全 文 ：广 西 植 物 Guihaia 25(2)：149— 15l 2005年 3月
五唇兰种子离体培养的研究
伍成厚l一，叶秀舜 ，梁承邺1
(1．中国科学院华南植物研究所 ，广东广州 510650；2．漳州师范学院生物系，福建漳州 363000)
摘 要：授粉 9O d的五唇兰种子 95 具球形胚，无菌条件下播种于培养基 3个月后种子最高萌发率达到
9O 。ABA和I 浓度的 NH4NO3抑制种子的萌发。NAA和 BA促进种子的萌发，最适浓度为BA 0．2 mg·
L一1+NAA 0．5 mg·L 。400 mg·L 的谷氨酰胺可促进原球茎生长。2000 mg·L 的蛋白胨促进原球茎发
育成苗。
关键词：五唇兰；种子萌发；组织培养
中图分类号：Q943．1 文献标识码：A 文章编号：l UUb 3142(2005)02—0149一O3
In vitro seed lation in Doritis pulcherrima ~ermln l 0 U Cil l l
W U Cheng—hou1一．YE Xiu—Iin ．LIANG Cheng—ye1
(1．South China Institute of Botany，Academia Stntca，Guangzhou 510650，China；2．Dept．of
Biology，Zhangzhou Normal College．Zhangzhou 363000，China)
Abstract：After pollinating for 90 days，Doritis pul chem ima seeds which 95 contain globular embryos were
collected and sowed on medium axenically．After 3 months，the seed germination rate reached 90 ．ABA and
high concentration of NH4 NO3 inhibited the germination．NAA and BA greatly improved the germination and
the combination of BA 0．2 mg·L—and NAA 0．5 mg·L was optima1．G1utamine 400 mg·L made proto—
corms grow well while peptone 20O0 mg·L—promoted the formation of seedlings．
Key words：Doritis pulcherrima；seed germination；tissue culture
五唇兰(Doritis pulcherrima Lind1．)为兰科五
唇兰属植物，是一种产于我国海南和一些东南亚地
区的野生兰(吉占和等，l999)，其花型和株型都相当
好，很有开发应用的前景。Yasugi等(1983)和唐源
江等 (1998)曾报道 了五唇 兰 的胚 胎发 育过程，
Griesbach(1997)对其花呈蓝色突变体的生化基础
进行了研究。近年来由于大量的人工采挖，野生五
唇兰资源急剧减少。因此，对其进行大量繁殖，以使
种质资源得以保存，同时对杂交育成的优良品种进
行大规模的商品化生产十分必要。种子离体培养是
保护兰花野生资源的重要手段之一，而目前对五唇
兰种子培养的研究还很少(张菊野等，l995)。本文
收稿日期：
基金项目：
作者简介：
对五唇兰种子的离体培养进行了研究，为育种及繁
殖工作提供参考。
1 材料与方法
1．1材料
试验材料是产于海南的野生五唇兰，材料从野
外采回后种植在中国科学院华南植物研究所的温室
内，在开花期间进行人工授粉，每个花葶授 2朵花，
剪除花葶的其余部分。授粉后3个月蒴果开始变成
褐色，部分绿色，未开裂，此时种子为棕黄色，已形成
球形胚，番红染色后解剖镜下检查种子胚的发育情
2003—1 2-08 修订日期 ：2004—03—29
国家自然科学基金(30l70061)；广东省重大科技专项(2003A2o10401)；福建省青年科技人才创新基金项目
(2004J052)资助。
伍成厚(1 968一)，男，湖南邵阳人，讲师，博士。从事园林植物遗传育种与生物技术研究。
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l5O 广 西 植 物 2j卷
况，有胚率为95 。 五唇兰种子萌发率的影响情况(图1)。
1．2方法
1．2．1培养基 以 MS培养基(Murashige等，l962)
为基本培养基，并对其 NH NO。浓度进行改良。添
加不同浓度的BA、NAA、椰子汁、蛋白胨、谷氨酰胺
和2．0 9／6的蔗糖和0．8 9／6的琼脂粉，PH值5．5。
1．2．2外植体 采集发育正常的蒴果，以 7O 酒精
表面消毒 l min后置于 5 9／6NaC1O溶液中 l5 rain，
无菌水冲洗 5～6次后在无菌条件下剖开蒴果，取中
部的种子均匀撒播于各种培养基上。
1．2．3种子培养 培养温度26±0．5℃。接种后先
在黑暗中培养 90 d，每个处理随机调查 lOO颗种子，
统计一次种子萌发率。萌发率为萌发种子颗数和有
胚种子颗数的比率，公式为：萌发率一萌发颗数／(调
查颗数×95 )。随后进行光照培养，每 日光照 l2
h、光照度 l 600～2 000 lx，光培养 60 d，统计成苗
率。
2 结果与分析
2．1离体培养时五唇兰种子发育成苗的过程
种子萌发初期在培养基上形成白色点状隆起，
继而膨大形成原球茎(protocorm)，原球茎最初呈卵
形，随着体积的增大，发育成椭圆型、长条形等多种
形状，表面开始形成少量的假根，上端突起形成叶原
基，下端形成根原基。假根保持相当一段时间，大约
在分化出根时才逐渐解体。转入光照培养后，原球
茎继续生长，逐渐变成绿色，首先发育出叶，再发育
出根从而长成小苗(图版 I)。从种子萌发到形成具
有二片幼叶、一条幼根的幼苗共需 l80 d左右。
2．2培养基 NH NO 浓度对五唇兰种子萌发的影响
以 MS为基本培养基，试验了 l／l2MS(137．5
mg·L )、l／8MS(206．3 mg·L )、l／4MS(4l2．5
mg·L )、1／2MS(825．0 mg·L- )和 MS(1650．0
mg·L )共 5个不同的 NH No。浓度对五唇兰种
子萌发的影响(均添加 BA0．2 mg·L一、NAA0．5
mg·I )。结果表明：MS培养基的 NH NO。浓度
(165．0 mg·I )偏 高，五唇 兰种 子的萌发率仅
3O 。随着培养基的 NH NO 浓度降低，五唇兰种
子的萌发率逐渐提高；当培养基的NH NO 浓度降
至l／8MS(206．3 mg·L )时种子的萌发率最高，达
到 9O 。但 NH NO 浓度继续降低种子的萌发率
又会下降。这说明了NH NO 浓度对授粉 90 d的
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2期 伍成厚等：五唇兰种子离体培养的研究 151
汁、400 mg·L- 谷氨酰胺、2 000 mg·L- 蛋白胨对
五唇兰种子的萌发没有明显的影响。五唇兰的原球
茎在培养基不含有机物时成苗困难，400 mg·L。的
谷氨酰胺促进原球茎生长、增大，但对成苗没有促进
作用；2 000 mg·L- 的蛋白胨促进原球茎成苗，而
1O 9／6的椰子汁诱导原球茎基部产生愈伤组织。
3 讨论
张菊野等(1995)报道五唇兰果实需在植株上生
长 10．5个月，其种子在离体培养时才能萌发，而授
粉 6个月果实的种子在各种培养基中均不能萌发。
本试验中五唇兰种子在授粉后 90 d已经含有球形
胚，发育正常的蒴果中有胚种子率达到 95 ，离体
培养时种子萌发率可达到 9O 。五唇兰种子离体
培养对采种时间为什么会有这么大的差异呢?植株
栽培环境温度条件的不同可能是造成这种现象的主
要原因。Yasugi(1983)和唐源江等(1998)曾研究了
五唇兰胚胎发育过程，对于整个胚胎发育时间他们
的试验结果有很大的差异。唐源江等(1998)报道五
唇兰授粉后 45 d形成合子、100 d左右种子形成球
形胚；Yasugi(1983)则报道五唇兰授粉后 6O～65 d
形成合子、9O～210 d为多细胞胚胎发育阶段、210 d
蒴果成熟开裂。因此，五唇兰种子离体培养采果时
间的确定不能完全以授粉后的时间为依据，而是应
以种子内胚的发育程度作为参考标准。
兰花种子萌发过程中需要适量的氮源已成为共
识，自然界兰花种子因与真菌共生获得必要的氮源
才能萌发，在离体培养时低浓度的氮源有利于种子
萌发，而高浓 度 的氮 源则 起 抑制 作 用 (Arditti，
1967)。降低培养基的氮源浓度甚至是香荚兰(1／a—
nila planifolia)种子萌发的一个关键因素(Lugo—
lugo，1955)。在石斛属(Dendrobium)种子萌发试
验中有硝态氮与氨态氮的比率影响种子萌发的报道
(曾宋君等，1998)。本试验的结果表明 MS培养基
的 NH NO． 浓度偏高，不适宜五唇兰种子的萌发，
只有在降低 NH NO 的浓度后才取得理想的培养
结果。在黄花杓兰(Cypripedium flavum)种子离
体过程中也取得类似的结果(黄家林等，2001)。因
此，可以认为 H NO 的浓度对兰科植物的种子萌
发是一个重要的影响因子，低浓度的 H O 可能
有利于兰科植物的种子萌发。
授粉后 90 d五唇兰种子在培养基不加外源激
素时也有一定的萌发率，说明此时种子的抑制物质
尚未形成或含量很低。加入 ABA后种子的萌发受
到抑制，而且即使加入 AA和 BA也不能解除这
种抑制作用。未加入 ABA时 NAA和 BA均能显
著提高五唇种子的萌发率，可见 AA和 BA的作
用不是拮抗 ABA，而是本身具有刺激五唇兰种子萌
发的作用。在黄花杓兰的种子萌发试验中，黄家林
等(2001)曾认为 KT和 BA等细胞分裂素的作用不
是拮抗 ABA，而是本身具有诱导种子萌发的作用。
但他们的试验没有用 ABA进行试验，本文的结果
对这一设想提供了直接的证据。
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