全 文 ：广 西 植 物 Guihaia 22(1)：81— 84 2002 年 1月
香蕉花叶病毒外壳蛋白基因克隆
及表达载体的构建
杜道林 ，苏 杰 ，周 鹏 ，刘志晰 ，邓晓东 ，郑学勤
(1．海南师范学院生物系，海南海口571158~2热带作物生物技术国家重点实验室，海南海 571101)
摘 要；从海南太田感染香蕉花叶病的香蕉叶片，获得香蕉花叶病毒，提纯其RNA，在 AMV反转录酶作用
下合成 cDNA第一链，经PCR扩增，获得一约700 bp的DNA片段，漫I序结果显示所克隆的DNA片段包含
一 完整 的香蕉 花叶病毒株系(CMV—BHI)外壳蛋白基因，长度为 657 bp，然后将此 DNA 片段 ，分别克隆到
pBI121和 pKHG4质粒，构成两个吉 CaMV35s启动子(5’。端)、NOS终止子(3。。端)和分别吉 NPTI标记基
因和NPTⅡ及 HPT标记基因的植物表达载体(pTBB和 pTBK) 然后用rAHC18中的UBI promoter换下
pBI121的CaMV35s promoter，构成 pBIAH；再用CMV—BHI外壳蛋白基因换下 pBIAH中GUS基因，构成一
吉单子叶植物启动子 UP,I和NPT l标记基困的植物表达载体(pTBBU)。从而为CMV-BHI外壳蛋白基因
在香蕉中表达打下了基础 。
关键词：香蕉花叶病毒；外壳蛋白基因；克隆；测序；植物表达载体
中图分类号：Q943．2 文献标识码：A 文章编号：1000—3148(8002)01-0081-04
Cl oning and reconstruction of expression vector
of the banana mosaic virus coat protein gene
DU Dao—fin ，SU Jie ，ZHOU Peng。，LIU Zhi—xin。，
DEN Xiao—dong。，ZHENG Xue—qin
(1 Departme~t ofBiology，IfamanN~malCdlege，Haikou，5711 58．China；2．Nnf㈨ Key
Biotecfinology L~Jboratory， 7~pka ，CATAS，Haik 571101．China 1
Abstract：A DNA fragment about 700 bp obtained from the first strand of cDNA which svntt1esized with a viral
RNA temp]ate extracted from viral particles(CMV—BHI)isolated from propagarion h。st hanana ln Hainan bv
using AMV reverse transcriptase and 3-end PCR primer after 35 PCR amp[illcarion cyc1es
． It was c1oned into
T Easy vector-The whole DNA sequence was determined and the resuIts showed that the entire ene (657
bp) 。odi“g the coat protein had been cloned，Then two plant expression vectors(pTBB and pTBK)we
re re—
constructed with the。oat protein gene being cloned into pBII21 and pKHG4 respectively
． And fhe thjrd DIant
pression ector(pTBBU)was constituted by UBI promoter digested from pAHC18 excf1anging with CaMV
35s P 。 。t o{pBI121·and then using 657 bp coat protein gene exchanging the GUS gene
． All the fhree re一
∞mb ∞ w re sc eened with endonue~ease digesting and DNA dot blot
． This found the exDresslon of CMV一
收稿 日期：ZOO0—03—01
作者简介：杜道林(197O)·男，四川万源人 ，博士后 ，副教授．从事植物生态学
、植物遗传学研究 。
基金项目 南省挚育厅琅目(Hjsk99o9—1)；农业部生物技术重点项目{海南省重点扶持学科“生态学 和海南师范学院科研启动基金 资助
一 率文香蕉花叶病毒外壳蛋白基因序列已申报到 GenBaak棱醮数据库，登录号为；AF444252
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广 西 植 物 22卷
BHI coat protein gene in banana plant．
Key words：banana mosaic virus；coat protein ne
香蕉(M“5dl df minata)是世界产量最大的四种
水果之一“ ，香蕉花叶病是危害香蕉生产的两大病
毒病害之一 ，在我 国，此病 于 1 974年在广州市郊
首 次发现。 ，此后随组培苗 的推广应用而逐年发生
严重 ．一般发病率为 20 ～dO ，个别重病 田块
高达 80 ～90 。
近年来 ，植物基 因工程技术 的飞速发展 ，为培
育抗病毒植物新品种提供了新的途径，Powe[1等将
编码烟草花叶病毒(TMV)外壳蛋白基因用植物表
达载体导人烟草和番茄细胞中使之表达，首次获得
了抗 TMv 的转基 因烟草和番茄 ，此后 ，这一策略
被广泛应用于其他众多的植物抗病毒病 品种的培
育上，成为目前培育抗病毒病植物最重要的一条途
径 。本研究对海南香蕉花叶病毒外壳蛋 白基因进
行分离克隆和测序，并将其构建成植物表达载体，
为进一步培育抗花叶病香蕉品种奠定基础。
1 材料和方法
1 1材料
实验采 用 的菌 种 为 E．co／i DH5a，质粒 为 T—
Easy Vector、pBI121，pKHG4，pAHC18。酶和生化试
剂购 自华美生物工程公司、Promega公 司和 Bmlabs
公司 植物材料为大田感染花叶病毒的香蕉叶片和
健康心叶烟草幼苗。
1．2方法
1 2．1病毒提纯度其 RNA的纯化 用病叶直接接
种法将病毒接种到健康心叶烟草幼苗上 ，引起心
叶烟草产生 花叶病 症 状，然后用 Scott(1963)提取
CMV程序修改的方法分离病毒，再用蛋白酶 K酶
解病毒外壳蛋白，纯化病毒 RNA。
1．2．2单链 cDNA的合成 按 Promega公司的操作
说明，用上述 RNA抽提物在 25 T 的反应体系中，
加 2,ug Oligo(dT)和 15U 的 AMV逆转录酶 ，42口c
反应 1 h
1．2．3 PCR体外扩增 用于PCR反应的 5’端和 3’
端引物系根据已发表的相关 cDNA序列。’，以及
PC／Gene软件分析，并据 Primer设计优化原则“ ，
设计并合成一对引物(引物合成仪为 Beckman In—
strumenls Inc．Oligo 1 000 M DNA Synthesizer)．
Prirnerl： 5， CAT G
—
A
面
G A T
r
CC ATG GAC AAA
TCT GAA TCA ACC AGT GCT GGT一3’
Prjmer2： 5-TGA G
—
A
1
G G
T
T
一
~C TCA AAC TGG
GAG CAC CCC TG 3’
在25 I 反应体系中加人 10×PCR Buffer 2 5
I ，加 1 I 1．25 mM 上述 引物，dNTPs 2．5mM 2
m ，Taq聚合酶 2 u，补双蒸水至 25 I 。然后在 PE
2 400 PCR仪上反应，热反应循环为：94℃，1 min；
49。C，1 min；72。C，2 mini 35个循环后 ，72℃ 保温
1t3 rain。用 O．8 的琼脂糖凝胶电泳检查分析。
1．2．4扩增片段的克隆和重组子的鉴定 PCR反应
产物与 T—Easy Vector在 T4一DNA IAgase作用下连
接成 T—CMV—BHI—CP(pTB)，然后转化感受态 E．
coli DH5a，在含有 Amp 100 gg／mI X～gal／IPTG 的
I B培养基上培养12～16 h后，挑选白色苗落，用碱
法提取质粒、电泳并对滞后者进行酶切鉴定“ 。
1．2．5 DNA序列分析 用正、反引物分别从两端测
序，测序质粒为 T—CMV—BHI—CP(pTB)，用碱法制
备及 PEG法纯化 ，测序仪为 PE公司的DNA 377
A Seqencer。所得 DNA片段定名为 CMV—BHI—CP。
54
99
69
51
37
23
MK CK
臣 1 香蕉花叶病毒外壳蛋白基因
PCR扩增产物电泳图
Fig．1 PCR amptif[cation resu[t of hanaria
mosaic virus coat protein gene
MK—PCR Marker；CK一对照 (T-E y Vector)；1 PCR产物
(PCR amplification rmu]O(一一 所示为香蕉花叶病毒外壳
蛋 白基 曰一一 banana mosaic vi US protein Eerie)．
1．2．6 CaMV35sp-CMV—BHI—CP—Nost NPT Ⅱ 融
合基 因表达栽体(pTBB)的构建 用 SmaI消化 pBI
121，再用 SacI酶切，回收大片段，与 T CMV—BHI—
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l期 杜道林等：香蕉花叶病毒外壳蛋白基因克隆及表达载体的构建 83
CP(pTB)经 Apal消 化后 ，用 T4一DNA Polymerase
补平，再用 Sad酶切后回收的小片段，在 T4一DNA
连接 酶 作 用 下 连 接 ，再 用连 接 产 物 转 化 E．coli
DH5 感受态细胞，筛选获得重组质粒 pTBB。
1．2．7 CaMV35sp—CMV BHI—CP Nost—HPT—NPT Ⅱ
融台基因表达载体(pTBK)的构建 T CMV—BHI—
CP(pTB)经 ApaI消化后，用 T4 DNA聚合酶补平，
再 以 Sad 酶切，回收约 700 bp小 片段，将 之 与
pKHG4以 Sinai消化后 ，再经 Sad酶切后回收的大
片段连接，再转化 E．c DHS=感受态细胞，筛选获
得重组质粒 pTBK．
1．2．8 UBIp—CMV—BHI—CP—NPTⅡ融合基因表迭栽
体 pTBBU 的 构建 pBI121经 XbaI酶切 ，Klenow
酶补平，再用 HindⅡ酶切后回收的约 10 KB片段与
pAHC18经 BglⅡ消化后 ，用 Klenow 酶补平 ，再 用
HindⅢ消化 后 回收的约 1 KB小片段连结 成 pBI—
AH．用 HindⅡ／Sinai双酶切鉴定后 ，经 SmaI消化 ，
2 结 果
2l
ACC
CGC
CAG
CGT
ACG
AAT
AAA
A rlG
GCA
GCG
GTG
CAT
GTT
再用Sad酶切后的大片段与pTg经 ApM消化后用
T4一DNA Polmerage补平，再 用 Sad 酶切后 回收的
约 9 KB大片段，在 T4一DNA连接酶作用下连接，转
化 E．cofiⅨ{5 ，筛选获得重组质粒(pTBBU)。酶切
和点杂交(DNA dot blot)鉴定。
4 3 2 1 MK
■ 蓁
图 2 pTB Ncol／Sacl双酶切电泳图
Fig．2 The result。f pTB dtgested witk N~oI and SacI
MK—PCR MarkerI1．2一pTB NeoI／~~I；3．4一CM V BHI—CP gene．
33
CGT
TCC
CGA
TAT
AAG
AAA
TCC
GGA
CAA
GAT
GAC
CAc
AAC
TCT
CTC
GGT
AAG
TTC
TCG
GCC
GCT
ATT
GAT
CAA
DNA sequence composition：146 A；176C}16OG ；175T；OOTHER
图 3 香蕉花叶病毒外壳蛋白基因序列图
Fig．3 The DNA sequence of coat protein gene of banana mosaic viru~
2 3 cDNA全序列刹定
2．1 PCR体外扩增
PCR体外扩增出一条分子量约 700 bp的带(图
1)，与张锡炎等(1995)，胡天华等(1 992)报道的
DNA片段大小基本一致。’“ 。
2．2扩增产物的克隆和阳性重组子的鉴定
扩增产物在T4一DNA连接酶作用下克隆到 T—
Easy Vector上，构成 T—CMV BHI—CP(pTB)，用
NcoI／SacI双酶切，结果 出现一条约 700 bp大小带
(图 2)，而对 照无此带 ，说 明 PCR扩增产物 已连接
到 T—Easy Veeror上。
3g
CGT
GcG
AAT
AAA
CTT
GAT
GAC
TCA
AAC
GGT
GCA
CGC
正、反 向的测序结果 显示 657P的 DNA片段，
其序列与 CMV同源性较 高(图 3)，与张锡 炎等
(1995)的 CMV—BH—CP同源性 为 9l-8 ；可 编码
218个氨基酸，与张锡炎等(1 995)的 CMV—BH—CP
编码 氨基酸 同源性 为 91．28 ”，故 定其 名为
CM V—BHI-CP。
2-4 CaMV35sp-CMV—BHI—CP-Nost—NPTⅡ融 合基
因 表 达 载 体 (pTBB)、CaMV35sp—CMV—BHI CP—
Nost—HPT—NPTⅡ融合基因表达载 体(pTBK)和 u—
Blp—CMV—BHI-CP—Nost—NPTⅡ融合 基因表达 载体
(pTBBU)的鉴定
转化 E．coti DH5 感受态细胞．在含 Amp的固
A T G G T T A G C C T T
_H∞∞_H_H∞∞|J M_J 0 T T G o G GG G G
品 焉 一
盯_J_J∞ 竹 盯_J 腑w IJ叶竹代 _J
∞∞_J．J兀_一_一∞∞．J耵 亿w_一∽盯盯∞盯_一_J盯 ∞
研他 _Ju_J耵耵耵
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广 西 植 物 22卷
．再 提取质粒 用酶切法
)鉴定 (图 d、5)，表明这
白基因碱基序列来看
其与张锡炎等报道的序列同源性达91．8 (编码氨
基酸同源性为 91．28 )，与 CMV—C和 CMV Q序
列同源性都大于70 。可以认为我们分离的海南这
， 榇系应为 CMV株系：同时由于其样品采于不同
地点和仅约 91 的同源率 ，可以认为其为一香蕉花
叶病毒不同株系
MK 1 2 3 4 5 6 7 8
4 三种表达载体酶切鉴定图
Tcsling。 the three expression vectors digested with endonueleases
bNA／Hind I1】 】DTB／NcoI+SacI：2 pTB／NeoI+Sad；3-DTBB／Ncol—Sad{4 pTBB／Xba
Bu／N∞】一 Sad；6 DTBBU／Psd Sad；7-pTBK／Nc。】一Sad 8一DTBK／HindlII
■
．体点杂交 田
hree expression veclars
CK—nont ran．~genic
jK．3-pTBBU
E功为通过基 因转化技
供了坚实的基础，虽然
中皆能启动表达，但对
物基因表达启动子更
}叶植物基因表达启动
．
一 般认为单子叶植物
我们不仅构建了卡那
pTBBU．还构建了既含
记的表达载体 pTBK。
．构建 ，在设计扩增基因
弓{物时 ，刻意在 5 端和 3’端分别设计上适当的酶切
位点 (如本研究引物 1的 BamHi位点．引物 2的
Sacl位点)．可为后续工作创造便利条件
参 考文献 ：
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香蕉生产前景 [J] 海南大学学报(自然科学版)．
1994，12(1)：8O一 84
(23黄朝豪，李增平．谢 昌，等．海南香蕉花叶病的研
究口 热带作物学报，1995，16(1)：70⋯76
[3]高乔婉 香蕉花叶病侵染源研究EJ]．华南农业大学
学报 ．1992，13(3)：40—52
C43谢联辉，周仲驹．林奇英．等．香蕉花叶病在福建的
发生及其病原EJ-．福建省植物病理学会(学术讨论
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lobacco~osaic virus coat protein gene[J]．sm ，
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[6]杜道林．刘志昕．郑学勤 病毒与植物抗病基囡工程
EJ3．海南师范学院学报．1998．11(1)：1 02—107．
(73胡天华。吴 琳．刘 玮．等．黄瓜花叶病毒外壳蛋
白基因的 DNA克隆和全序列测定比较EJ3 科学通
报 ．1989．(21)}1 6s2—1 655．
t下转第 l3页 Continue on page 13)
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1期 沈显生等：浙江朱家尖观音湾古木层中果实与种子的分类学研究 13
植物。我们在研究该区植物遗存的同时，还对古木
层中的孢粉进行了分析，从孢粉资料看，该区有青
冈(CyclobJanopsis sp．)、栲(Castanopsis sp．)和石楠
(Phonitia sp．)等常绿木本植物；有椴树、枫香和槭树
(Acer sp．)等落叶木本植物；此外，尚有大量的菊科
(Composltae)、禾本科和莎草科等草本被子植物和
蕨类植物(有关孢粉资料将另文发表)。虽然我们获
得的有关该区历史植被的资料不全，但从植物遗存
中的木本植物的习性 ，以及孢粉资料，笔者认为观
音湾古木层历史植被类型属于亚热带常绿、落叶阔
叶混交林植被。由于在群落内出现了荆三棱和金鱼
藻等水生植物，说明在群落内的局部地段可能有褶
泽地。同河姆渡植物遗存研究结果相似，这说明当
时的气候较现代更温暖湿润“ 。有关该区历史植被
的较为详细的种类组成，有待今后进一步研究进行
补充。
总之，这些果实与种子等植物遗存的发现，以
及今后对古木层的进一步发掘和研究，将为探讨该
区历史植被和历史植物区系以及古气候变化，提供
更多的植物学证据。
参考文献 ：
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木层的发现及其意义[J]．自然杂志，2000，22(61：
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技术出版社，1993．
C33中国植被编委会．中国植被[M]．北京：科学出版社，
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C43浙江省博物馆 自然组．河姆渡遗址动植物遗存 的鉴
定研究口]．考古学报，1978，(11：95—105．
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古植被、古气候EJ]．植物学报，1981，23(2)：l46一
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(6]安徽植物志编写组．安徽植物志[M]．合肥：安徽科
学技术出版社 I北京：中国展望出版社 ，1985．1992．
图 版 说 明
图版 1
1一南酸枣(×4)；2-苜蓿属(×35)；3-野山楂(×ZT)；4-茄属(X60)；5-粥三棱(×45>；6-金鱼藻属(×27)；7-朴树属(×
27)；8-忍冬属(×27)。
图版 11
1，2-樟(x1 2：1外观 ，2断面)；3-山胡椒属 (果校碎片，×16)f 4-乌桕(X12)}5，6一鹅耳枥属(X 24：5外观 ，6断面)；7．
椴树属(xlO1；8-浙江紫薇 (x1o)。
Explanation
Plate l
L—Choerospondias aacilaris(X 4)；2-Medicago sp．(X 351f 3-Crataegus cungata(×271；4-Solanum sp．(×601：5-Scirpus
yagara(x 451；6-Ceratophyllum sp．(×271；7-Celtis sp．(X 271f 8-Lonicera sp．(X 271
Plate II
L，2-C 日 0 “ 口 phora(x 1 2：1 surl[ace，2 section1；3-1．indera sp．(pieces of fruit—pit，×16)；4—Sa声 ” e6 卅(×
12)；5，6-Carpinus sp·(×24：5 surface，6 section)；7-Tilia sp．(×lO1；8-Lagerstroemia chekiangenMs(×10)
．
(上接第 84页 Continue from page 841
[83 Thosmas J White．PCR Protocols[M] Acadm~c
Pre Inc．(America)． 1990． 85— 86
[g]朱 平 PCR基因扩增实验手册[M]．北京：中国科
学 技术 出版社 ，1992．57—61
[103 Sambrook J，Fristsch E F．Maniads q-．(金冬雁 ．黎
孟枫，等)．分子克隆实验指南(第二版)[M]．北
京 ：科学出版社，1 992．16—34．
[11]张锡炎．伍世平，刘志听．等．香蕉花叶病毒外壳蛋
白基因 的分离测序和 比较 [J]．热带作物学 报，
1995．16(增刊)：l3—18
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