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月季的组织培养和基因转化研究进展



全 文 :广 西 植 物 Guihaia 23(3):243—249 2003年 5月
月季的组织培养和基因转化研究进展
李美茹I,李洪清2,孙梓健 ,陈贻竹
(I.中国科学院华南植物研究所 ,广东广州 510650;2.华南师范大学生命科学院,广东广州 510631)
摘 要:分子生物学技术在花卉产业中展示了巨大的、潜在的应用前景。月季是世界性的重要观赏花卉,其
生物技术研究一直是国际的热点。综述了多年来月季的组织培养和基因转化的研究进展。
关键词:月季;胚状体发生;器官发生;基因转化
中图分类号:Q943.1 文献标识码:A 文章编号:1000—3142(2003)03—0243—07
Advance in tissue culture and genetic
transformation of rose
LI Mei—ruI,LI Hong—qing2,SUN Zi-j ian ,CHEN Yi—zhu
(1.South China Institute of Botany,ChineseAcademy of Sciences,Guangzhou 510650,China;
2.Life College,South China Normal University,Guangzhou 510631,China)
Abstract:Molecular biological techniques have been developed tO meet the demands of the flower industry.
Rose is one of the most important ornamental plants grown worldwide.Biotechnology of the rose is always the
research hot spots in the world.Tissue culture and gene transformation of rose are reviewed.
Key words:rose;embryogenesis;organogenesis;genetic transformation
月季是蔷薇科(Rosaceae)蔷薇属(Rosa L.)植
物,是泛指在蔷薇属植物中各个种类的总称。月季
花色艳丽、香气宜人,是世界重要的切花和各类高级
食品、化妆品的重要香料原料。当前,月季的育种是
花卉育种中最活跃的领域之一。育种目标主要集中
在对花色、花香、花形、开花习性、鲜切花寿命、株型、
抗病性等的改良上(黄善武,2000)。由于月季基因
型的高度杂合性,因此很难通过传统育种方法进行
单一性状的改良,而分子育种技术由于是直接有目
的地操作基因,使该技术具有能达到只改变月季的
某一单一性状而保持其它性状不变的特点。因此,
分子育种技术被越来越多地应用于改良观赏植物研
究上,在月季的改良上显示了很大的应用潜力。建
立月季组培和遗传转化系统是通过体细胞克隆变异
收稿日期:
基金项目:
作者简介:
进行育种和通过基因工程育种的重要前期工作。本
文综述近年来在这方面的研究进展,为进行月季基
因工程改良提供借鉴。
月季的组织培养研究进展
建立植株再生系统是为了进行基因转化、突变
育种、快速繁殖和保种。首次报道月季的组培再生
器官研究是 Hil(1967),随后又有多篇论文报道在
多个品种上实现了通过体细胞胚状体发生和器官发
生途径再生完整植株直至开花(表 1、2)。Rout等
(1999)综述了近年来月季生物技术的研究成果,但
是,在国内极少见到有关月季植株再生论文或资料
的报道。植株的再生一般经历从愈伤诱导、愈伤分
2002—04—22 修订 日期:2002—08一I 2
国家自然科学基金资助项目(30170667);全国 100篇优秀博士论文作者专项基金资助项目;广东省 自然科学基金
(团队项目003062)。
李美茹(I966一),女,广东汕头市人,博士,从事植物逆境生理、花卉基因工程的研究。
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化(体细胞胚状体发生或器官发生)、胚状体成熟萌
发或芽的发育、到植株再生、完整植株的移植等步
骤。下面将从影响植株快繁、愈伤诱导、体细胞胚状
体和器官发生、植株再生等因素介绍月季的组织培
养研究进展。
1.1丛生芽的诱导(分生组织的培养)
以往月季的繁殖方式主要靠嫁接、扦插和压条
等,繁殖系数低,远远满足不了市场的需要。8O年
代初,采取组织培养方法快速繁殖月季苗,从分生组
织(取材于侧芽、顶芽、顶端分生组织或侧生分生组
织)诱导出丛生芽,并诱导生根。这个过程包括丛生
芽的诱导、壮苗的培养、幼苗生根培养和移植等等。
第一篇报道月季的芽快繁论文见 Elliot(1970)在聚
花月季(Rosa multiflora)上成功地进行了芽的繁
殖和诱导幼苗生根。Zieslin和 Halevy(1976)报道
细胞分裂素有利于提高丛生芽的数量,但也增加了
诱发花器官败育或退化的频率。芽器官的快速繁殖
与供试材料的基因型有关,同时还与外植体的取材
部位有关,来源于枝条中部的侧芽的繁殖速率最快
(Bressan等,1982)。培养基中添加蔗糖有增加丛
芽数量的作用(Langford和 Wainwright,1987),加
入低浓度的GA。能进一步改善芽繁殖,95 9/6的外植
体能产生 7个以上的小芽(Rout等,1990)。能提高
芽繁殖数量的物质还有月桂酸甲酯(Voyiatzi等,
1995)、Chloropromazine(2一chloro一10—3一dimethyl a—
mino propyl phenothiazine)(Rout等,1992)、乙烯
(Kevers等,1992)等。诱导丛生芽的培养基主要是
MS培养基添加低浓度的激素(0.3~0.5 mg/L
benzylaminopurine(BAP),0.004~0.3 mg/L naph—
thaleneacetic acid(NAA)或 0.05~2.0 mg/L in-
doleacetic acid(IAA)或 GA。)。壮苗培养基因一般
是在 MS培养基中添加更低浓度的 BAP和 NAA。
生根培养基多采用低盐成份的 MS培养基添加低浓
度 NAA。移植植株生长均一,保留母本的优良性
状,Martin等(1981)调查了2 125个无菌苗三年间
在大田生长的情况,没有发现变异植株,这说明通过
侧芽方式繁殖的植株性状很稳定。目前已在多个品
种上成功地进行月季微繁殖的快繁技术。沈允权等
(1995)证明,从月季腋芽接种至第一批完整苗培育
需要 30~35 d,经 60 d可以培养出8~lO倍的完整
苗。一个腋芽一年内可增殖 lO万多苗,达到了快速
繁殖的目的,为月季的大批量生产,特别是鲜切花生
产提供优质材料。
1.2愈伤组织的诱导
Hil(1967)最早报道从杂交茶香月季(hybrid
tea rose)的茎上诱导了愈伤组织,但实验结果只到
芽原基(shoot primordia)。该实验证明在培养基中
添力口2,4一dich1orophenoxyacetic acid(2,4一D)或添力口
NAA和激动素(kinetin;Kin)均能很快诱导出愈伤
组织。随后不同实验以不同品种为试验材料,从叶、
I1f.柄、根、茎、原生质体、合子胚、花药、子房、花瓣、花
萼和花托成功地诱导了愈伤组织(表 1、2)。愈伤组
织的成功诱 导与 品种 的基 因型有关,Lloyd等
(1988)曾研究 R.persica×xanthina,R.hybrida
‘Clarissa,R.hybrida,‘Dame of Sark’和 R.rug—
osa‘Scabrosa’的愈伤发生能力,发现只有 R.persi—
ca×xanthina的节间能产生愈伤,愈伤组织脆性,呈
淡黄绿色,该实验是以 MS为基本培养基,添加低浓
度的BAP和NAA。Kunitake等(1993)研究了Ro-
sa rugosa Thunb.,Rosa multiflora,R.×alba CV.
Semiplena,R.hybrida CV.Duples,R.harisonii×R.
spinosissima的未成熟种子的愈伤发生能力,发现
只有Rosa rugosa Thurb.的能产生愈伤组织。Ro—
nto和 Soraya比品种 Baccara和 Mercedes更易产
生愈伤 (Kintzios等,1999)。激素、糖和外植体类
型也是影响愈伤生成的重要因素。Rout等(1991)
以 Landora材料,在添加 benzyladenine(BA)和
NAA,2,4一D的MS培养基上,外植体叶在接种的 7
~ 12 d后,在近轴面的叶柄和中脉处产生愈伤,愈
伤组织诱导频率高达92 。在接种的 l5~20 d,外
植体茎切端处产生愈伤,频率为 76 9/6。Aren等
(1993)详细地调查了R.hybrida CV.Meirutral不同
外植体的愈伤诱导率,不同外植体愈伤产生的能力
不同,叶为 9O 9/5,根为 7O 9/6,节间为 55 ,花药为
19 9/6,其它花器官部位如花瓣、花萼、子房和花托为
l6 9/6,合子胚的发育时期对愈伤的形成能力也有影
响,如处于心形胚的合子胚,其愈伤产生频率只有
2 9/6,子叶胚时的合子胚,频率达到 85 。生长素种
类和浓度对愈伤产生能力的影响同样很大。早期实
验多采用 NAA结合 BAP或 BA等,近年来多采用
2,4一D,并证明2,4一D是诱导愈伤的必要因素(Kint—
zios等,1999;Rout等,1991;Hsia和 Korban,1996;
Marchant等,1996;van der Salm等,1996;Visessu—
wan等,1997)。2,4一D对愈伤的诱导效果依赖于月
季的基因型,如 2,4一D浓度从 11.3/lmol/L增加到
181/lmol/L,降低了Rose hybrida栽培种“Carefree
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3期 李美茹等:月季的组织培养和基因转化研究进展 245
Beauty”的愈伤诱导频率,但该浓度则对另一个品种
“Grand Gala”无影 响。对于 R.chinensis minima
CV.“Red Sunblaze”而言,当浓度从 11.3~mol/L增
加到45.2~mol/L,则表现出愈伤的诱导率提高了,
随后当2,4一D再增加,则显著地降低愈伤的诱导频
率。愈伤组织在诱导愈伤组织的培养基上能得到继
代培养(subculture)(I i等,2002)。van der Salm等
(1996)证明2,4一D对诱导R.persica×xanthina和
Moneyway产生愈伤是非常必要的,进一步添加低
浓度的BAP有正效应,但如BAP浓度过高.则产生
抑制作 用。与以上 实验结果 不 同,Kintzios等
(1999)~tJ证明2,4一D对愈伤诱导有负影响作用,研
究者的解释是可能因为实验采用的外植体是成熟的
叶片。
1.3体细胞胚状体的发生(Somatic embryogenesis)
成功的体胚发生体系的建立将有助于对月季进
行体细胞杂交、冷藏保存、人工种子的生产和基因的
转化操作等等。首次从体细胞胚状体得到再生植株
是 Vales和Boxus(1987),多年的研究已证明体细
胞胚状体的发生是月季微繁殖潜在的非常有效的方
法。月季的体细胞胚胎发生在多个品种和多个外植
体类型上已成功地进行了操作(表 1)。月季的体细
胞胚状体发生能力与基因型的关系极大、,Murali等
(1996)调查了22个品种,发现只有 2个品种能进行
体细胞胚状体的发生诱导。de Wit等(1990)也发
现在供试的 7个品种中,只有 Dorningo和 Victory
Brown具有产生体细胞胚状体的能力。Kunitake
等(1993)在不加任何激素的MS培养基上由起源于
未成熟的种子愈伤诱导出胚性愈伤,频率达 5.9 9,6。
不加任何激素能诱导体胚发生的实验可见于 van
der Salm等(1996)和 Li等(2002)文章。绝大多数
进行体胚诱导的实验都是在培养基中添加细胞分裂
素(BA,BAP,Zeatin或 Kin)和生长素 (2,4一D,
NAA)。使用激素的类型及浓度据不同的品种、外
植体的类型而变化。体胚发生的频率普遍偏低,为
3 9,6~33 9,6。de Wit等(1990)在 1/2 MS培养基中
添加 Kin和NAA,外植体叶在接种后的 6~12周后
可见到体胚的产生,频率为 3.5 9,6,若用 NOA(2一
naphtyhloxyacetic acid)代替 NAA,体胚发生的频
率可提高到 5.8 0/;。Hsia和 Korban(1996)、Li等
(2002)在 Carefree Beauty上 证 明 Thidiazuron
(TDZ)有提高体细胞胚状体发生的作用,分别达到
6.6 和 31 9,6。在这方面的作用中,TDZ比 BA的
效果更好。GA。也被证明有利于提高体细胞胚状
体发生的能力。Kintzios等(1999)~0证明在供试材
料上使用 NAA、BA和 GA 对诱导产生体细胞胚状
体无效,(一Chlorophenoxyacetic acid(0CPA))才是
诱导体细胞胚状体的决定因素。Das等(1993)的实
验指出,体胚发生能力的诱导依赖于培养基中碳水
化合物的类型和浓度,果糖和蔗糖的效果最好,麦芽
糖则有利于诱导产生正常的体胚。Hsia和 Korban
(1996)比较了蔗糖和葡萄糖对 Carefree Beauty、
Red Sulblaze和 Baby Katie体胚发生频率的影响,
发现在培养基中不添加糖类,各品种的体胚发生频
率只有 6.6 9,6,但 当培养基 中加入糖类后,只有
Carefree Beauty对此有 反应,体胚频率提高 到
25 9,5。Kintzios等(1999)认为,培养时的光照强度
对体胚的形成影响很大,光强低于 50/~mol m s 光
照条件体胚的发生频率最高。
1.4次生胚状体的发生(Secondary somatic embryo—
genesis)
Rout等(1991)观察到了次生胚状体的产生。
当胚性愈伤置于含有 2.2 M BA,0.05 M NAA
和0.05 M GA 培养基中,每个月转培养基 1次,
次生胚状体的发生能力可以维持 16个月。培养基
中添加2,4一D有助于使愈伤组织在长时间内保持具
胚性的能力。Li等(2002)成功地报道了次生胚状
体的繁殖和萌发,指出ABA是进行次生胚状体发
生的关键因子。在供试 的 4个品种中,Carefree
Beauty具有最高的次生胚状体的繁殖和萌发频率。
1.5体细胞胚状体的萌发(Germination of somatic
embryos)
胚状体发育和萌发是再生植株的关键。在多数
品种的试验上表明,降低或取消 2,4一D有助于体胚
的发育和萌发。de Wit等(1990)实验表明,约有
60 的体胚萌发成正常植株,植株移植到温室后能
开花。Matthews等(1991)报道将体胚移到不含激
素的 SH 培养基 中,约 30 9,6的体胚萌发成植株。
Noriega和 Sondahl(1991)、Roberts等 (1995)证 明
ABA和GA。有助于体胚的萌发。山梨醇也有改善
体胚萌发的作用。Rout(1991)在诱导体胚发生时
加L一脯氨酸,增加体胚发生频率,但在体胚萌发培
养基中消除 L一脯氨酸,才能刺激体胚的正常发育。
他们还报道胚性愈伤在 8℃下进行 4 d的预处理,
体胚萌发频率从 0提高至 12 9,6。Roberts等(1995)
证明4℃下预处理 2 d,体胚萌发频率从 12 提高
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到24 。Muralis等(1996)认为 ABA和问苯三酚
明显促进体胚的发育和成熟,其中间苯三酚的作用
最显著,将频率从 33.3 提高到 93 。Kunitake
等(1993)报道 Picloram能抑制体胚的发育。光照
强度也是影响体胚成发育的一个重要因素,Kintzios
等(1999)证明光强 150 m0l m- S 光照是体胚成熟
和萌发的必要因素。
1.6器官发生(Organogenesis)
月季的芽器官(Shoot)发生表现为直接(不需经
过愈伤组织阶段)起源于外植体和需要经历愈伤阶
段的过程。Hil(1967)首次报道从愈伤组织再生了
芽原基,但 最终得不 到真 正的芽。Tweddle等
(1984)、Llody等(1988)分别报道R.persica×xan—
thina的愈伤在含 BA和 NAA的MS培养基中能再
生不定芽。Llody等(1988)还进一步报道在只加
BA的培养基中,外植体叶和根的表面直接再生出
芽。Dubois和 Vries也指出在 1/2 MS培养基中添
加TDZ和 NAA 中,叶表面直接再生了不定芽。
Arene等(1993)证明在 MS培养基中添加 BAP也
能诱导直接长芽。Rosu等(1995)则以增殖的无菌
丛生芽为外植体,在含 BA和 NAA的培养基上直
接再生了芽,当这些不定芽移至含 NAA,GA。和硝
酸银的培养基中,能诱导出丛生芽。Hsia和 Kor—
ban(1996)证 明,把来源于 Carefree Beauty、Red
Sulblaze和Baby Katie的体细胞组织置于含 2,4一D
中,结果诱导了生根的愈伤,当该愈伤移至含 TDZ
和 GA。的培养基中,3.3 的愈伤长出再生芽。在
Red Sunblaze上,他们证明来源于叶、茎间的外植
体,其器官的发生频率高于来源于节问的,同时
TDZ诱导了R.hybrida,R.chinensis minima的体
细胞发生和器官发生。Ishioka和 Tanimoto(1990)
证明,在 MS培养基中只添加硝酸铵,7O 的外植体
表 1 离体月季体细胞胚状体发生
Table 1 In vitro somatic embryogenesis of roses
“+”为能进行体细胞胚状体发生的诱导;“一”为不能得到完整的再生植株。
“+”as success in induction of somatic embryogenesis l“一 ”as fail to induce plant regeneration.
产生不定芽。Rout等(1991)报道 GA3和 adenine
sulfate加速了再生芽 的产生。van der Salm等
(1996)认为,根是理想的进行诱导体细胞胚或芽器
官再生的外植体,在培养基中用 Gelrite代替琼脂,
非常有利于刺激芽器官的发生。Kintzios等(1999)
认为,以茎为外植体可能更适合于进行芽器官再生
的诱导。
1.7再生植株的生长特性
一 般无菌苗移植到室外的成活率达 8O 以上。
通过芽快繁途径得到的植株或不经愈伤阶段直接起
源于叶、根的植株,生长情况与对照相同,元变异发
生。相反,来源于营养器官的愈伤组织再生的植株
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3期 李美茹等:月季的组织培养和基因转化研究进展 247
存在着 21.7%的变异,外植体若为合子胚的,再生
植株的变异高达 70%,变异性状体现在花瓣的数
量、形状和颜色,植株的生长高度上。在调查的 152
个再生植株中,83个植株在花瓣的数量上与对照不
同,16个植株株高变矮,4个的叶片变圆,12个改变
了花色,33个改变了生长习性和花瓣的数量,4个改
变了花瓣的数量和花的颜色。这么高频率的变异说
明组织培养过程中体细胞变异是产生月季新品种的
有效方法(Li等,2002)。van der Salm等(1996)调
查了解 13个再生植株,发现其中12株的倍性与对
表2 离体月季器官发生
Table 2 In virto organogenesis of roses
“+”为能进行器官的发生的诱导;“一”为不能得到完整的再生植株。
H+”as success in induction of organogenesis)“一”as fail to induce plant regeneration.
照一样都是二倍体,但其中有一株的叶色变为嵌合
色,13株中的 1株为六倍体。一般再生的植株移植
到温室后,约 2~3个月后就能开花。
月季的基因转化研究
Firoozababy等(1991)首次成功地进行了农杆
菌介导的月季转化。他们以R.hybrida CV.Royal一
y为供试材料,将其胚性愈伤与含有 pnos NPT I/
p35S LUC质粒的致瘤农杆菌(Agrobacterium tu—
mefaciens)LBA4404或与含有 pnos NPT I/p35S
GUS质粒的发根农杆菌(Agrobacterium rhizogen-
esis)15834共培养,得到了很高转化愈伤频率,即每
克愈伤约产生 40~60个独立的抗卡那霉素愈伤,通
过 LUC或 GUS和 PCR技术检测,几乎 100%的抗
性愈伤为转化愈性。Firoozabady等(1994)又报道,
1 g愈伤约产生 5O~6O个转化的胚性愈伤系,这些
转化的胚性愈伤转移到成熟培养基后产生转基因植
株,约 100多株转基因植物移植温室,生长正常,能
开花。Mathews等(1994)报道 R.persica×xan-
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248 广 西 植 物 23卷
thina的原生质体与 LBA4404共培养后,产生 GUS
表达的转化愈伤,诱导转化愈伤再生不定芽。van
der Salm等(1996)成功地进行 R.hybrida cv.Mon—
eyway的基因转化,根、茎与致瘤农杆菌 GV3101
(与含有 npt II基因)或与发根农杆菌(含有 rol基
因)共培养,结果得到再生的转基因植株。March—
ant等(1998a)通过基因枪法转化 R.hybrida cv.
Glad Tiding的胚性愈伤的体系,得到转基因株。同
年,Marchant等(1998b)成功地将几丁质酶基因导
入月季,减少黑斑病发生率 13 ~43 。这是目前
唯一的一篇公开发表地将有用基因成功导入月季和
目的基因有效表达的研究论文。Forigene公司曾计
划于 1994年 8月至 1995年 8月向大田投放 150株
转编码查尔酮酶基因的杂交茶香月季植株,计划在
1994年或 1995年的秋天至 1997年年底向大田投
放 1 200株转蓝色基因的月季(Rosa hybrida)植株。
可能由于商业上的秘密,有效的月季转基因方法还
处于保密状态。但不管怎样,成功地进行月季转基
因例子为进一步进行月季品种的改良开拓了广阔的
前景。
3 展 望
综上所述,近年来在月季的组培和转化方面取
得了很大的进展,但从中也可看到,月季的再生受基
因型的影响很大,不同的品种在愈伤诱导、胚状体萌
发及芽器官等的发生方面差异很大,且只有少数的
品种能获得相对高频率的再生植株,并进行基因工
程操作。进一步对一些具有商业价值的月季品种进
行组培再生系统的研究,及应用转基因方法对月季
的花色、花期、鲜切花寿命等进行研究,将有助于不
断满足月季鲜花业的需求,提高月季的商品价值。
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