全 文 ：广 西 植 物 Guihaia 25(4)：341— 348 2005年 7月
刺激剂对植物细胞悬浮培养的影响
李 俊，彭正松
(西华师范大学生命科学学院，四川南充 637002)
摘 要：对刺激剂对植物细胞悬浮培养的影响及如何提高刺激剂 的诱导率进行 了综述 。刺激剂对细胞悬浮
培养的影响主要表现为酶活化、蛋白质含量改变、氧进发、细胞程序性死亡、pH值改变、次生代谢产物积累等
防御反应。提高刺激剂对悬浮培养细胞的诱导效率必须优化刺激剂的种类，刺激剂的浓度和加入时间，创建
更好的诱导模式。
关键词 ；刺激剂 ；细胞悬浮培养 ；防御反应 ；次生代谢产物
中图分类号 ：Q943．1 文献标识码：A 文章编号 ：1000—3142(2005)04。0341-08
Influence 0f elicitor 0n cell suspension
cultures 0f plants
LI Jun．PENG Zheng—song
(College of， ife Sciences．China West Normal University，Nanchong 637002，China)
Abstract：Influence of elicitor and how tO enhance inductivity on cel suspension cultures are summarized in
this paper．Defense responses are manifested mainly on cell suspension cultures by elicitor influence，such as
enzyme activation，changes of protein content and pH ，oxidative burst，programmed cell death，accumulation of
secondary metabolites，et a1．Elicitor species，concentration and induction phase，and better induction model are
very important to the improvement of inductivity on cell suspension cultures．
Key words：elicitor；celI suspension culture；defense response；secondary metabolites
植物细胞能合成许多具有重要价值的次生代谢
产物，如皂苷、生物碱、糖苷、木质素等，这些次生产
物可作为香料、毒物、防腐剂、调味剂、农药等。然而
天然植物生长周期长，且生长受地域和环境因素 的
影响，因此直接提取次生代谢产物具有较大的局限
性。植物细胞培养可大规模生产次生产物，已成为
生产高价值产品的重要途径。随着植物组织和细胞
培养技术的发展，细胞悬浮培养 日益完善。如何利
用植物细胞悬浮培养技术生产有用的次生代谢产物
并且提高代谢物的产量是生物学家研究的热点。增
加植物细胞培养物中次生代谢产物产量的方法可通
过改变培养基成分及其浓度、生长调节剂的选择或
基因克隆等手段来实现，此外，利用刺激剂处理植物
悬浮培养细胞以促进细胞快速、大量合成次生代谢
产物已成为人们普遍关注的重要方法之一。
1 概述
植物在遭受外界不 良因素，如生物、非生物入
侵、创伤等胁迫时，植物细胞往往趋于向次生产物合
成的方向转变，产生植物抗毒素，这种能引起植物产
生植物抗毒素和引起植物过敏反应(hypersensitive
reaction，HR，亦称抗性 反应或 自身 防御 反应 self-
defense reaction)的胁迫 因子统称 为刺 激剂。刺激
剂还能诱导其他的防卫反应(如产生水解酶类及可
加厚细胞壁结构的特殊蛋白质，合成抑制病原菌降
收穰 日期 ；2004—03-22 修订 日期 ：2004-09—20
基金项目：四川省重点学科建设项 目资助(SZDO42O)
作者简介：李俊(1979一)．女．四川德阳市人．在读硕士，专业方向：资源植物遗传学。E-mail：l~unnanchong@tom．com
’通讯作 者 E-mail：zspeng(~CWF*U．edu．cn
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解酶的蛋白)。
刺激剂一般分成生物刺激剂 (biotic elicitor)和
非生物刺激剂 (abiotic elicitor)两类 。生物刺激剂
包括多糖类、多肽类 、不饱和脂肪酸和糖 蛋白等；非
生物刺激剂包括紫外线、高温、低温、pH值、乙烯、
重金属盐和高浓度盐等。生物刺激剂从起源来说又
分为内源性刺激剂 (endogenous elicitor)和外源性
刺激 剂 (exogenous elicitor)(Akimoto等 ，1999)。
内源刺激剂主要指来 自植物细胞 的分子，多为植物
细胞壁在微生物作用下 的降解产物(如复杂多糖 、糖
蛋白等)及沉积在细胞壁上的木质素；外源性刺激剂
亦称真菌刺激剂(genuine elicitor)，是指病源微生物
在入侵植物时自身被降解的产物及其代谢产物。目
前应用最多的是真菌刺激剂，根据其结构可分为 4
类：多糖类，糖蛋白类 ，蛋白质类 ，不饱和脂肪酸类。
近年来 ，根据植物对外 界因素所产生的防御反
应，人们尝试用刺激剂协迫植物细胞合成和积累次
生代谢物，取得了一定的成果。如悬钩子(Rubus
idaeus)细胞悬浮培养中以茉莉酮甲酯诱导 24 h可
使悬钩子酮含量增加 2～3倍 (Seshu等，2000)。
Namdeo等(2002)在悬浮培养中用 A．niger，F．mo—
niliforme和 T．viride处理 C．roseus细胞 ，结果发
现，阿马里新的积累量增加了大约三倍 ，最大量达到
了 l66 mug／gDW。
2 刺激剂的作用机理
刺激剂作为一种外界信号被植物细胞膜上的受
体所识别，并与之结合，从而引起细胞膜上及膜内一
系列反应，刺激剂通常是激活植物体内产生过敏反
应时合成代谢途径中关键酶的活性，并诱导活化这
些酶的mRNA的转录，翻译和蛋白质的生物合成，
最终导致植物抗毒素的合成和积累。刺激剂改变酶
活性，引起基因启 动是一个级联过程。这一过程可
能包括 3步。
2．1信号识别
植物细胞膜上存在着识别信号分子的受体(原
初靶位点)，能识别并选择性地结合某种信号分子。
刺激剂作为一种外界信号分子，加入细胞悬浮培养
基后，能被细胞膜上的特异受体识别并与之结合。
Yoshikawa等在 1983年通过HC标记的真菌刺激剂
和直接的膜结合测定的方法，发现 C¨—Mycolamina—
ran的结合位点主要位于质膜上，并且是单一的亲
和位点，说明它们可能参与了大豆毒素的合成的开
始过程，大豆细胞质膜上存在着大豆毒素刺激剂的
特异结合位点。大量实验表明，受体识别是刺激剂
诱导植物防御反应产生的第一步。
2．2信号转导
刺激剂与受体结合后，构型发生改变，从而激活
细胞 内有关酶的活性(如一些还原酶和脱氢酶被 活
化)，并使蛋白质磷酸化。Dixon(1986)认为，细胞
主要通过两条途径传递诱导信号：(1)刺激剂通过细
胞 内吞作用 ，直接作用于核特异基因。(2)诱导物与
受体结合后激活第二信使系统，间接激活核特异基
因。因此，可以推测大多植物是通过内吞或第二信
使系统传递诱导信号的。大量研究表明，常见的第
二信使有 Ca抖、cAMP、G一蛋白、磷酸肌醇、水杨酸
和茉莉酸及甲氧基酯、植物细胞壁组成成分。
2．3防卫基因的表达调控
诱导信号被传递后，激活与抗性相关的基因，使
特异基因转录和翻译，这些基因包括参与苯丙酸生
物合成的酶的基因，编码病原相关蛋白酶及裂解酶
的基因。同时，相应 的 mRNA积 累及相应酶 的增
加，最后产生植物抗毒素类的抗性物质。Pauli等
(1998)证 明茉莉酸类物质是通 过诱导细胞色素
P450基因的表达，从而诱导细胞色素 P450酶的活
性来促进植物次生代谢物的合成。
目前，对刺激剂的作用机理研究还不是很清楚，
但是生物研 究者也 提 出了很 多机理模型。如，
Ca。 一信号传递机制模型：(1)刺激剂与其受体高
度亲合，引起细胞膜活性的改变，即位于细胞膜上的
离子通道改变 ，引起 Ca抖 ，H 内流 ，K ，Cl 外流；
(2)同时迅速发生 H。o。胞内依赖 Ca抖的蛋白质磷
酸化作用，激活细胞 内有关 酶的活性 ；(3)启动核 内
的防御基因，引起防御反应，诱导合成植物抗毒素的
酶合成植物抗毒素。这一机制概括起来包括三点：
膜的变化、酶的变化、基因的启动。
3 刺激剂对植物细胞悬浮培养的影响
当刺激剂加入悬浮培养基中时，植物为了保护
自身免受入侵病原体的感染而诱导防御反应，如：植
物抗毒素的积累，细胞程序性死亡，活性氧的产生，
pH值的改变等，从而使细胞的生理态势和次生代
谢产物的积累量发生改变。
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4期 李 俊等：刺激剂对植物细胞悬浮培养的影响 343
3．1刺激剂对细胞生理态势的影响
李春等(2002)研究 了寡聚糖对红豆杉细胞氧化
还原生理态势的影响。结果表 明，诱导前红豆杉细
胞处于相对稳定 的生 长态势 ，细胞完整 ，细胞器 发
达；氧化还原电势较低，活性氧相关酶系统相对稳
定，细胞初生代谢旺盛，紫杉醇合成速率很低。诱导
后红豆杉细胞向产物合成态势转移，SOD酶活性迅
速提高；细胞出现活性氧进发，4h达最大值；细胞的
氧化还原电势增高，细胞 膜上 离子通道被激活，H
和 Ca 内流，Cl‘外流 ；液胞内出现大量含 Ca 离子
的高电子致密区并呈规律性变化，培养环境碱化；细
胞生长被抑制，紫杉醇合成速率升高，其产量提高了
5．5倍 ，达 76．1 mg／L。
3．1．1膜的改变 刺激剂与细胞膜上的受体结合
后 ，引起膜的通透性增加和流动性改变，并出现细胞
浸润现象。如加入脱乙酰几丁质就可以使植物细胞
膜的通透性得以改变，且其胶化也使植物细胞膜的
流动性降低。
3．1．2蛋白质含量的改 变 刺激剂能引起细胞的代
谢变化，它不仅使细胞积极合成了植物防卫的次生
代谢物质，如植保素、木质素等，同时也启动或加强
了特定的次生代谢途径 ，而这些过程的发生 主要是
通过酶类的调控来实现的，蛋 白质的含量变化正反
映了这些酶类的量变过程 。张长平等(2001)对南方
红豆杉悬浮培养时加入刺激剂真菌尖孢镰刀菌
(Fo)后，蛋 白质的量发生 了明显的变化 ：诱 导组胞
内蛋 白的含量出现 了先高于后低 于对照组的现象 ，
这很可能是细胞膜通透性改变及蛋 白质合成速率发
生变化共同作用的结果。诱导初期，细胞生长速率
相对还仍然较大，因此胞外蛋白质含量呈下降趋势；
而刺激剂的加入一般都会导致细胞生长的停止甚至
死亡，因此在加入刺激剂后 8 h左右胞外蛋白含量
达到低峰；当细胞逐渐进入平稳期时，与各种次生代
谢相关酶相继合成，使胞外蛋白含量平稳上升；诱导
末期，由于诱导作用使细胞的死亡率增大造成胞内
蛋白的外泄，使这种趋势加剧，胞外蛋白含量诱导组
始终高于对照组。
添加 CuC1 诱 导处理 5 d后 ．红 豆杉细胞中可
溶性蛋白质含量为 1．70 mg／g，较对 照 0．25 mg／g
增加 36 ；10 d后，诱导处理较对照降低 ll 。比
较诱导处理 10 d与 5 d时细胞 中可溶性蛋 白质含
量 ，发现诱导处理 10 d时细胞中可溶性蛋 白质含量
较 5 d时下降 26 2／6(李家儒等，1999)。
3．1．3酶活性的改变 刺激剂处理细胞悬浮培养体
系能增加原代谢途径中关键酶的活性，或活化次生
代谢途径中特定酶基因，诱导新酶的形成，从而提高
植物细胞中原来次生代谢物的含量，或合成新的次
生产物，促进目的产物的合成。如紫杉醇的合成途
径中苯丙氨酸解氨酶是桂皮酸途径的定速酶，苯丙
氨酸经PAL氨解生成桂皮酸，桂皮酸经 0氧化和氧
化脱羧作用产生苯甲酸，苯甲酸是紫杉醇 C。 侧链
生物合成 的前体。诱导处理增强红豆杉细胞内
PAL活性 ，促进 细胞 内苯甲酸的形成，从而促进紫
杉醇的合成(Eilert，l987)。
Stab等(1987)研究表明葡聚糖刺激剂促使植
物抗毒素生物合成酶，苯丙氨酸脱氨酶，苯基苯乙烯
酮合成酶活性提高，并且诱导植物抗毒素，大豆抗毒
素的产生。Francesca等(2000)用酵母刺激剂，壳多
糖刺激剂，p一葡聚糖刺激剂，N一乙酰葡糖氨寡聚体刺
激剂 ，麦角淄醇刺激剂处理细胞分裂素活性蛋白激
酶(MAPK)被不同程度活化，并有不同的动态。用
酵母刺激剂处理的苜蓿细胞通过凝胶激酶实验揭示
44和 46 Kda的 MAPKS被快速瞬时的诱导 ，并且
表明酵母 刺激剂 主要活化 46Kda SIMK和 44Kda
MMK3，活化很少的 44Kda MMK2和 SAMK。
Szabo等(1999)用 l0 uM 的 MJ(Methyl ias—
monate)处理悬浮 培养 的 C．blumei细胞 ，发现 MJ
对 PAL，HPPR，RAS，TA四种酶都有明显诱导作
用。其中PAL和 HPPR的活性都比对照组(未加
MJ培养的细胞)增加了 3倍，且 PAL和 HPPR的
活性分别在处理后 12 h和 8 h达到了峰值，但这之
后，PAL和 HPPR的活性都快速降低甚至低于对
照组 ；TAT的活性比对照组的 2O．5O 还高。
3．1．4 pH值的改变 刺激剂一般会诱导细胞培养体
系碱化。植物细胞对 pH具有较强的自我调控能力，
而诱导作用引起了质子的内流，因此推测 pH的改变
很可能是刺激剂对植物细胞独特的诱导机制所致。
刺激剂对细胞进行诱导时，作为一种信号分子，它本
身不能进入细胞内部，只能依靠信号转导途径来调节
细胞的生长、代谢和在环境中的生存能力，而其所需
的能量正是由质子的流动及电化学梯度所提供的。
Wu等(2002)用低能 US处理悬浮培养的人参
细胞，发现培养基中的 pH值随 US的剂量增加而
增加，培养基逐渐碱化，由于 H 内流，胞内 pH值
降低。每一种酶活性均有其最适 pH值范围，刺激
剂处理导致培养基中pH值改变，可能改变细胞内
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某些生物合成相关酶的活性。
3．1．5活性 氧的改 变 活性 氧(active oxygen spe—
cies—AOs)即 O～、OH‘和 H2O2的产生是植物一病
菌相互作用初期最显著 的特征之一 ，是植物细胞受
到刺激剂刺 激后所发生 的很重 要 的一个 防御 反应
(Levine等 ，1994)。所谓氧进发是指细胞 中反应性
氧的快速、短时间大量释放的现象。当刺激剂加入
悬浮培养中时，诱导信号可能经 G蛋 白介导，活化
质膜氧化还原 反应，从 而在细胞 表面迅速产生 的。
产生的活性氧通过脂氧合酶或非酶促方式发生脂质
过氧化。脂质过氧化一方面将膜脂和其它脂类过氧
化改变细胞膜的透性，另一方面也可以通过脂肪酸
的氧化而衍生出许多次生信号 ，启动防卫反应和防
卫基因表达。膜透性 的增加 ，是细胞迈 向过敏性死
亡的第一步，而次生防卫信号的产生，则是某些寄主
植物不亲和互作防卫反应的开始。实验证明，HzO。
可诱导SA的合成，启动细胞壁的交联反应，协调过
敏性细胞死亡 和启动 多种防 卫反应基 因表达
(Hammond—Kossack，1996；Mehdy，1994)。
ESR测定 活性 氧结果显 示 ，经 寡聚糖 处理 3O
min后红豆杉细胞内活性氧开始增加，明显高于对
照组；4 h后出现最大氧进发，细胞出现了强烈的氧
化生理信号；5 h后氧进发强度开始下降，而未处理
的对照组基本上保持在同一水平(李春等，2002)。
过多的活性氧对 细胞是有害的，自由基具有很
强的氧化能力，很不稳定，能持续进行连锁反应，对
许多功能分子有破坏作用。如，自由基能引发蛋白
质、酶、核酸等功能分子的二聚作用和歧化反应而影
响它们的结构和功能，而且二聚作用还能导致 DNA
的损伤。很多研究结果，刺激剂加入到细胞培养体
系后，大量自由基的产生诱发了自由基防御体系中
酶保护系统的显著变化 以实现对细胞 自身的保护。
sOD、CAT、POX等是活性氧和自由基清除的酶系
统 ，维生素 C、维生素 E、类胡萝 卜素、不饱 和脂肪 酸
等为非酶抗氧化剂。SOD能清除超氧物阴离子 自
由基((]r。)，CAT能清除过氧化氢(H。O。)，POX能
清除过氧化氢和脂类氢过氧化物。非酶抗氧化物，
有的可直接与 O～、Hz Oz或 OH’反应；有的可以中
断自由基在膜中的过氧化链而保护细胞膜(Salin，
1987；W ise，1987)。
3．1．6对细胞生长的影响 由于植物抗毒素多具有
毒性 ，一般而言，刺激剂对悬浮培养中细胞的生长有
抑制作用。如欧芹细胞悬浮培养，未加刺激剂的细
胞生长迅速，而加入刺激剂的细胞干重不变，随着刺
激剂的增加，细胞逐渐死亡。细胞生长与刺激剂的
剂量和培养时间有关，如用不同剂量的 US对人参
悬浮培养的细胞进行长短不同时间的处理，发现低
剂量、短时间处理对细胞生长无明显影响；高剂量、
长时间处理细胞活力降低，对细胞生长不利(wu
等，2002)。不过也有报道，人参寡糖素同时诱导西
洋参细胞生长和皂苷积累，延胡索培养物在蜜环菌
诱导下 ，细胞生长和生物碱的积 累是平行的。
3．2刺激剂对次生代谢产物的影响
次生代谢物是植物体代谢的最终产物，由糖类、
脂肪和氨基酸等有机物代谢衍生而来，储存在液泡
或细胞壁 中。吲哚乙酸、赤霉素等植物激素，胡萝 卜
素、花青素等色素 ，奎宁碱 、小檗碱、皂甙等药物以及
橡胶等工业原料，都是重要的次生代谢物质。
Lu等(1987)用来自Fusarium solani的刺激剂
诱导悬浮培养的 cistanche deserticola细胞，结果表
明 海 胆 苷 (echinacoside)，acteoside和 phenyle—
thanoid glycosides(PeGs)三种次生代谢物的含量都
显著提高，鲜重分别为 15、9、57 mg／g。
李家儒等 (1999)用 CuC1。处理红豆杉细胞，得
出，培养基中添加的 CuC1。浓度在 0．5～100 gmol／L
之间时，均能诱导紫杉醇的合成；在 0．5～30 gmol／L
浓度范围内，紫杉醇含量随 CuC1z浓度增加而增加 ；
而对照处理紫杉醇含量为 0，说明不加刺激剂，紫杉
醇合成途径没有开启，Cu。’+作用于红豆杉细胞后，活
化了紫杉醇合成途径，从而促进了紫杉醇的合成。
刺激剂对植物次生代谢的调节有两种方式，一
是诱导新酶的合成，启动新的代谢支路，从而合成新
的次生代谢产物。如曼陀罗(Datura stramonium)
的根可以合成生物碱，经刺激剂处理后，生物碱的合
成受到抑制 ，根中快速积 累大量的倍半萜类次生产
物，表明与生物碱合成有关的酶受到抑制，而与倍半
萜类次生产物合成的新酶出现(Furze等，1991)。
二是增加原代谢途径中关键酶的量，从而提高该次
生产物 的产量 ，如悬 浮培养 的大阿米 (Ammi mcl一
“ )只能形成微量的伞花内酯(umbeliferone)，经
刺激剂处理后，细胞 可以合成 大量的伞花内酯
(Hamerski等 1990)。
4 提高刺激剂作用效果的优化策略
在一定细胞生长时期添加不同的刺激剂是提高
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4期 李 俊等：刺激剂对植物细胞悬浮培养的影响 345
次生代谢产物产量的有效方法，然而，细胞生长和次
生代谢物产量受到多种因素的影响，刺激剂不能发
挥高效的作用，为了提高刺激剂的效率人们做了许
多研究 。
4．1对不同植物 品种使用不同的刺激剂
诱导不同植物的防御反应需要不同的刺激剂，
如花生四烯酸能诱导马铃薯、胡椒产生防御反应，但
对其他的植物无效。大雄疫霉(Phytophthora me—
gasperma)的葡萄糖刺激剂能诱导大豆产生大豆抗
毒素，但对欧芹无效。Heike(1994)认为果胶是橘
叶巴戟中诱导花青素合成的最有效物质。
4．2同一植物不同刺激剂处理效果不同
同一种植物细胞进行悬浮培养时可以运用多种
刺激剂，但是每种刺激剂的诱导效果不同。为了高
效地利用刺激剂，我们必须对同一植物的多种刺激
剂进行选择。Akimoto等(1999)用 CO、OGA 和
AO分别对 C．roseus．L细胞(观察 5 磷酸二酯酶
的变化)和 W．japonica细胞(观察壳多糖酶的变化 )
都进行处理，结果发现，加入 CO后细胞生长受到抑
制，但5 磷酸二酯酶和壳多糖酶的产量高于 AO加
入时；OGA加入后细胞生长也被抑制 ，而两种酶的
含量显著提高。Kim 等(2001)分别用酵母刺激剂
和从 B．cinerea培养液中的真菌刺激剂处理人参细
胞，结果表明，两种刺激剂处理后，2，5一二甲氧一1，4
苯醌的含量都提高了。但是酵母刺激剂处理效果比
真菌刺激剂处理好，酵母刺激剂处理后 2，5一二甲氧一
1，4苯醌的含量为 65．10~g／g(鲜重)，平均浮动为
4．96，真菌刺激剂处理后 2，5一二甲氧一1，4苯醌的含
量为 46．13~g／g(鲜重)，平均浮动为 1O．42。
用7种真菌菌丝体作为诱导因子，其中6种能促
进西洋参悬浮细胞的皂甙合成，尤以匍枝根酶(Rhi—
zzopusstalonifer)作用更明显，皂甙含量可比对照提高
2倍，而浓度为 50 mg／L的人参寡糖素能维持细胞较
好的生长又能提高皂甙含量(谢秋玲等，1998)。
陈永勤等(1999)用不同真菌刺激剂对云南红豆
杉细胞试验。在四种真菌刺激剂中，以含桔青霉菌
丝的处理(Pen1)效果最好，其紫杉醇含量和产量分
别比对照高 l13．2 和 104．O ，达0．035 6 (干细
胞)和5．06 mg／L。其次是灰葡萄孢霉菌，处理后紫
杉醇含量 和产量分 别 比对 照提高 了 58．7 和
51．2 。鲁氏毛霉和灰绿 梨头霉对云南红豆杉悬浮
培养细胞形成紫杉醇的促进作用不显著。虽然桔青
霉菌的培养液也能提高细胞中紫杉醇的含量，但效
果不如有菌丝的显著。
4．3不同细胞培养时期加入刺激剂
细胞培养时期一般包括延迟期，指数期和稳定
期三个时期，在这不同的三个时期加入刺激剂诱导
效果不同。悬浮培养细胞的生长与次生产物积累之
间的相关性具有三种模式：(1)次生产物的积累在细
胞生长的静止期；(2)次生产物的积累高峰在细胞生
长的指数生长期；(3)次生产物的积累和细胞生长是
平行关系。Ramos Valdivia等(1997)研究了刺激剂
处理后不同时期 IPP isomerase活性的改变。诱导
后 12 h，酶活性快速增加达到峰值；在诱导后 72 h
酶活性再次快速增加，达到第二个峰值。
用 Cu抖对红豆杉(Taxus chinensis)悬浮培养细
胞中紫杉醇形成的影响进行了研究。在红豆杉细胞
悬浮培养 2O d即指数生长期末(红豆杉细胞悬浮培
养 O～8 d为延滞期，8～2 d为指数生长期，稳定期为
20~32 d)，加入浓度为 30 tmol／L CuC1z，Cu抖促进
紫杉醇形成的作用最大，诱导效果最好，细胞中紫杉
醇含量为 4．88~tg／g。这表明，在指数生长期末红豆
杉培养细胞对Cu2 诱导处理具有最强的反应能力。
苏湘鄂等(2000)研究了处于不同时相的红豆杉
细胞经诱导后生活力、生物量、紫杉醇含量及几个与
次生代谢有关的生理生化指标的差异，对细胞时相
与次生代谢强度的关系进行了探讨。结果表明，在
细胞培养的第 7天(延迟期)进行诱导，细胞的活力、
POD活性、HzOz、生物量、紫杉醇单位含量均高于
第 14天(对数期)进行诱导，显著高于第 21天(稳定
期)开始诱导。说明在延迟期进行诱导时，细胞对刺
激剂的反应灵敏度较高，次生代谢启动的强度更大，
在延迟期进行诱导能获得较高的紫杉醇生产率。
4．4适度的刺激剂浓度
刺激剂在诱导植物次生产物合成过程中，其活
性与浓度有关。刺激剂浓度效应有两种类型：一种
是反应饱和型，即次生产物的积累随刺激剂浓度增
加而增加，达到最大后稳定；另一种是最适浓度型，
即刺激剂表现出最佳效果具有最适浓度。在植物细
胞悬浮培养中，后者比较常见。用 5种不同浓度的
琼脂糖来考察它对银杏悬浮培养细胞生长及黄酮类
化合物产生的影响，结果表明，加入浓度为 0．01～
0．5 g／L的琼脂糖均能明显地促进细胞生长。琼脂
糖浓度为 0．01 g／L时，细胞生长最快，当琼脂糖浓
度为0．10 g／L时，黄酮含量最高。当琼脂糖浓度达
到 1．0 g／L，既不利于细胞的生长 ，也不利于黄酮的
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累积。可见，在培养基中添加一定浓度的琼脂糖能
够促进银杏悬浮培养细胞 的生 长及黄酮 的累积(杨
林等 ，2002)。
红豆杉细胞培养 时加 入 0．1 mg／L水杨酸，紫
杉醇含量最高可达 6．8 mg／L，而对照组 仅为 1．2
mg／L。当水杨酸的浓度大于 0．1 mg／L时 ，紫杉醇
的含量又呈下降趋势(苗志奇等，2000)。Ketchum
等(1999)在不同培养时间加入不同浓度的茉莉酮酸
甲酯(methyljasmonate)，发现均能促进紫杉醇合
成，只是增加量略有不同。其中，以继代培养 7 d后
加入 100 p．mol／L作 用 效 果 最 为 明显 ，产 量 可达
l4．4 mg／I 。Yukimune等(1996)研究表明在培养
基中加入 100~mol／L茉莉酸甲酯对提高红豆杉培
养细胞紫杉醇的含量最有利。
实验证明在南方红豆杉细胞培养体系中分别加
人 1．0 mmol／L硝酸铈 铵 、0．0l mmol／L硝酸银、
0．1 mg／L花生四烯酸 、0．1 mg／L水杨酸以及 l0．0
mg／L甲基茉莉酮酸最有利于紫杉醇产量的提高
(施中东等，l999)。
4．5刺激剂和其他物质的协同作用
刺激剂和其他物质(如糖类、前提物质、抑制剂
等)的协同作用可充分发挥刺激剂的诱导潜力。晏
琼等(2003)研究 了果糖补料和真菌刺激剂对紫杉醇
合成的协同作用，结果表明，果糖补料与真菌尖孢镰
刀菌(Fo)协同作用对培养体系胞外 pH的影响趋势
与真菌刺激剂单独作用时相似，即培养基发生了明显
的碱化。次生代谢产物一酚类物质在果糖补料与
协同作用下，酚积累量的增加比真菌单独诱导时更显
著，高积累值持续时间更长，紫杉醇的质量浓度也明
显增加，在第 2天出现峰值，最高产量达 81．0 mg／L，
膏腴真菌刺激剂单独作用时的最高产量67．2 rag／L。
Hye等(2001)用酵母刺激剂和 BTH(Benzoth—
iadiazole)的协同作用处理 Parsley细胞，发现协同
作用时迷迭香叶宁酸(Rosmarinic acid简称 RA)的
含量比单独用酵母刺激剂和单独用 BTH处理时含
量提高了 ll。4倍。苗志奇等(2000)通过水杨酸和
硝酸银的配伍诱导，实现了刺激剂之间的协同作用，
获得了39 mg／L的紫杉醇含量，比两个刺激剂单独
作用时的最高含量之和还高出5O 。
Fs和 SA单独处理红豆杉细胞均引起细胞膜
脂过氧化。SA+F。联合处理可以减轻 F5单独处
理细胞所引起的膜脂过氧化程度，较大地提高了过
氧化物酶的活性，红豆杉细胞紫杉醇产量增加，达到
l1．5 mg／L，分别为 F。，SA单独处理和对照组的
1．5倍、2．0倍和 7．5倍。说明协同作用可提高次生
代谢物的产量，可能由于协同作用引起细胞膜脂过
氧化，且与过氧化程度有关(兰文智等，2002)。
生物刺激剂和非生物刺激剂协同也能提高次生
代谢物的产量。Wu等(2003)用 US单独处理红豆
杉悬浮细胞，紫杉醇的含量提高了 1．5～108倍：用
MJ单独处理处理时紫杉醇含量提高了5倍。而用
US和 MJ共同处理时，紫杉醇含量比它们单独处理
时提高 2O ～5O 。
4．6小剂量连续诱导
刺激剂能促进植物细胞合成和积累特定的次生
代谢产物。较低浓度的刺激剂虽对细胞生物量影响
较小，但细胞中次生代谢物单位含量较低。较高浓
度的刺激剂虽然可以增加次生产物的单位含量，但
往往严重抑制细胞 的生长 。因此 ，在不影响甚至提
高诱导效果的前提下，减轻刺激剂对细胞的毒害作
用是刺激剂应用于植物细胞悬浮培养时一个必须考
虑的重要问题。
为了解决这个问题，苏湘鄂等(2002)设计了小
剂量诱导方案，并且比较了小剂量连续诱导与一次
性大剂量加入刺激剂对 H O：含量、生物量及紫杉
醇含量等方面影响的差异。结果表明：小剂量连续
诱导组 HzO：相对含量、生物量及紫杉醇含量都较
一 次性大剂量加入刺激剂组高。前者三个指标的值
分别为 ：l7．6 OD4l0／g、27．84 g／100mL、5．0(1／万
DW)，后者三个指标的值分别为：12O【)4 。／g、24．5l
g／100mL、1．2(1／万 DW )。
综上所述，刺激剂对植物细胞悬浮培养中蛋白
质的改 变，酶活性 的改变 ，pH 改 变，细胞的生长及
次生代谢产物的改变具有很重要的诱导效应。刺激
剂的诱导效应与刺激剂的种类，培养物的种类，植物
材料，刺激剂的浓度，刺激剂加入的时间有很大的关
系。但是，刺激剂的结构和诱导机理还不完善，为了
更好发挥刺激剂的作用，我们还要进一步探讨刺激
剂的结构，作用机理和作用位点，利用各种手段合成
各种高效的刺激剂。如：选择良好的外植体和刺激
剂；利用各种分子生物学方法从植 物悬浮细胞中克
隆出刺激剂诱导表达的基因，并对基因进行测序和
功能鉴定；直接选用第二信使作为刺激剂，不仅经
济，而且可以避免刺激剂受到植物内源酶作用引起
的阻遏剂的产生；完善植物细胞悬浮培养条件，优化
刺激剂与影响悬浮培养的其他因素之间的关系。随
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4期 李 俊等：刺激剂对植物细胞悬浮培养的影响 347
着人们对刺激剂研究的深入，相信刺激剂将在细胞
悬浮培养中发挥越来越大的作用 。
参考文献 ：
苏湘鄂。梅兴国。龚 伟．2002．小剂量连续诱导法提高红豆
杉细胞中紫杉醇含量[J]．生物技术，12(4)：23—24．
谢秋玲。郭 勇．1 998．诱导剂对植物细胞生产次生代谢物的
作用[J]．食品科学，19(10)：7—9．
Akimoto CH．Aoyagi H．Tanaka． 1 999．Endogenous elicitor-
like effects of alginate on physiological activities of plant
cels[J]．Appl Microbiol Biotechnol，52(3)：429—436．
Chen YQ(陈永勤 )，Zhu WH(朱蔚华 )，wu YQ(吴蕴 祺)，et
“ ．1999．Effects of fungus elicitors on taxol production in
suspension cels of了、“I“ yunnanensis(几种真菌诱导子对云
南红豆杉细胞产 生紫杉醇 的影响)[J]．Chinese J Biotech—
nology(生物工程学报)，15(4)：522—524．
Dixon RA．1986．The phytoalexin response：elicitation，signa—
ling and control of host gene expression[J]．Biol Rev，61
(3)：239—291．
Eilert U．1 987．Elicitation：methodology and aspects of appli-
cation[M]．In：Constabel F，Vasil 1K(eds)．Cell Culture and
Somatic Cell Genetics of Plants[M]．NewYork：Aeademie
Press，4：1 53— 188．
Francesca C，Claudia J，Wileo L．et a1．2000．Thomas Boiler。
Heribert Hirt．Differential activation of four specific MAPK
pathways by distinct elicitors[J]．J Biological Chemistry。
275(47)：36 734— 36 740．
Furze JM，Rhodes MJC，Parr AJ，et a1．1 991．Abjiotie factors
elicit sesquiterpenoid phytoalexin production but not alkaloid
production in transformed root cultures of Datura stramoni-
“m[J]．PlantCell Rep．10：111．
Hamerski O，Beier RC，Kneusel RE，eta1．1990．Aeeumulation
of coumarins in elicitor-treated cell suspension culture of
Ammi?n~jM5[J-i．Phytochem．29：1 1 37．
Hammond-Kossack KE，Jones JDG．1996．Resistance gene dependent
plant defense responses[J]．Plant Cell。8(10)：1 773—1 870．
Heike D，Dietrich K．1994．P0lvsaccharides as elicitors for an．
thraquinone synthesis in Morinda citrifolia cultures[J]．J
Agricultural and Food chemistry，42(4)：1 048— 105．
Hye Kyong Kim ，Sei—Ryang Oh，Hyeong—Kyu Lee。eta1．2001．
Benz0thiadiazole enhances the elieitation of rosmarinie acid
production in a suspension culture of Agastache rugosa 0．
Kuntze[J]．Biotechnology Letters，23(1)：55—6o．
Kim CY，Im HW ，Kim HK，et a1．2001．Aeeumulation of 2．5．
dimethoxy一1，4一benz0aulnone in suspension cultures of Pa．
n61x ginseng by a fungal elicitor preparation and a yeast elicitor
prepararion[J]．Appl Microbiol Biotechnol，56：239—242．
Ketehum REB，GibsonDM ，CroteauRB，eta1
．
1999．The kinet．
ics of taxoid accumulation in cel suspension cultures of taxus
following elieitation with methyl jasmonate[J]．Biotechnolo—
gy and Bior譬一 r rz g，62(1)：97— 1O5．
Li JR(李家儒)，Guan ZY(管志勇 )，Liu MX(刘曼西 )。et“1．
1999．Effects of CuZ+on taxol formation in cel cultures 0f
T z“ chinensis(Cu。 对红豆 杉堵养 细胞中 紫杉 醇形成 的
影响)EJ]．J Huazhong Agricul Univ(华中农业大学学
报)，18(2)：11 7—120．
Li C(李 春 )。YuanYJ(元 英 进 )。Ma ZH(马忠 海)，et a1．
2002．Changes of physiological state of suspension cultures
of Taxus chenensis var．mairei induced by olig0saccharide(寡
聚糖诱导悬浮培养红豆杉细胞生理态势的改变)[J]．_，
Chenical Industry and Engineering(化工学报)，53(11)：1
134— 1 138．
Lan WZ(兰文智)。Yu LJ(余龙江)。wu YX(吴元喜)．2002．
Effects of salicylic acid on membrane-lipid peroxidation in—
dueed by fungal elicitor and taxol synthesis in T “ chinen—
sis suspension cel euhures(水杨酸对真菌诱导子诱导红豆
杉悬浮细胞膜脂过氧化和紫杉醇生物合成的影响)[J]．Acta
Bat Boreal—Occident Sin(西北植物学报)，22(1)：78—83．
Levine A，Tenhaken R，Dixon R，et a1．1 994． HzOz from the
oxidative burst orchestrates the plant hypersensitive disease
resistance response[J~．Cel1．79(4)：583—593．
Lu CT，Mei XG．1987．Improvement of phenylethanoid glyeo—
sides by a fungal elicitor in cel suspension culture of
Cistanche deserticola EJ]．Biotechnology Leters，25(1 7)：1
437— 1 439．
Mehdy MC．1994．Active oxygen species in plant defense a—
gainst pathogens[J]．Plant Physiol，105(2)：467—472．
Miao ZQ(苗 志奇 )，Wei ZJ(未 作 君 )，Yuan YJ(元 英 进 )．
2000．Study on the effects of salicylic acid on taxol biosyn-
thesis(水杨酸在紫杉醇生物合成中诱导作用的研究)[J]．
Chinese J Biotechnology(生物工程学报)，16(4)：509—513．
Namdeo A．Patil S，Fulzele DP．2002．1nfluenee of[ungal did—
tors on production of ajmalieine by cel cultures of Catharan-
lhus roseus[J]．B 0￡ 以 o o譬．)rProgress，18(1)：159—162．
Pauli HH。Kutehan TM．1998．Molecular cloning and rune-
tional heterologous expression of two aleles eneodeing(S)-
N—methyleoelau rine 3’-hydroxylase(CYP80B1)。a new
methyl jasmonate inducible eytoehrome P450一dependent
mono-oxygenase of benzyliso quinoline alkaoid biosynthesis
[J]．Plant J，13(6)：793—801．
Ramos Valdiria AC，Heijden R van der，Verpoorte R。et a1．
1997．Elicitor·mediated induction of anthraquinone biosyn-
thesis and regulation of isopentenyl diphosphate isomerase
and farnesyl diphosphate synthase activities in cell suspen—
sion cultures of Cinchona robusta How[J]．Planta，203(2)：
155— 161．
Salin ML．1987．Toxic oxygen species and protective system
soft the chloroplast[J]．Physiol Plant，72：681—689．
Seshu Pedapudi，Chee-Kok Chin，Henrik Pedersen． 2000．Pro．
duetion and elieitation of benzalaeetone and the raspherrv ke—
tone in cell suspension cultures of Rubus idaeus[J]．Bio—
technol Prog，16(3)：346—349．
Shi ZD(施中东)，Wei ZJ(未作君)，Yuan YJ(元英进)．1 999．
Concentration optimization of elicitors on taxol production in
plant cel culture of Taxus chinesis var．mairei(南方红豆杉
细胞培养合成紫杉醇诱导子浓度的优化)EJ]．Nat Product
Research and Development(天 然产物研究与开发)。12(4)：
1S2— 1S6．
Su XE(苏湘鄂)，Mei XG(梅兴国)。Gong w(龚 伟)。et al
维普资讯 http://www.cqvip.com
348 广 西 植 物 25卷
2000．Relationships between the strength of secondary me。
tabolite of taxus cel and cel phase in suspension culture sys。
tem(er豆杉细胞时相与其次生代谢强度的关系)EJ]．Bio-
technology(生物技术)。10(4)：14—16．
Stab MR．Ebel J．1987．Effects of Ca2+ on phytoalexin indue。
tion by fungal elicitor in soybean cels EJ]．Arch Biochen
Biophys．257(2)：416—423．
Szabo E，helen A，Petersen TM．1999．Fungal elicitor prepara。
tion and methyl jasmonate enhance rosmarinic acid accumu-
lation in suspension cultures of Coleus blumei[J]．Plant Cell
Roport。18(6)：485—489．
Wu J，Lin L．2002． Elicitor-like effects of low-energy ultra-
sound on plant(Panax ginseng)cells：induction of plant de。
fense responses and secondary metabolite production[J]．
ApplMicrobiol Biotechno．59(1)：51— 57．
W u J．Lin L．2003．Enhancement of taxol production and re-
lease in Taxus chinensis cell cultures by ultrasound。methyl
jasmonate and in situ solvent extraction~J]．Applied Micro-
biology and B D M D譬 ·62(2—3)：2—3．
W ise RR，AW Naylor． 1 987．ChiUing-enhanced photo oxida。
tion evidence for the role of single toxygen and superoxide in
breakdown of pigments and endogenous antioxidants EJ]．
Plant physiol，83：278—282．
Yang L(杨 林)。Zhou JY(周吉源)．2002．Cell suspension
culture and flavonoids for mation of Ginkgo biloba L．(银杏
细胞悬浮培养及黄酮的产生)[J]．J the CUN(NatSci Edi—
tion)(中央民族大学学报(自然科学版)，11(1)；55-58．
Yan Q(晏 琼)。Yuan YJ(元英进)，Hu ZD(胡宗定)．2003．
Synergistic effects of fructose feeding and fungal elicitor on
Taxus chinesis var．marrei suspension cultures(果糖补料与
真菌诱导对红豆杉细胞悬浮培养体系的协同效应)[J]．
Chemical engineering(化学工程)．31(5)：46—49．
Yukimune Y。Tabata H。Higashi Y．et a1．1996．methyl-jas-
monate induced over production paclitaxel and baecatinⅢ in
Taxus cel suspension culture[J]．Nature Biotecho ，l4
(9)：1 129— 1 132．
ZhangCP(张长平)。Li C(李 春)．Yuan YJ(元英进)。et a1．
200 1．Effects of fungal elicitor on cel status and taxol pro-
ductlon in cells suspension cultures of Taxus chinesis var．
mairei(真菌诱导子对悬浮培养南方红豆杉细胞态势及紫杉
醇合成的影响)EJ]．Chinese J Biotechnology(生物工程学
报)。17(4)：436—440．
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