch cul—
ture~J]．Biotecknology and B n r 譬，28(10)：1 555
～ 1 563．
He HY(何 惠 英)，Lan QY(兰 芹 英)，Zhang YJ(张艳军 )．
2000．Tissue culture of Dios~orea camposita(菊叶薯蓣的组
织培养)EJ]．Plant Physiol Co7HInIAn(植物生理学通讯)，36
(4)：337～ 338．
Kandarakov O 、Tite[C，Volkova L，etⅡ￡． 2000． Additional
phosphate stabilises uninterrupted growth of a Dioscorea
deltoidea cel cultureEJ]．Plant Sci．157(2)：209—216．
Li MJ(李明军)，Xue Jp(薛建 平)，Chen MX(陈 明霞)，et a1．
2000． The influence of different factors on calus induction
of Dioscorea opposita(不 同因子对 山药愈伤组 织诱 导的影
响)[J]．Guihaia(广西植物)，20(2)：】56一】6o．
Li MJ(李 明 军)．Yang jw (杨 建 伟 )，Zhang JB(张嘉 宝 )．
1 997． Stem culture and rapid propagation of Dioscorea op—
posita(怀山药的茎段培养 和快速 繁殖)[J]．Plant Physiol
Commun(植物生理学通讯)，33(4)：275—276．
Li MJ(李 明军 )，Zhang JB(张嘉 宝 )，Zhang HB(张海波 )．
2000． Study on the callus induction and plantlet regeneration
from the bulbil of Dios~orecz opposita(怀山药零余子愈伤组
织诱导及植 株再 生 的研究)[J]．Acta Bot Boreal—Occident
Sin(西北植物学报 )，20(5)：772—777．
Ma L(马 林 )，Zhang L(张 玲)，Li wF(李卫 锋)．2003．
Tissue culture and rapid propagation of Dioscorea panthaicn
(黄 山药的组织培养与快 速繁殖)[J]．Plant Physiol Corn—
lnun(植物生理学通讯)，39(5)：476．
Ma L(马 林)，Zhang L(张 玲)，Li WF(李卫锋)．2004．In—
duction of fasciculated buds and rapid propagation of Dioscorea
(下转第 9l页 Continue on page 91)
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龚 宁等：几种荞麦的抗氧化酶活性研究 91
化酶活性差异很大，某些居群的抗氧化酶活性相 当
高 ，如金荞 、贵州云台山大野荞 ，可以作为栽培荞麦
改 良的原始材料或直接开发成食品、保健品及药物。
植物在长期进化 中形成的一套内源抗氧化保护
酶系统极其复杂 ，其中 SOD处于清除活性氧 自由基
的第一道防线，它催化体内超氧 阴离子 自由基(O
歧化，形成氧分子和过氧化氢(余叔文等 ，1999)。而
H O 的过量积累也会对植物产生严重伤害。Asa—
da(1992)指出：H O 的清 除是细胞彻底清 除活性
氧伤害的关键。CAT、POD和 ASP是植 物体内清
除 H O 的重要酶类 。本研究 表明，不同的荞麦在
这些酶活性上表现很不相同，有的 POD活性 高，有
的则是 ASP活性高 。也许不 同的荞麦可通过不同
的途径清除体内 H O 。
野生荞麦中，理县大野荞(M2)的几种抗氧化酶
活性均较低 ，但我们发现它并不易染病虫 ，生长状况
良好 ，这是否表明它具有其它 的清除活性氧的途径?
或者具有很强的应急能力 ，在胁迫条件下能迅速增
强其抗氧化酶活性?这些 问题有待进一步探讨。
参考文献：
西北农业大学植物生理生化教研组．1987．植物 生理实验指
导[M]．西安 ：陕西科学技术出版社 ，36—38．
沈文飚，黄丽琴 ，徐 朗 莱．1997．植 物 抗坏 血 酸过 氧化物 酶
I-J]．生命的化学 ，17(5)：24—26．
余叔文 ，汤 章城．1 999．植 物 生理 与分 子生 物 学[M](第二
版)．北京 ：科学出版社 ，366—389．
张以忠 ，陈庆富．2004．荞麦研究的现状与展望[J]．种子 ，23
(3)：39— 42．
张志良．1990．植物生理学实 验指 导[M]．北京 ：高等 教育 出
版社 ，88—91．
Asada K． 1992． Ascorbate peroxidase a hydrogen peroxide
scavenging enzyme in plant[J]．Physiol Plant，85(2)：235一
(上接第 100页 Continue from page 100)
panthaica Prain et Burkill(黄 山药丛生芽诱导与植株快速繁
殖)[J]．B o￡ f^o og (生物技术)，14(2)：53—54．
Meng L(盂 玲)，Zhu HT(朱宏 涛)．I iu XK(刘锡葵)，et a1．
2000．Micro propagation of Dioscorea zing iberensis(盾叶薯
蓣的快速繁殖)[J]．Nat Product Res Development(天然产
物研究与开发)，12(6)：1 7—21．
Robertson GH ，Doyle LR．Sheng P，et a1．1989．Diosgenin for—
marion by freely suspended and entra1)ped plant cell cultures
of Dioscorea deltoidea[J]． B o￡ f^ 0 0 and Bioengineer—
ing，34(8)：1 l14— 1 125．
ran YC(晏婴才)，Lin HI-I(林 宏辉)．Dai QL(代其林 )，et a1．
Z41．
Cao WH(曹宛 红)．1 994．Ascorbate peroxidase as a key en—
zyme of Hz Oz scavenging system in chloroplasts(作为 叶绿
体 H2()2分解 系统 关 键 酶 的抗 坏血 酸 过 氧化物 酶)[J]．
Plant Physiol Commun(植物 生 理学 通讯 )，30(6)：452—
458．
Chen QF(陈庆富)．2001．Karyotype analysis of fix，e Fagopy一
~unt species natix，e to China(五个 中国荞麦种的核 型分析)
I-J]．Guihaia(广西植物)，21(2)：1O7—11O．
Dalton DA，Hanus FJ，Russell SA，et a1．1987．Purification，
properties，and distribution of aseorbate peroxidase in legume
root nodules[-J]．Plant Physiol，83：789—794．
Hodge M ，Andrew CJ，Johnson DA，et a1．1 996．Antioxidant
compound responses to chilling stress in differentially sensi—
tive inbred maize lines[J]．Physiol Plant，98(4)：685—692．
Iturbe-Ormaetxe I，Escuredo P R，Arrese-Igor C，et a1． 1998．
Oxidative damage in pea plants exposed to water deficit or
paraquat[-J]．Physiol Plant，116：1 73—181．
Kalir A． 1 98 1． Changes in activity of malate dehydmgenase，
catalase，peroidase and superoxide dismutase in leaves of
Halimione pertula eoides I ．Aele exposed to high sodium
chloride concentrations厂J]．A”， Bot，47(1)：78—85．
Ma XJ(马旭俊)，Zhu DH(朱大海 )．2003．Functional roles of
the plant superoxiode dismutase(植 物 超 氧 化 物 歧 化 酶
(S0D)的研究进展 )[J]．Heredities(遗传 )，25(2)：225—
231．
Stewart RG，Bewleg JD． 1 98O． Lipid peroxidtion associated
with accelerated aging of soybean axes[J]．Plant Pkysiol，
65：245— 2,18．
Wang AG(王爱国)，Lou GH(罗广华)，Shao CB(邵从本 )，et
“ ．1 983． A study on the superoxide dismutase of soybean
seeds(大豆种子超氧歧化酶的研究)I-J]．Acta Phytophysiol
Sin(植物生理学报)，9(1)：77—84．
Zhang Z(张 政)，Wang zH (王转花 )，Lin RF(林 汝法)，et
a1． 1 999． Effect of Cu2 t．pbz+ and Cdz+ on antioxidant
enzyme activities in buckwheat seed(Cuz+、pb2 和 CdZ+对
荞麦种子中抗氧化酶活性 的影响)I-J]．Chin J Biochem Mol
Biol(中国生物化学与分子生物学学报)，15(5)：848—851．
2002．Studys on tissue culture and rapid propagation of Di一
05~orea zingiberensis(盾叶薯蓣组 织培养 与快速繁殖研 究)
[-I]．J Sichuan Univ(．N]at Sci Edition)(四川大学学报(自
然科学版))，39(1)：137～14O．
Yi ZJ(易志军)．2001．Callus tissue culture in Dioscor n zin—
giberensis(盾叶薯蓣愈伤组织培养研究)[J]．EconomicFor—
est Resear~hes(经济林研究)，9(3)：21—22．
Zhang ZQ(张宗 勤 )，Sha WQ(撒 文 清 )，Liu JC(刘 建 才 )．
1998．M icropropagation and n1icrotllhcrization of DiOSC0rPn
colletii Hook．F．(叉蕊薯蓣 的微繁殖及微型薯蓣的离体诱
导)I-J]．B o￡ f^ o og (生物技术 )，8(1)：18—2O．
维普资讯 http://www.cqvip.com