全 文 ：广 西 植 物 Guihaia 27(1)：48— 52 2OO7 年 1月
广东省十种卷柏属植物 RAPD初步分析
余 艳1，崔国华2，李忠超1，3 ，韦 霄1，3
(1．中国科学院 华南植物园，广州 510650；2．广州白云山制药股份有限公司中心
药物研究所 ，广州 510515；3．中国科学院 研究生院，北京 100039)
摘 要：采用 RAPD标记对卷柏属 1O种植物进行了分类鉴定 、种 间亲缘关系及遗传多样性 的初步分析。结
果显示：1O个 RAPD引物很好地区分了 1O个种 ，每个种均有 2～12个种单态特征位点 ；UPGMA聚类树与有
关文献表型分类结果不尽一致；卷柏属不同种具有不同的遗传多样性水平。
关键词：卷柏属 ；RAPD；中药鉴定 ；亲缘关系；遗传多样性
中图分类号 ：Q943 文献标识码 ：A 文章编号：1000—3142(2007)01—0048—05
Preliminary studies “RAPD markers fortl ol O t en K J}，
Selaginella species from Guangdong Province
YU YanI，CUI GUO—Hua2，LI Zhong—Chao1，3 ，W EI Xiao1，3
(1．South China Botanical Garden。The Chinese Academy of Sciences．Guangzhou 5 10650，China；2．Pharmaceu-
tical Research Center，Guangzhou Baiyunshan Pharmaceutical Co．，Ltd．，Guangzhou 510515，China；
3．Graduate Schoo1．The Chinese Academy of Sciences，Beijing 100039，China)
Abstract：Random amplified polymorphic DNA (RAPD)method was developed for the specific authentication，
affinity and genetic diversity studies of ten Selaginella species from Guangdong Province．2～ 1 2 mono-specific
loci generated by 1 0 RAPD primers were found for each species respectively．The UPGM A dendrogram based
on the Neis genetic distance was not completely consistent with conclusions from morphology．And different
species demonstrate distinct genetic diversity．
Key words：Selaginella；RAPD；authentication；affinity；genetic diversity
传统的生药鉴定方法均基于生物体遗传表现
型，不仅受到遗传因素的影响，而且与药材生长发育
阶段、环境条件、人类活动如引种驯化、加工炮制等
密切相关，具有主观性强、重复性和稳定性差等缺
点，在鉴定药用植物种子种苗纯度及雌雄、近缘生药
品种、名贵易混生药、道地性药材 、野生与栽培药材、
单方复方制剂成分等方面受到很大限制。分子生药
学(Molecular Pharmacognosy)的发展 为生药 的正
本清源及质量监测提供了新的手段和方法。其中
RAPD标记因其操作简便、DNA用量少、PCR引物
无种属限制、高速高效、费用低等特点，在中药鉴定
研究种下水平的 DNA指纹 图谱构建、真伪鉴定 、亲
缘关系、遗传多样性及药材道地性研究等诸方面都
得到应用(黄璐琦，2000；张太平等，2000)。
卷柏属(Selaginella Beauv．)是一 年或 多年 生
草本蕨类植物，全世界 700多种，我国约 50种，产于
全国各地，其中 20多种为药用植物，具有活血化淤、
清热解毒、消炎抗癌等功效，被用于治疗癌症、肺炎、
风寒咳嗽等症。卷柏属植物由于植株矮小，分类性
状不明显，是分类较为困难 的一个属 ，在制药生产过
程中容易混淆。但由于不同种所含化学成分不同，
疗效也有所不同(何薇等，2000)，因此正确鉴定非常
收稿日期 ：2005-03-14 修回 日期 ：2005-10-20
基金项 目：广东省科技项 目基金 (A301020102)[Supported by Science Commission of Guangdong Province(A301020102)]
作者简介：余艳(1976-)，女，四川眉山人 。硕士。助理工程师，从事植物学研究。
通讯作者(Author for correspondence，E-mail：Izcl20@scbg．ac．on)
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1期 余艳等：广东省十种卷柏属植物 RAPD初步分析 49
重要。虽然在微形态和 HPCE指纹图谱鉴定和分
类方面 已有工作开展 (肖新 月等 ，2001；常崇艳等 ，
1999；王钢力等，2002)，但在分子水平上的研究还未
见报道 。
本文利用 RAPD标 记，对广东省卷柏属 lO种
植物进行分子标记鉴定和分类，为卷柏属药材 DNA
指纹图谱的构建奠定基础 ，并初步探讨其种 间亲缘
关系和遗传多样性。
1 材料与方法
1．1实验材料
在广东省采集 lO种卷柏 植物 ，每种 采集 l2～
l8不等个体，其中 1种由于只采集到营养器官标
本，未能鉴定到种和命名(表 1)。新鲜叶片在野外
用硅胶干燥，保存至 DNA提取，凭证标本保存于中
科院华南植物园标本馆(IBSC)。
1．2总 DNA提取
叶片用液氮研磨，改良CTAB法提取(余艳等，
2003)。
1．3引物筛选和 RAPD-PCR反应
从 i00个生工 S_系列 RAPD引物中筛选 出 lO
条位点清晰、重复性 良好的引物对所有个体进行
PCR扩增 (表 2)。2O微升 PCR反应组分为：lO
mmol／L Tris—HCI，50 mmol／L KCI，2．5 mmol／L
MgCIz，0．1 mmol／L dNTPs，200 nmol／L引物 ，1．5
单位 Taq酶，2O ng总 DNA；对照用双蒸水代替总
DNA。在 PTC-200(MJ research)热循环仪上扩增
程序为：94℃，5 min，1个循环；94℃，l min，35℃，
l min，72℃，2 min，45个循环；最后 72℃延伸 7
表 1 材料情况
Table 1 Species sampling location and voucher
种名 集地点 代码 凭证标本 个体数 种特
No
征单
．
of mono
点数
-
妻
Species L0cation Code Voucher IndividuaIs specific loci ⋯
s
u
D
i
e
p
c
u ly
c
‘
单籽卷柏 Selaginella Dlonospora 电白
粗叶卷柏 S．trachyphylla 阳春
剑叶卷柏 S．xipholepis 电白
二型卷柏 S．flagelli ra 电白
江南卷柏 S．moelendor，J f 电白
黑顶卷柏 S．picta 电白
深绿卷柏 S．doederilenii 阳春
翠云草 S．uncinata 乐昌
?S．spl 梅州
兖州卷柏 S．involvens 信宜
叶育石 7199
7200
7206
7207
7208
7209
7231
7234
8116
7856
注 ；“?”未鉴定到种 。Note：“?”Not identified to species．
min。扩增产物于 1．8 琼脂糖凝胶、0．5×TBE缓
冲液 3～4 V／cm 场强 下 电泳 3 h，经 EB染色 3O
min，水洗 10 min，紫外灯下观察，照相(LabWorks
Software Version 3．0；UVP，Upland，CA 91786，
USA)。
1．4结果记录和数据分析
以 100 bp的 Marker作为分子量标准，在某一
个位点上，明确无误的位点记为“l”并估测分子量大
小 ，模糊位点和无位点记为“0”，检出每种的多态位
点(包括种特征单态位点、种特征多态位点和多态位
点)，并计算种水平和属水平多态位点数和多态位点
百分率；在属水平所有位点 1／o数据矩阵基础上，用
Popgene分析软件计算出各种间的 Nei氏(1972)遗
传距离和遗传相似性矩阵(Yeh等，1999)，在遗传距
离的基础上，采用非加权配对算术平均法(UPG-
MA)，绘出各种亲缘关系聚类图。
2 结果
lO个引物在 150个个体共扩增出279个位点，
分子 量大 小 在 l 580～ l5O bp之 间，其 中 5l
(18．28 )个位点为种特征单态位点，具有物种特异
性 ，有鉴定物种 的作用；还有 7个种特征多态位点 ，
具有一定的鉴定物种作用(表 l、2)。
各引物扩增的位点数从 24～34不等，平均
27．9个；各引物在种内扩增的位点数从 2(S106一S2)
到 19(S155-$3)，差别较大 ，从另一个方面说明引物
在种 间具有较 大的选 择差 异性 ；其 中 S163，S122，
S124，S14l，S106，S157和 S190在种 问具有很好 的
区分性(图 1，表 2)。种 内位点数从 65(S10)～96
7 4 8 2 5 2 6 2 3
乏； 孑；叭
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(S5)，平均 81．9，保证了计算结果的可靠性。
Nei氏遗传距离(D)在种 间变化从 0．231 51(S
9 vs．S．involvens)到 0．640 6(S．flagellifera vs．
S．moellendor
．
i)(表 3)，显示种 间具有较大的物
种差异。1O个物种在距离 0．45处分为两支(图2)。
在属水平所有位点的遗传多样性水平从 1．43 (S．
flagelli )到 9．68 (s．uncinata)，平 均
6．17 ，而种水平 的遗传多样性则从 5．26 (S．
flagelife )到 32．1O (s．uncinata)，平 均 为
2O．74 ，虽然种、属两个水平的最低和最高所属物种
一 致，但其他 8个物种遗传多样性水平在两个水平的
顺序由于种内总位点数不同而有较大变化(表 2)。
表 2 RAPD引物和它们的扩增位点数及每一个种的扩增位点数和单态种特征位点
Table 2 RAPD primers and their amplified numbers and mono-speeifie loci within each species
物
。
序列 s1 s2 s3 S4 s5 s6 s7 s8 s9 s1o
上Jnmer equence loci
S106 ACGCATCGCA 24 4(580)a
S1 15 AATGGCGCAG 24
S122 GAGGATCCCT 34
10
7
S124 GGTGATCAGG 29 5(1400)
S141 CCCAAGGTCC 24 10(280) 6(450)
S142 GGTGCGGGAA 31
S155 ACGCACAACC 28
S157 CTACTGCCGT 29
S163 CAGAAGCCCA 29
S190 ACCGTTCCAG 27
多态位点数
No．of polymorphic loci
种内总位点数
No．of loci within species
种内多态位点百分 比(％)
Percentage of interspecific
polymorphic loci
13(1000) 13
16
13(1560，
480)
6(260)
7
24
91
26．4
18(280)
11(1050，
950)
4
10
23
85
27．1
8(950，
250)
6
13(1200，
180)
11(1350。
1100)
7
8
19
9
7(950，
200)
0
10
76
8 8(1250)
6 10
12(980， 10(280)
150)
13．2 5．26
9(1530。
620)
9(500，
200)
13
8
12(350)
6
5(950)
1O(580)
6
8(1550，
1500)
11
16
8
6
0
9
6(400)
4
7
13
9
12(1200， 6
590)
6 8
10 10(1450)
4
6
8
10
8
8(780， 8(150) 8(1400) 7(1050) 9(320)
220)
9(950， 9
900，180)
12 23
96 87
12．5 26．4
8 5(580) 7
21 27 19
75 84 84
28．0 32．1 22．6
3
7(880)
7
4
3
11
11
7(380，
280)
4
8
9
65
13．8
属内多态位点百分比( ) 8．60 8．24 3．58 1．43 4．31 8．24 7．53 9．68 6．81 3．23
Percentage of intergeneric
polymorphic loci
注 ： 单态种特征位点。Note： Mono-specific loci molecular weight．
表 3 10个种之间的 Nei’s(1972)遗传一致度(上)和遗传距离(下)
Table 3 Nei’s genetic identity(above diagona1)and genetic distance(below diagona1)among ten species
一 。
7 6 8 7 7 5 4
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l期 余艳等：广东省十种卷柏属植物 RAPD初步分析 51
1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 11 12 M 13 14 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 11 12 1 3 14
S155：引物号 (Primer code) S3：S spl M：Marker
1 2 3 4 5 6 M 7 8 9 10 11 1 2 1 3 14 1 5 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 11 12 M 1 3 14 1 5
a
●-_一
S2：S trachyphyla a：单态种特征位点(mono—specific locus)
图 1 卷柏属植物在 RAPD标记位点上的物种特征位点
Fig．1 Specific locus among Selaginella species based on RAPD loci
S1：S．monospora}s2：S．trachyphylla；s3：S．xipholepis‘S4：S．flagellifera；s5：S．moellendorffi}S6：S．picta‘s7；S．doederile一
月{f；S8：S．uncinata‘S9；S．spl‘$10；S．involvens；M ；Marker；a：Mono-specifie locus．
S1
S2
S3
S5
S4
S9
S10
S7
S8
S6
0．48 0．42 0．36 0．29 0．23
图 2 10个种之间的遗传距离 UPGMA聚类图
Fig．2 UPGMA dendrogram based on the Nei’S genetic
distance among ten Selaginella species
3 讨论
RAPD标记在物种鉴定和系统学上的应用，早
期有着不同的看法，主要集中在位点的可重复性和
同源性上。经国内外科学工作者验证，严格标准化
实验条件，重复性是完全可以保证的；而且近缘种共
迁移位点多是同源的(邹喻苹等，2001)。目前一般
认为 RAPD标记主要用于种 内不 同居群间和种间
亲缘关系研究。如果与已知样品的 DNA同时扩
增，上述两个问题就能得到很好解决。
肖新月等(2001)和常崇艳等(1999)应用扫描电
子显微镜对 13种卷柏属植物的大孢子和 10种卷柏
属植物的叶的显微结构及大小孢子囊的排列方式进
行观察，认为这些特征可作为卷柏种类鉴别和药材
识别真伪的重要依据。由于卷柏属药用植物含有大
量具有广泛药理活性的双黄酮类等化合物，在化学
成分、功能主治等方面不尽相同。王钢力等(2002)
采用 HPCE的MECC的分离模式，对 18个卷柏属
植物样品的乙酸乙酯提 取物进行 了测定，认为被测
样品的黄酮类成分既有共性也存在差别，这种差别
也对于药材品种的鉴别有着一定的意义 。
本研究利用 10个 RAPD引物对 10种卷柏属
150个植株进行的扩增，种水平的多态位点率从
5．26 (S．flagellifera)到 32．10 (S．uncinata)，
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52 广 西 植 物 27卷
平均 2O．74 ，反映了物种内部个体之间的遗传变
异。为了准确地寻找出每个物种的特征性位点，我
们对每个种 12~18个个体进行了检测，将种内特征
位点划分为单态和多态两种 ，其 中种 内单态特征位
点有可能较好地代表一个种的分子特征，作为区分
和鉴定植物的依据 。在本研究的 1O种卷柏植物中，
每个种均有 明确无误 的种 内单态特征位点 ，最少 2
个 单 态 特 征 位 点 (S．flagellifera一$122—980bp、
150bp；S．doederilenii—S124—400bp、S163—1400；S9一
S122-1450bp、S163—320)，最多达 12个单态特征位
点(S．moelendor i)，为卷柏属植物从 DNA分子
水平中药鉴定与分类提供了基础。
虽然本属植物染色体基数不定，但它们在形态
上具有高度的一致性(李正理等，1983；王培善等，
2001)。有关本属种问关 系的研究报道不多，而且，
不同作者从不同角度进行的分类亲缘关系结果不一
致。如周厚高等(1999)编制的检索表首先把单子卷
柏区分出来 ，然后是二型卷柏和翠云草 ，江南卷柏和
兖州卷柏关系较近，黑顶卷柏则被最后鉴别出来。
王培善等(2001)则最先鉴别出二型卷柏，然后兖州
卷柏和江南卷柏及黑顶卷柏关系较近 ，粗叶卷柏和
深绿卷柏关系较近，与单子卷柏较远，而翠云草在它
们之后。本研究显示，S9与兖州卷柏遗传距离最
小，它们与二型卷柏首先聚在一起；在遗传距离
0．44处与深绿卷柏、翠云草和黑顶卷柏聚为一支，
而单籽卷柏、粗叶卷柏和江南卷柏聚为另一支，与上
述文献结果都有所不同，原因有待进一步综合形态、
细胞和分子等层次 的研究查明。同时，它们之间的
关系与它们所具有的单态特征位点数目多寡并不相
关 ，而是建立在共迁移 同源性位点的多少上 。
当然，由于不同批次、不同厂家试剂和实验条件
的限制，特定具体的RAPD标记位点产物的长久稳
定保持，目前在时间和空间上还存在一定困难。另
外 ，本研究 的取样范围局限于广东省 ，为了企业对卷
柏属药材鉴定的方便和精确应用，还应扩大取材范
围，把 RAPD种单态特征位点转化为 SCAR(Se—
quence Characterized Amplified Regions)标记。而
且鉴于卷柏属的药用价值和在维管植物分类和演化
研究的重要地位(李正理等，1983)，对卷柏属植物进
一 步深入和全面的研究是很有必要的。
参考文献 ：
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