全 文 ：广 西 植 物 Guihaia 21(3)：247～ 251 2001年 8月
沙田柚系列遗传关系的 RAPD标记研究
张太平 ，彭少麟 ，凌定厚 ，李 丹 ，甘廉生。
(1．中国科学院华南植物研究所、广东广 5106501 2广东省农业科学院果树研究所，广东广州 51 0640)
摘 要 ：采用 RAPD标记技术分析了沙田柚系列 12个样品的遗传关 系。利用经筛选具多态性的 l4个 l0碱基
随机弓【物对l2个样品进行DNA随机扩增，获得清晰可重复的位点99个，其中多态性位点58个，占58．89 ；在
部分样品中检出了特异性 RAPD标记 l9个，占 19．19 f通过样品问遗传相似性系数 比较与 UPGMA聚类分
析，并根据历史事实可知 ，广西沙田柚、梅州盎柚为抄田柚的无性繁殖系，软枝系抄田柚、抄田柚早熟单株为抄田
柚的芽变后代，梅花早柚、菊花心沙田柚、冬瓜圈沙田柚、段氏柚、垫江抄田柚、古老钱抄田柚为沙田柚的实生变
异品系
关键词：沙田柚系列f RAPD标记 遗传相似性 UPGMA聚类分析
中圈分类号：Q75 文献标识码：A 文章编号 ：1000 3142(2002)03—0247—05
Anal ysis of genetic rel ationships among
Shatianyou Pomel o l ines by RAPD markers
ZHANG Tai—ping‘，PENG Shao一1in ，LING Ding—hou ，
LI Dan ，GAN Lian—sheng
(1 South China tmtitute D，Botany．Academia Siniea，Guangzhou 510650，ChimtI 2． ¨a 0／
Fruit Trees，Guangdong Academy Agrlcu~urat Sciences，Guangzhou 510640，China)
Abstract：Genetic relationships among 12 Etccesgions of Shatianyou(Citrus grand~Osbeck cv．)Pome[o lines were
analyzed by RAPD technique．Fourteen screened 10 bases primers were used in the study．They produced 99 clear
and repeatable RAPD bands，in which 58 were poiymorphic，accounting for 58．59 ，and 19 were cuitivar specific
RAPD markers，accounting for 19．19 ．The results of genetic similarity analysis and UPGMA clustering showed
that Guangxi Shatianyou(cv．)and Meizhou Jinyou(cv．)were the clones of Shatianyou(Ct~rus grandis Osbeck CV．)；
Ruanzhixi Shatianyou(cv．)and Shatianyou precocity individual were the bud mutation of Shatianyou(Citrus grand~
Osbeck cv．)；The others were selected from seeds of Shatianyou(Citrus grand~Osbeck CV．)originating from hy—
bridization．
Key words：Shatianyou Pomelo lines；RAPD markers；genetic similarity；UPGM A clustering
随着 RAPD分析实验技术的完善和分析软件的
开发，它被广泛用于生物的系统进化与起源。 、种内
遗传多样性的结构与布局。 、作物品种鉴定及个体鉴
定“ 、基因定位及遗传图谱的绘制等研究中“ 、 但
收稿日期 ：zoo0—05-06
作者简介：张太平 (1 967．)．男，湖南邵阳人 ．博士 ．主要从事植物生态学与环境生物学研究。
基金项 目：中 日美国际合作华南遢化坡地绿色食品生产及保护与提高生物多样性研究(1 99906) 中国科学院院地合作项 目(1 999年度)
广东省科技百强创新工程项 目项目(1999~2000年度){中国科学院广州分院科技计划项目(99BO5902X)。
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248 广 西 植 物 21卷
在柚类研究中特别是沙田柚有关品系阉的遗传关系
研究中未见报道。
沙田袖(C~rus grand／s Osbeck cv．)为我国柚类
中的名优品种，原产广西容县沙田村，已有 200多年
的栽培历史，各地广泛引种。在原品种的基础上，由于
天然芽变、人工及天然杂交，并通过不断的选种育种，
已形成具有多个相关品系的沙田柚系列。由于它们与
同一个品种相关，其遗传多样性如何，相互间的遗传
关系怎样，新的品系是否有特异性标记来指印并注
册，RAPD遗传标记研究将为其提供可靠的研究手
段和重要的背景资料。
1 材料与方法
1．1实验材料
供试的实验材料包括容县沙田柚老树的无性繁
殖系、沙田柚实生变异品系或单株等沙田柚系列的
12个样品，分别来 自中国农业科学院柑桔研究所柑
桔种质资源圃及广东梅州地区等沙田柚产区(表 1)。
表 1 实验所用沙田柚系列样品的名称与来源
Table i The accessions of She tianyou Pome[o lines and its origin
所 用 试 剂 其 中 TaqDNA 聚 合 酶 购 于 宝
(TAKARA)生物工程(大连)有限公司，随机引物购
于 Sangon Ltd．Canada广州代理，其他为国产或进口
试剂。所用引物及其序列如表 2(引物筛选另著文发
表) 。
表 2 实验所用引物及其序列
Table 2 Primers used in the study and their sequences
I．2总 DNA的提取
取以上实验材料的春梢幼嫩叶片 4℃ 保鲜带回
实验室，一3O℃ 保存备用。采用 Edwards K．等的方
法 ’，稍作修 改。分别取新鲜幼叶 l cm 左右，按
CTAB法提取 DNA，提取物溶于 200 I TE中，以
BECKMAN(Du．7)分光光度计测定 DNA含量，取部
分稀释为l0 ng／p[ DNA溶液备用。
1．3 PCR反 应及其产物 电泳
扩增反应在 Biometra的UNO—Thermerblock上
进行。25 I 反应液中包括 10 mmol／l Tris—HCI(pH
9．0，25。C)，50mmol／I KCl，0．01 triton X．10，1．9
mmol／| MgCI ，0．1 mmol／14×dNTP，0．2~mol／L 10
碱基随机引物，1单位 TaqDNA聚合酶，5O ng模板
DNA。反应液上加大约 2O I 矿物油防止反应过程
的水分蒸发。反应过程共 45个循环，除第一个循环经
94℃ 预变性 30 S，每一个循环都包括 92℃ 变性 1
rain，35。C引物与模板结合 l min，72℃ 引物延伸 2
min，最后一次循环还包括 72。c保温 5 min，降温至
10℃ 等候取出或直接取出样品在冰箱中4℃保存。
灭菌重蒸水作为对照。
扩 增 产 物 以 1．7 的琼 脂 糖 凝 胶 电泳，以
GeneRulerTM 100 bpDNA Ladder Plus(100～ 3 000
bp)为分子标记，溴化乙锭染色，结果在紫外灯下用
Polaroid667照相记录。
1．4 RAPD标记的数据获得与分析
根据照相记录，以清晰可辩且可重复为标准，对
每一引物的 RAPD扩增带进行样品间比较，在分子
量为 300～3 000 bp之问，样品问每一出现DNA扩
增带的位子作为一个位点，该位子有带记为“ ，无带
记为⋯0，获取所有样品 14个引物的 RAPD分析结
果的二元数据矩阵。 公式 Si=a／(a+b+c—d)计算
样品问成对比较的遗传相似性，其中a和d分别代表
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3期 张太平等：沙田柚系列遗传关系的RAPD标记研究 249
样品i和j所有 DNA扩增带有和无的数 目，b+c代
表样品问非对应关系数目之和。根据遗传相似性矩阵
对样品进行 UPGMA(unweighted pair-group method
with arithmetic mean)聚类分析，并绘制系谱图。以上
由NTSYS—pc(Version 1．80)软件(Rohlf，1993)在计
算机上完成。
2 结果 与分析
2．1沙田柚系列 DNA扩增反应结果
利用经筛选具多态性的 l4个 10碱基随机引物
对沙田柚系列的12份样品进行了DNA的随机扩增
反应，共获得清晰可辩、可重复的RAPD位点 99个。
其中多态性位点 58个，多态性位点百分率 58．59 。
图 1为引物 $79、$88两个随机引物的DNA扩增谱
带。
2．2沙田柚系列各样品的特异性 RAPD标记
RAPD特异性遗传标记是作物品种鉴定的重要
分子性状，任意一个或多个特异性遗传标记都能作为
一 个品种区别于其他品种的性状 14个引物的 99个
位点在沙田柚系列中检出了 19个 RAPD特异性遗
传标记(记为引物一RAPD带的估计太小 bp)，占总
RAPD标记位点的 19，19 。其中古老钱沙田柚最
多，包括 S1—1400、S8—950、$72—1031、$72—2000、$76—
1700、$84—550、$88—1000、$90—1031、$90—1400、$91—
1200共 10个；其次为垫江沙田柚，包括 s8一l1。O、s8—
1900、$88—1i00、$88—1800、$91—1600共 5个；其他为
无核 沙田柚的 s1—700、$84—850，菊花心沙 田柚 的
$72—1500，软枝系沙田柚的 s4i-750。从以上可以看
出，14个引物在沙田柚系列 12个样品中有 5个检出
特异性遗传标记，所以很难仅通过特异性遗传标记将
其全部区分 增加引物可望可进一步找到更多特异性
遗传标记。见图 1中$88所检出的古老钱沙田柚与垫
1 2 3 4 5 6 7 8 9 1011 12 M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 M
S79
3000
1200
500
bp
图 1 引物 $79、$88的DNA扩增圈谱
Fig．1 Band patterns amptifed using primer$79，$88
数字 1～12代表表 1的 12个抄用柚系列样品(如表 1)．M为标记 DNA(怅次为300、400 500、600、7O0 BOO、
900、l 031、i 200 i 500、2 0呻 3 000 bp)．箭头表示品种特异性 RAPD标记 。1～12 stand for the accessions tisted
in table 1．M is DNA mariner．a盯ow reiers to cultivar specifc RAPD markers．
江沙田柚的特异性 RAPD遗传标记。
2．3沙田柚系列各样品问的相似性系数及遗传分析
根据 DNA扩增结果，计算沙田柚系列各样品间
的遗传相似性系数，结果如表3。其中古老钱沙田柚
与垫江沙 田柚的遗传相似性系数最小，为 0．576，古
老钱沙田柚与所有其他样品的遗传相似性系数平均
值最小；而广西沙田柚与梅州金柚(沙田柚)的遗传相
似性系数最大，为 0．955，广西沙田柚与所有其他样
品的遗传相似性系数的平均值最大。广西沙田柚与梅
州金柚(沙田柚)间遗传极为相似，其他各样品问存在
明显的遗传差异。
对沙田柚系列各样 品问遗传相似性系数进行
UPGMA聚类分析，绘出聚类图，如图2。可以看出，
在遗传相似性系数 0．84，广西沙田柚、梅州金柚、软
枝系沙田柚、沙田柚早熟单株、梅花早柚聚为一类；菊
花心沙田柚、冬瓜圈沙田柚、段氏柚聚为一类，沙田柚
变异树、无核沙田柚、垫江沙田袖、古老沙田柚等各为
一 类。
3 讨 论
柚类为柑桔属中重要的亚热带果树，我国是柚类主要
发源地之一，种质资源丰富。 。近年来我国柚类生产
得到大力发展，柚类品种也不断推陈出新，可望成为
我国柑桔类出口刨 的重要产品。由于袖类栽培历史
悠久 ，老的品种繁多，新的品种(系)又不断产生，相互
问系谱关系不清楚，命名混乱，普遍存在同名异物与
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250 广 西 植 物 21卷
同物异名现象。所以利用遗传标记技术研究其品种间 秒田柚系列在我国广为栽培，其栽培面积、产量
的系谱关系，并利用特异性遗传标记指印品种非常重 和产区分布均居我国柚类各类群之首 ；但过去都凭感
要。 官和传统习惯为各地品种、品系或株系命名，口Jf法各
表 3 沙田柚 系列样品问相似系数
Table 3 Similarity index among 12 accessions of Shatianyou Pomelo lines
1O ll l2
1．000
0．900
0．655
0．617
0．871
0．870
0．740
0．887
0．831
0．845
0．840
O．887
1，000
0 659
0 641
0．829
0．881
0．699
0．819
0．841
0．803
0．824
O．87l
1．000
0 576
0．614
0．650
0．585
0 631
0．602
0．654
0．699
O．65l
1．000
0．680
0．63Z
0．605
0．675
0．645
0．680
0．684
0．697
1．000
O．85l
O．743
O．955
0．838
0．909
O．822
O．870
同表 1 The codeis sRme asta／~Iel
蒂 辫 蒋 1 ，忙 逊
E 寓# 呈 聋 昂 癸
抽 善 玲 善 翻
善 1口 菩 王 谆 谆
漤 歪 善 臣 田
船 薄 茸 尊
葬
图 2 沙田柚系列聚类分析图
Fig．2 Dendr~gram of UPGM A clustering analysis
for Shatianyou Pomelo lines
硅
亦
彗
譬
奄
麟
异，这对发展正宗的沙田柚商品生产、在国内外市场
创名优品牌极为不利。利用RAPD标记技术及 UPG—
MA聚类分析，可以清楚看出沙田柚系列各品系间的
遗传相互关系 结果表明，广西沙田柚与梅州金柚间
遗传相似性系数为 0．955，二者应为正宗沙田柚的无
性繁殖系，为同物异名；一般认为软枝系沙田柚、沙田
柚早熟单株为沙田柚的芽变单株，这也与它们相互间
的遗传相似性系数吻合；根据历史事实及聚类分析结
果可知，梅花早柚、菊花心沙田柚、冬瓜圈沙田柚，段
氏柚、垫江沙田柚和古老钱沙田柚为沙田柚的实生变
异；垫江沙田柚和古老钱沙田柚与广西沙田柚的亲缘
关系最为疏远，这可能与杂交亲本的遗传关系较远或
经历更多代的人工选育有关。从聚类分析结果还可看
出各样品在遗传相互关系上明显以广西沙田柚为中
心
RAPD分子标记技术不但可检测出品种间甚至
品系间的分子差异性，指证品种或品系间的系谱关
系，同时可检测出各品种(系)的特异性 RAPD扩增
带作为指证品种(系)的特异性遗传标记，这为国际通
行的品种注册提供依据。本实验利用 14个引物的99
个位点在沙田柚系列中检出了 19个 RAPD特异性
遗传标记(记为引物一RAPD带的估计太小 bp)，占总
RAPD标记位点的 19．19 。这里需要说明的是这些
特异性 RAPD标记的对应的 DNA片段长度是根据
标记 DNA(M)的估计值，如需了解其精确长度及结
构，需进一步作遗传分析。
研究发现，古老的沙田柚品种具有很大的变异潜
力，长期 以来不断的芽变以及自然与人为的杂交，经
人工选育，使其发展成为一个包括多个品系、遗传多
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3期 张太平等：沙田柚系列遗传关系的 RAPD标记研究 2 51
样性丰富的重要柚类种质资源。这对新品种的选育及
其遗传多样性的动态研究，对古老作物、果树品种的
保护，对生物种质资源开发与利用，具有重要的指导
意义。”。
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