全 文 ：广 西 植 物 Guihaia 21(3)：243— 246 2001年 8 月
香蕉 RAPD分析初步研究
杜道林 ，苏 杰 ，周 鹏 ，罗素兰 ，黄秉智 ，郑学勤
(1 悔南师范学院生物系，海南海口 571158；2．热带作物生物技术国家重点实验室，海南海rt 57ii01
3 西北农业大学园艺系，陕西西安 71 2100,4 广东省农业科学院果树研究所，广东广l州 510640)
摘 要；比较了不同提取方法对香蕉植株不同部位组织提取DNA的质量及其PCR扩增结果，对香蕉RAPD分
析中引物种类和浓度，复性温度，dNTPs，TaqDNA聚合酶浓度，热循环数等因素进行了比较影响分析。结果表
明，虽然改 良的SDS法 、CTAB法和 PVP法提取的植株嫩叶和吸芽 DNA提取量和纯度各不相同，但其 PCR扩
增结果基车相同}相同克隆不同植株的DNA其PCR扩增结果也基本相同；建立了适台香蕉太规模 DNA多态
性分析RAPD反应体系：25 I 反应液中，古1倍缓冲液t0．2mMdNTPst0，32 pM 随机引物，IUTaq酶，20 ng模
板DNA；反应循环散为 45，热循环条件为94。C，1 rain{37。C，1 rain；72。C，1，5 rain；之前为94 C，5 rainf之后为
72。c，l0 rain 在筛选的 240个随机引物中，有18个在 7个品种上都能扩增出3～10条比较清晰条带。
关键词 ；香蕉 ；RAPD；影响因素
中图分类号 ：Q75 文献标识码：A 文章编号：i000—3142(2001)03—0243—04
Prel iminary studies on the appl ication
0f RAPD in M usa
DU Dao一1in ，SU Jie ，ZHOU Peng ，LUO Shu—lan。，
HUANG Bin—zhi ，ZHENG Xue—qin
(1．Dei~zrtmem of Biology，Halnan Normal Coleget Haikou 571158，China}2 Nathmal Key Biotechno!og2~
La&~ratory Tropical Crops，CATAS，Haikou 571101 r China,3．Department of I-Iortivulture，
Ⅳ ∞^ Agricultural University，Xian 712100．China；4-P~ ology Research[nstiLute n
Guangdong Academy f Agrlcodtural Sciemv．Guangzhou 510640-China 1
Abstract：The effects of the DNAs，extracted from young leaves and buds(or sprouts)of M usa by modified SDS，
PVP and CTAB methods．the primers and their concentrations，the concentrations of dNTPs，Taq DNA poly—
merase，anneahng temperature and time，number of amplifying cycles，etc．，on RAPD analysis in Musa were stud—
led．The results showed that the amphfied results were the same on the whole，although the quantitative and quail—
ties of the DNAs of young[eaves or buds extracted by mod ified SDS．PVP and CTAB methods were diferent／and
the amplified resu[ts of different plants belong to the same clone were similarfand then the optimal amplification
conditions for M usa weTe the folowing：2O ng template DNA ，0，2 mM dNTPs，0，32 pM prhner l U Taq DNA
polymerase-2．5ⅡI l0×bufferin 25 p．1 reaction vo[ume．And 45 cycles of 94℃ for1min，37。Cfor1min and 72
。C for 1．5 min．then 72。C for 10 rain，4 。C storing．In the 249 arbitrary primers used in experimentt only 18
收藕 日期；2000—02—26
作者简升；杜道林 (1 970一)．男，四川人 ，博士，副教授 ．从事植物生态学、植物遗传学研究 。
．
基金项目．海南省教育厅项目(Hisk9909—1) 农业部生物技术重点项目 海南省重点扶持学科”生态学”和海南师范学院科研启动基金资
助项 目。
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244 广 西 植 物 21卷
primers were amplified 3～ 8 dear bands in al the 7 strains of M “Ⅻ
Key words：M um；RAPD；effeeting factors
基于 PCR(polymerose chain reaction)技术的随机
扩 增 多 态 性 DNA(random amplified polymorphic
DNA，RAPD)是 9O年代初发展起来的检测 DNA多
态性的分子标记技术“ 。由于其提供信息量太，操作
简便和没有放射污染而在种质遗传多样性、基因定位
等方面得到了广泛应用。 ，但许多研究者也发现，
RAPD技术并非理论上那么“简单易行”，许多因素，
如以不同方法提取的不 同植株不 同部位的模板
DNA，反应混台物组分(DNA、dNTPs、Taq酶、引物)
的浓度和相对比例等，都可能影响PCR反应结果的
准确性、稳定性和一致性“ 。
香蕉(Musa spp．)品种繁多，遗传性状和背景比
较复杂。 ，所以尽管它在商业上具重要价值(为世界
第四大水果)，但其杂交育种、性状改良等育种研究却
很薄弱 。本研究试图以常见栽培种为材料，研究其
DNA多态性及分子标记，为香蕉生物工程育种创造
优良品种奠定基础。本文旨在阐明：(1)获得适合于香
蕉 RAPD分析 的 DNA(包括取材和 DNA提取)；(2)
获得稳定可靠的可大规模操作的香蕉 RAPD反应体
系和程序；(3)筛选适台香蕉 DNA多态性 RAPD分
析的随机引物，以为大规模香蕉种质遗传多样性和分
子标记研究打下基础。
1 材料与方法
1．I材料
新鲜植物材料取 自广东省农业科学院国家香蕉
种质库。所有RAPD随机引物均为 1O个碱基的寡核
苷酸，242个为 OPERON公司产品，7个为设计并合
成。Taq酶，dNTPs，Bufer等为华美公司产品i琼脂
糖为 Promega公司产品；SDS、PVP、CTAB为 Sigma
公司产品；其他生化试剂为国产分析纯。
1．2方法
1．2．1 DNA提取 取植物嫩叶和吸芽，分别采用改
良的 SDS法“ 、CTAB法“”和 PVP法“ 提取其基因
组 T)NA。
(1)SDS法。取 0．2 g植物材料，液氮快速研磨至
粉末，转入一 1．5 mI 离心管中，即加 3倍体积提取
缓冲液(500 mM NaCI，500 mM Tris-HC1(pH8．0)，50
mM EDTA，10 (v／v) 琉 基 乙醇，加冰 冷 PVP
(20 )至终浓度为 6 和 10 SDS至终浓度为 2
(W／v)，轻轻混匀后 6 。c水浴 10 mln，加 1／10倍体
积 5 M KAc，置冰上 30 rain，离心 (12 000 rpm，1 5
rain，4。C)，取上清液 ，加入 0．6倍体积异丙醇，沉淀
DNA，真空干燥后溶 于 200 I TE(pH8．0)中(含
Rnase(20~Lg／mI )，37。C水浴 30 rain，用 1倍体积饱
和酚 ：氯仿 ：异戌醇(25：24：1)抽提 2次，异丙醇
沉淀 DNA，用 75 酒精洗 2次，干燥后溶于 100 I
TE(pH8．0)中，4。C保存备用。
(2)CTAB法。取 0．2 g植物材料，液氮研至粉
末，转入一 1．5mI 离心管中，加等体积CTAB提缓冲
液 (2 CTAB，100 mM Trls—HCl(pH8．0)，20 mM
EDTA (pH8．0)，1．4 M NaCl，1 PVP，20 mM
Na。S O ，2 琉基乙醇)和氯仿 ：异戌醇(24：1)，
混匀后 65℃ 水浴 30rain，离心 (12 000 rpm，10min，
室温)，取上清液，氯仿 ：异戌醇(24：1)抽提 1次 ，异
丙醇沉淀 DNA，挑出絮状 DNA，70 酒精洗 2次，干
燥后溶于 200 I 含 Rnase(20~g／mI )高盐 TE缓冲
液(10 mM Tris-HCl(pH8．。)，1 mM EDTA(pH8．0)，
1 M NaCI)中，37。c水浴 30 rain，用 2倍体积无水乙
醇和 1／lO倍体积 3 M NaAc(pH5．2)沉淀 DNA，干
燥后溶于 100 TE(pH8．0)，4。C保存备用。
(3)PVP法。取 0．2g植物材料，液氮研磨至粉
末，转入一 1．5 mI 离心管中，加 3倍体积提取缓冲
液(250 mM NaC1，25 Mm EDTA，0．5 SDS，20 mM
Tris-HCI(pH8．o)，轻 轻混 匀 后，置 室温 1 h．，再 加
PVP至终浓度为 6 ，混匀后加 0．5倍体积 7．5 M
NH。Ac，置冰上 30 min，离心(12 000 rpm，10 min，4。
c)，取上清液，异丙醇沉淀 DNA，干燥后溶于 200
含 Rnase(2O pg／mI )TE(pH8．0)中，37。c水 溶
30rain，氯仿 ：异戌醇(24：1)抽提 2次，异丙醇沉淀
DNA，75 酒精洗 2次，真空干燥后溶于 10O I TE
(pH8．o)，置 4。C保存备用。
提取的 DNA稀释后用紫外可见分光光度计
(BECKMEN DU．70)测 OD值 和于 0．8 琼脂糖凝
胶中电泳，观察 DNA的纯度和分子量大小。
1．2．2 PCR反应体系 在 25 I 反应体系中，含 1O
×Buffer 2．5 I ，dNTPs备 200 uM ，Primer 0．32
PM，模板DNA 2O ng，Toq酶 1 u。某成分浓度变化
以此为基础在个别实验中说明。
1．2．3 PCR反应程序 将反应混合物混匀后，加 25
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3期 杜道林等：香蕉 RAPD分析初步研究 245
I 无菌液体石蜡油，94。C变性 5rain后；于 94。C，1
rain；37。C，1 rain；72℃，1．5 min，45个循环后，72。
C，10min；4。C保存 复性温度变化 ，变性和复性时间
变化及循环数变化以此为基础在个别实验中说明。
1．2．4随机引物筛选 共取 249个随机引物进行筛
选。PCR扩增产物在含 EB染色液的1．4 琼脂糖凝
胶中电泳后，在柴外检测仪上观察并拍照。
2 结果与分析
2．1三种DNA提取方法的比较
核酸的嘌呤、嘧啶中都有共轭双键，对紫外光有
强烈的吸收。”，天然双链 DNA在 260 nm处的吸收
值与 280 rim处 吸收值 比值 (A260／A28O)应在 1．80
左右，低则说明制剂中蛋白质可能未除尽，高则说明
制剂中还有 RNA“”；A26O／A230应≥2，比值小说明
制剂中可能残存核苷酸、氨基酸、酚、盐等小分子杂
质“ 。3种方法提取香蕉叶片DNA的结果比较见
表 1，PVP法和 SDS法提取的 DNA 量较大 (其中
SDS法最大)，CTAB法相对较小，但 CTAB法提取
之 DNA纯度较好，DNA片段大小较一致(图版 I—
A)。3种方法提取之DNA片段大都大于23 kb，分别
以它们作模板进行 PCR反应，扩增结果基本相似(图
版 I—B)，说明此 3种方法所提取之 DNA都可直接
用于 RAPD分析。
表 I 三种方法提取香蕉 DNA结果比较
Table 1 Comparison of DNAs extracted by three methods
2．2不同植物体部位提取 DNA比较
分别取香蕉嫩叶和吸芽，采用以上3种方法提取
其 DNA，结果 比较见表 1，用之进行 PCR反应 ，结果
见图版 I C。表明吸芽 DNA提取率要高于嫩叶，
PCR反应结果基本相同。考虑到采取吸芽不太容易
和 DNA提取程序的简捷性等原因，取嫩叶以 CTAB
法提取 DNA用于 RAPD分析是可行的。
2，3 RAPD反应体系和反应程序的优化
复性温度实验分别设计 37、42、50、55。C；当复性
温度≥50 ac时，基本无明显条带；复性温度为 42。c
时，条带明显减少 循环中变性时间分别设计为 94。
C，5、25、40、60 s，复性时间均为 37 ac 1 min，5 s时无
明显条带，40 s及以下时，条带很少甚至没有 循环数
设计为 、2O、3j、4O、45，4O及以下时条带很少且弱甚
至无。
dNTPs浓度设计为 0．05、0．10、0．15 mM，0．05
mM 时基本无明显条带，0．10 mM 及以上时有较多
条带(但有的带很弱甚至元)。Taq酶浓度设计为
0．25、0．5、1、1．5U，0．25U时基本元带，1．5U时有
带纹拖尾。Primer设计为 0．16、0．32、0 64、1．28 pM，
O．16 pM时条带甚少，而1．28 pM 时条带多且有些模
糊，0．64 pM和0 32 pM 时结果相似 DNA模板设计
为 10、20、4O、80 ng，1O ng时基本无带，40 ng及以上
有带纹模糊拖尾现象。
综上所述，建立香蕉 RAPD反应体系为：25 I
反应液中含 1倍缓冲液，0．2 mM dNTPs，0．32 pM 随
机引物，1 UTaq酶，20 模板 DNA；反应程序为：94
。C，5 rain后 ；94 C，I rain；37。C，I rain；72。C，I．5
rain，45个循环；然后 72℃，10 rain，4℃保存。
2．4香蕉 RAPD分析随机引物筛选
共取 249个随机引物(OPA、OPJ、OPH、OPO、
OPV、OPQ(无 14)、OPU、OPW (无 03)、OPB、OPG
(01、07、09、12、1 7)、OPS(01～ O7、12、1 7、18)、OPR
(06～ 11、13、14)、OPP(1l、1 5)、OPC(无 02、09、10、
11、18)及设计并台成的 7个引物(P1：5 CGCTGT
CGT T一3’、P2：5-GGG AGA GTG A一3’、P3：5’一GAG
GAG TAC G．3’、P4：5-CGC GTA CCA A一3’、P5：5’一
GTG CTG GAT G一3’、P6：5-GTC CGT ATG G一3’、
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P7：5’一GAG AGA CAG A一3’)，用 2个(品种)模板筛
选后都能得到较清晰扩增条带共记 62个引物，而用
7种模板筛选后都能得到清晰扩增条带的引物共 18
个。
2．5DNA多态性 ．
所用引物不同，DNA扩增产物差别很大，扩增条
带多达 10多条，少则 1～2条，很多都无，这说明可能
在香蕉 DNA链 中的反应重复序列与随机引物序列
存在着数量上差异。此外 ，同一引物对不同品种DNA
扩增结果可表现出丰富的随机多态性(图版 I—D1．但
一 般都有 1～3条共有带，说明供试品种既有遗传背
景复杂性 ，叉具同属种植物共性。
2．6相同组培单元(clone)不同单株 RAPD结果
取 7个品种各相同克隆各 2个不同单株进行
RAPD分析，发现单株间DNA并不表现出明显的多
态性 ，而是比较相似；但不同品种却表现出明显的多
态性 (图版 I—E)。
3 讨 论
本研究 旨在为大规模香蕉 RAPD分析奠定基
础，包括解决模板 DNA来源及准备、PCR反应系统
和程序、引物筛选等问题。从结果分析，在对叶和芽
DNA提取的3种方法中，由于PVP和SDS与 CTAB
法在原理上有差异，加之香蕉材料本身的特殊性，故
PVP和SDS法虽产量稍高，但纯度不及CTAB法，所
有提取方法获得的DNA片段都大于 23 kb，可直用
于 RAPD分析。因为相同克隆的不同单株其 DNA并
不表现出明显多态性，故一般 1个克隆(done)取1个
单株材料就可以了。
在筛选的 249个引物中，有 18个在 7个品种的
DNA模板中都能扩增出比较清晰条带，表现了香蕉
基因组本身的特殊性。根据可扩增出清晰带的引物序
列，我们设计并合成了 7个引物，它们都能在 7个品
种上扩增出明显条带，这也说明在掌握较多随机引物
扩增信息时，我们可以设计比较有效的特异引物来简
捷地对香蕉 DNA多态性进行分析，甚至它们可能成
为极具商业价值的分子标记。
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韦发南 ，等 ：中国樟科润楠属植物一些种类修订
WEI Fa—nan， t＆f．：A taxonotlic revision on some species of M athiLus Nees(I auraceae)from China
图版
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比较图
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