全 文 ：广 西 植 物 Guihaia 29(5)：673— 677 2009年 9月
苏铁属花粉萌发及保存条件研究
杨泉光1，2，李 楠1 ，李志刚2，林平义 ，罗 斌1
(1．深圳市仙湖植物园 国家苏铁种质资源保护中心，广东 深圳 518004；2．广西大学 农学院，南宁 530005)
摘 要 ：以不同浓度梯度的蔗糖与硼酸组合在不同 pH条件下用悬浮培养法测定德保苏铁 、叉叶苏铁、元江苏
铁和越南篦齿苏铁花粉的活力；将元江苏铁和越南篦齿苏铁花粉分别保存在不同低温、不同湿度的环境中，研
究温度和湿度对保存花粉的影响。结果表明：(1)最适合苏铁属植物花粉萌发的培养液配方为蔗糖(1 ～
2．5 )+硼酸(1()()～500 mg／L)，pH6．o～7．0；(2)在室温下，将苏铁花粉密封保存在有干燥剂的容器中，可存
活 30 d以上；(3)在 0℃条件下，不加干燥剂，花粉可保存 4个月以上 ；(4)用液氮保存后 的越南篦齿苏铁花粉
进行人工授粉，结实率高达 90．3 ，与用新鲜花粉人工授粉的结实率无明显差异；(5)将花粉含水率降低到
15．5％～13．2 后，能在液氮中进行长期保存，表明花粉液氮保存可以作为苏铁花粉长期和超长期保存的方法。
关键词：苏铁 ；花粉 ；萌发 ；保存条件
中图分类号：Q945．6 文献标识码：A 文章编号：i000—3142(2009)05—0673—05
Studies 0n pollen germination
and storage ot【／’ycas sPecles · ■ ●
YANG Quan—Guang1，2，LI Nan ，LI Zhi～Gang2，
LIN Ping-Yi1，LUO Bin1
(1．National Cycad Conseroation center，Shenzhen Fairylake Botanical Garden，Shenzhen 518004，
China；2．College of Agriculture，Guangxi University，Nanning 530005，China)
Abstract：Pollen suspension culture was conducted under combinational conditions of different grades of pH and con—
centrations of sucrose and boric acid to estimate polen viability of Cycas debaoensis，C_bi fida，C．parvulus，C．elonga—
ta．Polen viability of C．parvulus and C．elongata was also estimated after being stored in different temperature and
humidity conditions．The results showed that：(1)the optimal medium for the germination of those eycad’s pollen was
compose of 1 一2．5 sucrose-+-10O一500 mg／I boric acid and pH was in the range of 6．5—7．0；(2)the pollen
stored in a sealed container with desiccant in room temperature was viable up to one month；(3)the pollen being
stored under 0℃ in a container without desiccant could kept its viability over 4 months；(4)through artificial polina—
tion，the seed setting rate of C．elongata could be up to 90．3 by using liquid nitrogen stored polen，which is no re—
markable difference to those of using fresh pollen；(5)the pollen of C．elongata，after stored in liquid nitrogen for peri—
od of time，did not show significant loss of viability after dried to 13．2 一 15．5 of water content and the results in—
dicated that stored in liquid nitrogen can be used as a long term storage measure for cycad polen．
Key words：Cycas；pollen；germination；storage condition
通过人工授粉能大大提高结实率及种子的可育
率(Kiem，1972；Tang，1986a)。但由于雄花开花早
于雌花，所以测定花粉活力，并通过花粉保存，进行
人工授粉，对苏铁繁殖和保护有重要意义。有关苏
铁类植物花粉保存的相关报道较少。Chamberlain
(1926)报道角果铁属(Ceratozamia sp．)的花粉在
收稿日期 ：2008—01—10 修回日期：2009—0卜1 5
基金项目：国家林业局专项基金(2006野生植物保护)[Supported by National Forestry Bureau of China(2006)]
作者简介：杨泉光(1982一)，男，广西南宁市人，硕士研究生，主要研究方向为植物生理生态，(E—mail)yqgsunny@tom．tom。
‘通讯作者(Author for coresp0ndence，E—mail：liandreal963@yahoo．corn．on)
674 广 西 植 物 29卷
自然条件下最多能存活 1个月，Tang(1986b)指出
将苏铁花粉放进有硅胶的玻璃瓶 ，然后保存在家用
冰箱里，一年后花粉仍有部分活力。Osborne等
(1992)等研究了温度、湿度和气体成分对保存非洲
铁属(E c p^ n o )花粉保存的影响。国内迄今
未见苏铁花粉保存的报道。
1 材料与方法
1．1材料来源
实验材料为德保苏铁 (Cyc(Is debaoensis)、叉叶苏
铁(C．micholitzi)、元江苏铁 (C．parvulus)和越南篦
齿苏铁(C elongata)的花粉 ，2007年 4～7月在深圳
市仙湖植物园国家苏铁种质资源保护中心收集 。
1．2花粉生活力检测
本实验采用悬浮培养方法来摸索苏铁花粉的最
适萌发条件，培养液成分为蔗糖和硼酸，配制的蔗糖
浓度分别为：0 、l 、2．5 、5 、l0 、15 、2O ，
硼酸浓度分别为：0、50、i0o、500、1 000 mg／L，pH
分别为：5．5、6．0、6．5、7．0、7．5。将配好的培养液用
玻棒蘸取滴到有凹槽 的载玻 片上 ，用牙签取花粉均
匀撒在液滴上，把载玻片放进垫有湿滤纸的培养皿
里，再放进 3O℃的恒温箱中避光培养，24 h后在 2O
倍显微镜(德国Carl Zeiss公司生产)下观察，随机
取 6个视野统计其萌发率(花粉管长度为花粉直径
2倍以上视为花粉萌发)，最后求平均值(花粉萌发
率一萌发花粉数／花粉总数×100 )。
1．3花粉保存实验设计
1．3．1室温保存 将新鲜花粉分别装进两个叠好的
纸袋内，然后将其中的一袋放进无硅胶的容器中，另
一 袋放进装有硅胶的容器中，放在室温条件下保存，
每隔 5 d或 7 d测 1次萌发率。
1．3．2冰箱保存 取两份新鲜花粉分别装进两个纸
袋内，其 中一份装进无硅胶的容器后放进 0℃冰箱
中保存，另一份装进有硅胶的容器后放进同一个冰
箱中保存，每隔5 d或 7 d测 1次萌发率。
1．3．3液氮保存 (1)花粉干燥预处理：室温下，将
花粉分成若干份称鲜重(Wf)，分装在叠好的锡纸盒
中(7 cm×5 cm×0．8 cm)，然后放进有硅胶的干燥
器(其中硅胶 1．O3 kg，干燥器容积 l0 L)里脱水，脱
水期间用玻棒搅动花粉几次，以后每隔 6 h，称取脱
水后重量，另取一份(鲜质量 wf’)于烘箱内，在 105
℃温度下干燥 48 h至恒质量(Wd)，以此数据换算
各组干燥脱水后的花粉含水量。(2)保存实验处理 ：
将不同含水量的花粉盛入指形 管(指形管盖打小孑L
以免从液氮取出时发生爆炸)，然后用锡纸包住，拴
上细绳(以便从液氮罐中取出)，最后投入液氮中，保
存一星期后测定花粉萌发率。以上用于保存花粉的
器具均经过高压蒸汽灭菌，计算花粉萌发率的方法
均与培养花粉时的计算方法相同，文 中所提到的室
温为 25～3O℃。
1．4人工授粉实验
2007年 7月 22日至 2007年 8月 1日分别用液
氮保存了 24 h的越南篦齿苏铁 (C．elongata)花粉
和新鲜越南篦齿苏铁花粉进行人工授粉，每处理 3
株 ，每株授粉 2次。大孢子叶张开之前的一星期左
右 ，用无纺布将雌球花与外界隔离 ，每次人工授粉之
后立 即将球花包好 ，另外 ，选取 3株雌株 ，在大孢子
叶张开之前用无纺布将整个球花包住，直至授粉期
过后再揭开无纺布，以作对照。2个月左右观察结
实情况并照相 ，种子成熟后 采收种子 ，统计结实率
(结实率一种子数／胚珠数×100 9／6)
1 OO
一 80
斛 60
篓 40 藤
e-
= 20
0 1 2 5 5 10 15 20
蔗糖 Sucrose(％)
图 l 蔗糖浓度对花粉萌发率的影响
Fig．1 Effect of sucrose on the germinability of Cscas pollen
2 结果与分析
2．i不同培养条件对花粉萌发的影响
2．1．1不同蔗糖浓度对花粉 萌发 的影响 在硼酸浓
度为 100 mg／L，蔗糖浓度分别 0 、1 、2．5 、
5 9／6、1O 9／6、15 、2O％，pH6．8的培养液中，培养 24
h后，显微镜观察，统计萌发率(图1)。由图 1可知，
元江苏铁、越南篦齿苏铁和叉叶苏铁的花粉萌发率
达到最大值时的蔗糖浓度为 2．5 ，而德保苏铁的
花粉萌发率在蔗糖浓度为 l 时达到最大值。
2．1．2不同硼酸浓度对花粉萌发的影响 在蔗糖浓
度为 2．5 ，硼酸浓度分别为：0、5O、100、500、l 000
∞ ∞ ∞ 0
5期 杨泉光等 ：苏铁属花粉萌发及保存条件研究 675
mg／L，pH6．8的培养液中，培养 24 h后，显微镜观
察，统计萌发率(图 2)。由图 2可知，除元江苏铁花粉
萌发在硼酸浓度为 500 mg／L达到峰值外，其余 3种
苏铁花粉均在硼酸浓度为 100 rag／L达到萌发峰值。
2．1．3不同 pH对花粉萌发的影响 在蔗糖和硼酸
浓度分别为 2．5 和 100 mg／L，pH 分 别为 5．5、
6．0、6．5、7．0、7． 的培养液中，培养 24 h后 ，显微
镜观察，统计萌发率(图 3)。由图 3可知 ，pH为 6．5
时最适合越南篦齿苏铁和叉叶苏铁的花粉萌发 ，pH
为 7．0时最适合元江苏铁和德保苏铁花粉萌发。
1 00
80
褂曼60
5 4O
嚣
1 2。
。 0
50 1 00 500 1 000
硼酸 Bori c aci d(mg／L)
图 2 硼酸浓度对花粉萌发率的影响
． 2 Effect of boric acid on the germinability of Cscas polen
一
{
鑫
图 3 pH对花粉萌发率的影响
Fig．3 Effect of pH on the germinability of Cycas polen
2．2花粉保存
2．2．1干燥剂对花粉寿命的影响 (1)室温保存 ：每
隔 5 d或 7 d，将分别保存在有干燥剂和无干燥剂容
器中的花粉取 出测萌发率 (图 4、5)。由图 4、5可
知，在室温条件下将花粉保存在有硅胶的容器中能
延长花粉的寿命，在无硅胶情况下，花粉保存 2l d
即无花粉萌发，而在有硅胶情况下保存 花粉，42 d
后仍有 14．43 萌发。(2)低温保存 ：每隔 5 d或 7
d，将分别保存在有干燥剂和无干燥剂容器中的花粉
从0℃冰箱中取出测萌发率(图 6、7)。由图6、7可
知，花粉在 0℃冰箱中，对于是否密封于有硅胶的容
器，其花粉萌发变化相差不大，萌发率都较高，其中元
江苏铁花粉保存了 42 d后，萌发率仍高达 65％以上。
斛
}詈
窦
撑
0 5 10 15 20 25 3O
时间 T}me(d)
图 4 室温下水分对保存元江苏铁花粉萌发率的影响
Fig。4 Effect of storage humidity on the germinability
of Cycas parvulus at room temperatrue
§
黯
堰 三
E
0 7 14 21 28 35 42
时间 Time(d)
图 5 室温下水分对保存越南篦齿
苏铁花粉萌发率的影响
Fig．5 Efect of storage humidity on the germinability
of Cycas elongata at room temperatrue
专
蠢{
0 7 14 21 28 35 42
时间 Time(d)
图 6 0℃条件下水分对保存元江苏铁花粉萌发率的影响
Fig．6 Effect of storage humidity on the germinability
of Cycas parvulus at 0℃
2．2．2保存温度对花粉寿命的影响 将图4、5与图
6、7比较可以看 出，花粉在 0℃冰箱中保存的存活
时问比在放室温条件下的存活时间长。花粉在0℃
冰箱中保存 42 d后，萌发率下降不多。
2．2．3不同花粉含水率对液氮保存花粉的影响 将
经过不同干燥时间处理的花粉放进液氮中保存一星
∞ ∞ ∞ 0
∞ ∞ ∞ ∞ 加 0
∞ ∞ ∞ 如 加 0
叩 ∞ ∞ 如 0
676 广 西 植 物 29卷
期 ，然后取出测花粉萌发率(图 8)。由图 8可知，经
过干燥预处理的花粉放进液氮中保存 ，其萌发率明
显比不经过干燥而直接投入液氮的高。将越南篦齿
苏铁花粉含水率减少至 15％以下后，放进液氮中保
存，其萌发率几乎与初始萌发率一样。
脚
!
怪
鑫 !
图 7 0℃条件下水分对保存越南篦齿
苏铁花粉萌发率的影响
Fig．7 Efect of storage humidity on the germinability
of Cycas elongata at 0C
一 初始萌发率 口 保存后葫 发率
0 6 1 2 1 8 24 30
干燥时间 Dehyd rat i on per i ods(h)
图 8 水分对液氮保存越南篦齿苏铁花粉萌发率的影响
Fig．8 Effect of moisture on the germinability of
Cycas elongata pollen after storing in liquid nitrogen
2．3人工授粉
2007年 9月 28日初步观察结实情况(图版 I：
l、2、3)，用液氮保存后的花粉进行人工授粉结实情
况与新鲜花粉授粉的结实无明显差别。2007年 12
月 15日采收种子，统计结实率(表 1)，从表 l可以
看出分别用液氮保存的花粉和新鲜花粉人工授粉的
图版 I 液氮保存后的花粉与新鲜花粉人工授粉的结实情况 1．液氮保存花粉后人工授粉；2．新鲜花粉人工授粉；3．无纺布
掩盖排除风和昆虫传粉。
Plate I Seed set after conducting hand—pollinating to different female cones by using cryostoraged pollen and fresh
pollen respectively 1．Hand polinated by using eryostoraged polen；2．Hand polinated by using fresh polen；3．Excluding both air—
borne and insects by covering cone with non—woven．
平均结实率都在 9O 以上，远比对照株结实率高，
经过方差分析，两者的结实率差异不显著。
在进行花粉培养和保存实验时，出现同一种苏
铁花粉的初始萌发率有差异(图4、6)。同是元江苏
铁，但花粉初始萌发率相差较大，主要是因为实验时
分不同批次收集花粉，所以初始萌发率有差异，这并
不影响实验结果。
3 结论与讨论
上述结果表明，四种苏铁花粉培养液中，适合的
蔗糖浓度比较低，为 1 ～5 ，据 Osborn等(1992)
报道，Encerphalartos woodi花粉培养的最适蔗糖
浓度为 1O 9／6，Burke等 (2002)等培养棉花花粉所需
的蔗糖浓度为 25％。本研究四种苏铁属植物花粉
在蔗糖浓度为 l0 以上的培养液中萌发率极低，甚
至无萌发。另外，James等(1963)对 39科的 86种
植物花粉的研究表明，钙离子在花粉萌发和花粉管
伸长过程中是必要的，夏快飞等(2005)认为钙是高
等植物中普遍存在的一种信号转导分子，至于钙离
子在苏铁花粉萌发中的作用如何有待研究。
在室温条件下将花粉保存于有干燥剂的密封容
器中比暴露在空气中的花粉存活时间长；在 0℃条
件下两者的存活时间相差不明显，这与 Osborne等
(1992)报道 的结果类似，而 Tang(1986b)认为，将花
粉放进硅胶后，再放进冰箱中的保存效果好。将花
一 [0 co0 m^
胖 姐娶
∞ 5 0
∞ ∞ 加 0
一琶 ∞ L co ∞uIEJa0
雠 般弈格
5期 杨泉光等：苏铁属花粉萌发及保存条件研究 677
粉保存在干燥剂中，由于部分失水而降低代谢活动，
使得花粉能够存活较长时间。保存植物种子前进行
晒种，最主要的 目的也是降低种子水分从而降低代
谢活动，将花粉放进干燥剂 中保存 以及保存前进行
干燥与晒种的目的是一样 的。前述诸作者的不同结
果可能原于失水程度的差异 。
将花粉放进 0℃冰箱中保存 1～2个月能达到
较好的保存效果 ，Osborne等(1992)等报道非洲铁
属(Encephalartos)花粉在 0℃条件下保存两年后
仍有 50 萌发 ，本实验在 4月 20日从苏铁 中心收
集元江苏铁花粉直接保存在 0℃冰箱中，到当年 9
月 18日仍有 85 萌发 ，几乎与初始萌发率相等。
表 1 人工授粉结实情况
Table 1 The seed set after conducting artificial pollination
注：处理1为液氮保存后的花粉人工授粉；处理2为新鲜花粉人工授粉；处理 3为隔离对照。不同字母表示差异显著，显著水平为分别为 P
< 0．05，P<0．01。
用液氮保存花粉时，不经过干燥处理的花粉萌
发率最低，将越南篦齿苏铁花粉干燥 6 h以上之后，
其含水率由27．4 9，5降至 l5 9／6以下，液氮保存能达到
较好的保存效果。如果将含水量较高的花粉直接投
入液氮中，由于温度急剧降低使得花粉胞间结冰受
伤害而丧失活力。刚从室外收集的苏铁花粉含水量
一 般为 2O ～3O％，这样含水量的花粉直接保存在
普通低温条件其萌发率下降不多，但直接保存在液
氮中就会使大量花粉丧失活力。所以液氮保存前，
花粉干燥预处理是必要的。本实验表明，苏铁花粉
经干燥预处理 ，花粉含水率降至 15 以下 ，投入液
氮保存，其萌发率基本不变，表明利用超低温保存技
术可以长期和超长期保存苏铁花粉。
另外，在 0℃冰箱中保存元江苏铁花粉时发现
经过保存后萌发率比新鲜花粉高，一种较合理的解
释是花粉在散粉过程中有段生理后熟过程或者是冷
冻过程中引起某些基本必需养分元素释放(Pohito&
Luza，1988)。有些花粉在保存过程中，萌发率出现时
高时低波动现象，Osborne等(1992)对此的猜想是生
物钟机理控制休眠与活动交替变化的信号所致。
苏铁花粉短期保存之后进行人工授粉可获得大
量种子 ，从而弥补因花期不遇造成 自然授粉率和结
实率低，最终导致 自然繁殖能力下降的缺点。本文
推荐的 0℃冰箱在研究和生产单位都容易找到，适
合推广应用。
液氮保存花粉后，仍保持较高的萌发率。利用
液氮保存后的花粉进行了人工授粉实验，结实率高
达 90 以上，与新鲜花粉授粉的结果差别不大，而
未经过人工授粉的隔离植株结实率不到 2 。唐安
军等(2007)认为超低温保存顽拗性种子种质是最理
想的方法，本实验也证明了液氮(超低温)也能长期
保存苏铁花粉，这对保存苏铁种质资源有重要意义。
致谢 本试验是在深圳市仙湖植物园完成，从试
验的取材与构思到论文的撰写得到 中国科学院北京
植物所白克智研究员的指导，英文写作也得到了焦根
林博士的指导，在此表示衷心的感谢。
参考文献：
Burke JJ，Velten J，Oliver MJ．2004．In Vitro Analysis of Cotton
Polen Germination[J]．Agronomyjourna1．96：359—368
Chamberlain CJ．1926．Hybrids in cycacls[J]．Bot Gaz．81：401-408
James L。Brewbaker，Beyoung HK． 1963． The essential role of
calcium ion in polen germination and polen tube growth[J]．A—
M rJ Bot，50(9)：859
Kiem SC．1972．Polination of Cycads[J]．Fairchild Trop Gdn
Bull，27：13— 19
Osborne R，Robbe~se PJ。Claasen ML 1992．The longevity of cy—
cad polen in storage[J]．South African J Bot，58(4)：250-254
Pohito V。Luz，山 1 988，Low temperature storage of pistachio pollen
[J]．Euphytica，39：265—269
Tang W．1986a．Polinating cycad[J]．J Cycad Sotiety South
Africa，8：16—19
Tang W．1986b．Colection and storing polen[J3．J Cycad Society
South A，rica，7：4—6
Tang AJ(唐安军)，Long CL(龙春林)．2007．Cryopreservation of
recalcitrant seed germplasm(低温保存技术在顽拗性种子种质
保存中的利用)[1]．Guihaia(广西植物)，27(5)：759—764
Xia KF(夏快飞)，Liang CY(梁承邺)，Ye XL(叶秀 )．2005．
Study on calmodulin and calmodulin- related proteins in plant
cells(钙调素及钙离子相关蛋 白在植物细胞 中的研究进展)
[J]．Guihaia(广西植物)，25(3)：269—273