全 文 ：广 西 植 物 Guihaia 24(6)：566— 569 2004年 11月
沙田柚自交、异交花粉管蛋白双向电泳分析
秦新民，李惠敏，薛妙男，杨继华
(广西师范大学生命科学学院，广西桂林 54lOO4)
摘 要：比较分析了沙田柚自交、异交花粉管蛋白的双向电泳图谱，两者的蛋白分布格局相似，具有重叠性，
可分辨出200多个蛋白点。在异交花粉管电泳图谱中发现了 1种特异蛋白(A)，A蛋白(MrA一58．2，pI一
5．9)；在自交花粉管电泳图谱中发现了2种特异蛋白(B、C)，B蛋白(MrB=26．4，pI一6．1)，C蛋白(MrC一
28．0，pI=6．3)，这些蛋白可能与自交不亲和有关。
关键词：沙田柚 ；花粉管蛋白；双向电泳
中图分类号 ：Q946．1 文献标识码：A 文章编号：1000—3142(2004)06—0566~04
厂 1● ● l l ● ■ n l n _l。W0一．=Ilm enSl0na1eectro19noresis oIsel
and non。self pollinated pollen tube
proteins 0f Sha tin yu
QIN Xin-min，LI Hui-min，XUE Miao-nan，YANG Ji-hua
(College of Life Science，Guangxi Normal University，Guilin 541004，China)
Abstract；Two-dimensional eIectrophoresis of self and non—self pollinated polen tube proteins of Shatinyu
were compared and analyzed．Their proteins distribution were similar and showed overlapping．More than 200
spots were differentiated on the ge1．A special protein was detected in non—self polinated pollen tube electro—
phoresis，its molecular weight was 58．2 ku and p1 was 5．9．Two special proteins were detected in self-pollina—
ted pollen tube electrophoresis．Their molecular weights were 28．0 ku and 26．4 ku，respectively．Their pls
were 6．3 and 6．1．These proteins maybe interrelate to self-incompatibility of Shatinyu．
Key words：Shatinyu；pollen．tube protein；two-dimensional electrophoresis
对沙田柚自交不亲和性的细胞学基础和生化基
础的一系列研究(薛妙男等，1995，1996，200lb)，不
但确定了沙田柚为配子体自交不亲和型，花粉管在
花柱中的生长途径以及花粉管在花柱的 1／z部位生
长受阻；而且采用亲和层析和电泳相结合的方法，分
离纯化了沙田柚花柱特异糖蛋白，并对其生物学活
性及生化性质进行了分析：该蛋白为碱性糖蛋白，糖
含量为 9．2 ；由2个亚基组成，相对分子量分别为
38．0 ku、32．0 ku；等电点分别为7．5和7．2；生物活
性测定的结果表明，该蛋白能抑制自花花粉离体萌
发的花粉管伸长；氨基酸序列分析表明，32．0 ku组
分 N一端 15个氨基酸序列与矮牵牛、花烟草等的花
柱特异糖蛋白 N一端相应序列极为相似(杨继华等，
2001)。同时，还用免疫胶体金标技术对花柱 S一糖
蛋白进行了组织化学定位(薛妙男等，2001a)。至
此，沙田柚配子体自交不亲和性在雌蕊方面已取得
了较大进展。但沙田柚配子体自交不亲和性在雄蕊
(花粉)方面的研究进展不大。本文将通过研究花粉
管自交、异交条件下蛋白的差异，为沙田柚配子体自
交不亲和性研究提供一些新的实验证据，为最终分
收稿日期：2004—02—17 修订日期：2004—04—20
基金项目：国家自然科学基金(30160007)；教育部西部地区高等学校高级访问学者资助项目。
作者简介：秦新民(1956～)，男，广西灵川人，博士，研究员，从事植物分子生物学研究。
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6期 秦新民等：沙田柚 自交、异交花粉管蛋白双向电泳分析 567
离、鉴定其雄蕊 S一糖蛋白和探讨沙田柚配子体自交
不亲和性的机理打下基础。
1 材料和方法
1．1材料
沙田柚实验材料采自桂林市雁山文家村果园。
在盛花期收集其花药干燥后保存于-70℃备用；同
时进行人工自交(沙×沙)、异交(酸×沙)授粉，3 d
后收集自交、异交授粉花柱，截取花柱 1／2部位上下
3 mm分存于-70℃备用。
1．2方法
1．2．1花粉管的培养与收集 花柱识别蛋白的制备
参照杨继华等(2000)和张绍铃等(2000)的方法进
行：取沙田柚自交、异交后 1／2花柱段，加 0．1 tool／
L的 Tris—HC1蛋 白提取缓 冲液 (含 10 mmol／L
NaC1，10 mmol／L EDTA一2 Na，lmmol／L CaCI2，1
mmol／L DTT，1 mmol／L PMSF，pH7．8)，冰浴研
磨提取，12 000 rpm冰冻离心 15 min，取上清液，用
35 饱和度的(NH ) SO 盐析，盐析得到的沉淀用
双蒸水透析 2 d后，PEG 6 000浓缩，然后用含 12
蔗糖的BKS培养液(含 0．02 9／5硫酸镁，0．01 硝酸
钾，0．03％硝酸钙，0．01 硼酸，pH5．6)(Brewbaker
等，1963)溶解成浓度 2 mg／mL，置于-70℃备用。
将低温保存的沙田柚花粉于室温(25℃)快速
解冻过夜，撒播在含 12 蔗糖的 BKS培养液中，置
于生化培养箱 27℃暗培养2 h后加人自交、异交花
柱蛋白提取物，并使其终浓度达到 0．2 mg／mL，继续
培养 6 h，过滤收集萌发花粉(带花粉管)。
1．2．2花粉管蛋白的提取 取 2O mL离心管，按
500 Ing萌发花粉加人 5 mL 0．1 mol／L的Tris—HCI
蛋白提取缓冲液，离心管置于冰浴中，用JY98一Ⅲ型
超声波细胞粉碎机(宁波新芝科学仪器厂)，按功率
600 W，超声时间为 3 s／次，间歇时间 6 s／次，共进
行 120次的一组参数进行破碎花粉管。样液于 4℃
静置抽提 2 h，然后在4℃，12 000 rpm条件下离心
30 min，取上清，在双蒸水中进行透析过夜，次日
PEG 6000浓缩到原提取液体积的 1／5后分装 EP
管，100 p．L／管，存放于一7O℃备用。
1．2．3双向电泳 采用 lEF／SDS—PAGE双向电泳，
参照 O Farrel(1975)、何瑞锋等(2000)和谷瑞升等
(1999)方法，略有改动。
样品处理：低温保存的花粉管蛋白提取液，室温
解冻后，加人 5倍体积-20℃预冷的丙酮(含 0．07
巯基乙醇)，-20℃放置过夜，次 El在 4℃，12 000
rpm条件下离心 20 min，弃上清，再将沉淀悬浮于
同样的冷丙酮，-20℃放置 1 h，同样条件下离心去
丙酮后将沉淀干燥成粉，用 5倍样品鲜重的样品裂
解液(9 mol／L尿素，2 NP一4O，2 载体两性电解
质 pH3～9．5，2 DTT)充分溶解沉淀蛋白。上样
前于 10 000 rpm 离心 5 min。
第一向等电聚焦(IEF)：采用自制电泳装置，取
内径 2 mm，长 10 mm的双通玻璃管 6～8根。凝胶
浓度 T=4 ，载体两性电解质 pH范围3～9．5(北
京解放军军事医学科学院产品)。电极液为：上槽
(负极)0．02 mol／L NaOH，下槽(正极)0．01 mol／L
H PO ；预电泳：每管加 2O L样品裂解液，依次进
行200V 10 rain，300V 30 min，400V 30 rain的预电
泳。预电泳结束，每管上样 15 L(其中有两管为空
白对照，用来测 pH值)，在室温下，按 400V 1 h，
600V 12 h，800V 1 h的程序进行聚焦电泳。
取胶、测 pH值：聚焦结束后，将要测定 pH值
的空白胶条按每段 1 cm长等分为若干段捣碎，按顺
序放人小离心管，各加 1 mL双蒸水，密封 12 h，用
精密 pH计测定各段 pH值，然后绘制 pH梯度曲
线，根据蛋白组分聚焦部位距胶条正极端的实际长
度确定其 pI值。
第二向 SDS—PAGE：对于要进行第二向 SDS—
PAGE电泳的胶条，放人平衡液(O．06 mol／L Tris—
HC1，pH6．8，10 甘 油，5 巯基 乙 醇，2 SDS，
0．001 溴酚蓝)平衡 2O min。第二向采用垂直平
板电泳装置，凝胶大小为 13∞×11∞×0．1∞，浓
缩胶 4 ，分离胶 1O ，制备浓缩胶时在一端插人单
孔梳，以便加人标准蛋白。待胶聚合好后，将平衡后
的胶条对半切开以便于平放在浓缩胶顶部并用 1
琼脂糖封胶，单孔处加人2O L的标准蛋白样品(上
海西巴斯生技公司产品，分子量范围为 14．4～97．4
ku)；电极缓冲液系统为 Tris-甘氨酸(pH8．3)，含
0．1 SDS，恒压 150V至电泳结束。
电泳结束后，剥下胶板进行银染。银染步骤：凝
胶板于固定液 I(40 甲醇，1O 乙酸)固定 30min；
在固定液Ⅱ(10 乙醇，5 乙酸)固定 2次，每次 15
min；然 后 于 氧化 液 (0．1 重 铬 酸钾，0．02
HNO )氧化 5 rain；双蒸水洗 2次，每次5 mini再于
硝酸银溶液(O。2 9／6 AgNO )中反应 20 min；双蒸水
洗 1 rain；最后于显影液(2．536 无水 Na2CO ，临
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568 广 西 植 物 24卷
用前加入 5O L 37 甲醛／i00 ml 溶液)振荡显影
至出现清晰蛋白斑点后用 l2 乙酸进行定影。
2 结果
自交、异交花粉管蛋白经双向电泳后，从图 i：
a、b可以看出，进行高灵敏度的银染后的自交、异交
花粉管全蛋白双向电泳图谱，具有较高的分辨率，两
者的格局基本一致，具有重叠性，可以分辨出200多
个蛋白点。对双向电泳图谱的蛋白分布情况分析发
现：这些蛋白主要分布在 pH4．5～7．6之间；从不同
分子量蛋白分布来看，主要分布在 43．0～20．0 ku
的范围内，而 97．4～66．2 ku范围内的蛋白较少。
自交、异交花粉管蛋白的分布格局一样，在各 pH和
3 讨论
pH值
|I．异交 Cross-polinated
不同分子量范围内的分布几乎无差异。考虑到已知
花柱与 自交不亲和有关的蛋 白处于 pI范围 5．0～
7．j之间，在多次的重复实验中主要考察该范围内
自交、异交条件下的蛋白点的变化或差异情况，则发
现自交花粉管在 20．1～31．0 ku范围内出现 2个与
异交花粉管不同的点 (箭头所示 B、C)，而异交花粉
管在 66．2～43．0 ku范围内出现一个不同点(箭头
所示 A)。根据标准蛋白，采用复 13 Smart View
2001凝胶电泳分析软件进行分子量计算，同时在等
电聚焦后作出的 pH梯度曲线上找到相对应分子量
蛋白的 pI值。结果显示，A蛋白的相对分子量 Mr
为58．2 ku，等电点 pI为5．9；B蛋白的相对分子量
Mr为26．4 ku，等电点 pI为 6．1；C蛋白的相对分
子量 Mr为28．0 ku，等电点 pI为6．3。
97 4·一
66．2
— 43．0一
31．0
．
-4
一
．
-
4 詈 兰 姜 骂 三 = 东 害 三 器 譬 =
pHf~[
b．自交 Self-poljn．Ifcd
图 1 花粉管双向电泳图谱
Fig．1 Two—dimensional electrophoresis pattern of proteins from pollen tube
本实验参照薛妙男等(2000)分析沙田柚花柱特
异蛋白和 Floyd等(2000)对烟草(Nicotiana taba-
cum)花粉管进行特异蛋白的研究方法，采用双向电
泳结合高灵敏度的银染技术，通过对自交、异交条件
下的花粉管蛋白格局进行了比较分析，发现自交、异
交条件下的花粉管蛋白格局相似，但在自交图谱上，
有两个蛋白点(相对分子量分别为 26．4 ku和 28．0
ku，等电点分别为6．1和 6．3)在已知花柱与自交不
亲和相关的特异蛋 白所处分子量范围内(PI5．0～
7．5，Mr 22～32 ku)；而异交条件下只有一个(Mr
为58．2，pI为5．9)不同于自交条件下的蛋白点，但
该点不在已知花柱与自交不亲和相关的特异蛋白所
处分子量范围内(pI5．O～7．5，Mr22~32 ku)。
在配子体自交不亲和系统中，花粉自交不亲和
因子一般认为是存于花粉管(细胞质)或花粉内壁，
但具体在哪个位置至今仍不清楚。虽然已有实验证
据证明沙田柚 自交花柱 S-糖蛋白特异性地抑制自
花花粉管生长，但花柱 S一糖蛋白抑制花粉管生长的
机理仍未清楚：究竟是S一糖蛋白的 RNase活性降解
了花粉管内的 RNA还是 S一糖蛋白与花粉管内某一
物质发生相互作用以导致花粉管生长受到阻抑?要
解决该问题关键是鉴别出花粉(管)中识别因子。
Kao和 McCubbin(1996)就 S一糖蛋白抑制花粉管伸
长的过程提出了两种模型：一是“受体”模型，即花柱
S一糖蛋白有选择地进入带有与自己相同S基因型的
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6期 秦新民等：沙田柚 自交 、异交花粉管蛋白双向电泳分析 569
花粉管，并在其中降解其 RNA而抑制花粉管继续
伸长；二是“核酸酶抑制剂”模型，认为在花粉管内花
粉 S基因编码一种特异的核酸酶活性抑制剂，该抑
制剂抑制所有除自己的等位基因编码的 S一核酸酶
外的其他各种核酸酶的活性。该模型下花柱 S一糖
蛋白无选择性地进入花粉管，在其进入带有不同 S
基因型的花粉管时，其 RNase的活性将受到高度专
一 性抑制物质抑制，花粉管继续生长，而在进入带有
相同S基因型的花粉管时，并不受到抑制剂抑制其
RNase的活性，花粉管伸长受到抑制。由于在一定
S_糖蛋白浓度范围内，离体花粉管的长度与其呈直
线负相关，而高浓度的 S一糖蛋白也可能因物理、化
学的作用而产生一些带毒性的物质抑制花粉管的生
长，这与经加热处理过的花烟草 S．糖蛋白已经不具
有 S-RNase的活性但仍能抑制其花粉管的伸长的
现象相同(Gray等，1991)。因此，目前仍缺乏 S一糖
蛋白直接抑制花粉管生长的证据。对于这两种截然
不同的关于配子体自交不亲和的模型假说，只有分
离和鉴定出花粉(管)中的 S_糖蛋白才能对它们作
出正确的判断。
考虑到现有的关于配子体自交不亲和的两种模
型学说，我们的结果从一个方面支持了“核酸酶抑制
剂”模型。也就是说，沙田柚花柱 S一糖蛋白无选择
性地进入花粉管，在其进入带有不同S基因型(即异
交条件下)的花粉管时，受到了高度专一性抑制物质
(本实验结果中的 A蛋白可能是这种抑制剂)抑制
其 RNase的活性，导致 RNase的抑制作用失活，因
此花粉管继续生长；而在进入带有相同S基因型(即
自交条件下)的花粉管时，花粉管内花粉S基因编码
的核酸酶活性抑制剂(本实验中鉴别到的 B、c蛋白
可能是这类抑制剂)并不抑制其 RNase的活性，
RNase仍可以发挥其降解 RNA的作用，花粉管伸
长也因此受到抑制。然而由于至今仍没有实验能准
确鉴定出配子体型自交不亲和系统中花粉相关蛋
白，因此也就缺少关于花粉自交不亲和识别因子理
化性质的实验数据。有资料表明，花柱中s基因不
能在花粉中表达(Clark等，1994)，并且花粉中 S—
RNase活性非常低。这都意味着花粉中s基因产
物与花柱中s基因产物虽然存在着结构上的互补关
系，但却是显然不同的。因此，至于本实验检测到的
这些蛋白是否是与沙田柚配子体自交不亲和性有关
的特异蛋白，是否是“核酸酶抑制剂”模型的有力证
据还有待对这些蛋白的理化性质、空间结构等作细
致而深入的分析实验来验证 。
本实验得到南京大学医药生物技术国家重点实
验室华子春教授的指导，特此致谢。
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6期 周 繇：长白山区野生草本观赏花卉调查 523
大陆北半球上最大的野生草本观赏花卉种质资源
库。对观赏价值较高的种类，统一由资源库中调出，
并实行严格的“三证制度”：即采集者需有采集证，收
购者需有收购证，外销部门需有外销证。通过立法
及行政措施确定野生草本观赏花卉资源库的所有
权、使用权，使其成为温带地区开展野生花卉引种、
驯化、家植的中心。
5．2注重珍稀物种的就地保护和迁地保护
通过扩大自然保护区的范围，建立一套完整的
技术档案，不断加强珍稀物种的就地保护和迁地保
护工作力度，对于那些抗逆性强，生态幅度宽的种类
可利用植物园繁育中心进行迁地保护；对于远离保
护区，分布区域十分狭窄人工繁殖不易成活的种类，
可由地方的林业、环保、农业等部门的协调建立小型
专种的自然保护区，同时还要以《森林法》、《动植物
保护法》为依据，加大打击那些直接或间接破坏野生
草本观赏花卉的力度，妥善地保护好野生遗传资源。
5．3做好野生草本观赏花卉的引种驯化工作
通过对野生草本观赏花卉的生态、生殖等方面
的研究，积极做好引种驯化工作，明确野生花卉的引
种方向、对象、种类。通过采用杂交、多倍体、辐射等
多种育种手段，培育出花大、色艳、味美、观赏价值
高、适应性强的园艺新品种，筛选出适合露地栽培、
建立花坛、以及家庭盆栽等的种质资源，并结合生物
技术进行试管快繁，将种质资源在短期内转化为商
品，从而丰富温带地区观赏植物的种类，创造出更多
的独具地方特色的景观。
本调查的植物照片均存于中科院植物研究所植
物图像库。在野外调查的过程 中，得到了中科院植
物所徐克学研 究员，长白山国家级 自然保护局科研
中心刘军主任，博物馆刘利副馆长的大力支持和帮
助，中科院植物研 究所的陈之端研究员给本文进行
了修改，谨此致谢。
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