全 文 ：广 西 植 物 Guihaia 28(6)：795—799 2008年 11月
岩黄连细胞生长与营养物质消耗的动态学研究
程 华 一，熊 斌1，余龙江3
(1．湖北中烟工业有 限责任公司 技术研发中心，武汉 430051；2．武汉科技大学 医学院，
武汉 430065；3．华中科技大学 生命科学与技术学院，武汉 430074)
摘 要：在岩黄连细胞悬浮培养过程中，对培养液 pH值 ，碳源 、氮源和磷酸盐含量 ，以及细胞生物量和生物碱
含量进行测定，分析其动态变化过程。结果显示培养液 pH值在培养初期降低，后逐渐升高；碳源在培养过程
中逐渐被利用，磷酸盐和氮源在培养中期几乎耗尽，其中磷酸盐的消耗速率最快；悬浮细胞的生长周期为 20 d
左右，第 l8天细胞鲜重和干重达最大，而第21天脱氢卡维丁和小檗碱的含量最高，分别为 8．22 mg／L和4．31
mg／L。结果表明营养物质(碳、氮和磷)的吸收与细胞生长以及生物碱的合成密切相关 ，营养元素的相对消耗
速率为磷>氮>碳，推测氮和磷是影响岩黄连细胞培养的主要因素。
关键词：细胞培养；岩黄连；脱氢卡维丁
中图分类号：Q945 文献标识码：A 文章编号 ：1000—3142(2008)06-0795-05
Studies on the kinetics of cell growth and nutrient
consumption in cell suspension cultures
of Corydalis saxicola
CHENG Hua 一，XIONG BinI，YU Long-Jiang0
(1．Technical Research& Development Center，China Tobaco Hubei Industrial Co．Ltd．，Wuhan 430051，China；2．Medical
College，Wuhan University of Science and Technology，Wuhan 430065，China；3．College of Life Science and
Technology，Huazhong University of Science and Technology，Wuhan 430074，China)
Abstract：The kinetics of cel growth and nutrient consumption were investigated in cel suspension cultures of Co—
rydalis saxicola．The results showed that the pH value decreased during the e~rly period of cultivation and increased
later．Total carbohydrate and nitrate were assimilated gradualy throughout the growth period，and the absorption of
phosphate was the fastest．The growth period of eel suspension cultures was around 20 days with the highest dry
weigh and fresh weight of biomass on day 18．However，the highest contents of alkaloids were obtained on day 21，
with 8．22 mg／L of dehydrocavidine and 4．31 mg／L of berberine．These obtained results indicated that nutrient con—
sumption was deeply related tO cell growth and biosynthesis of alkaloids in eel suspension cultures of C．saxicola．
Phosphate was absorbed fastest，followed by nitrate and carbohydrate．It was suggested that phosphate and nitrate
were the main compounds，which had effects on cell suspension cultures of C．saxicola．
Key words：cell suspension culture；Corydalis saxicola；dehydrocavidine
岩黄连(Corydalis saxicola)，紫堇科紫堇属植
物，多年生草本(文和群等，1993a)。全草含脱氢卡
维丁(dehydrocavidine)、小檗碱(berberine)等多种
活性生物碱成分(柯珉珉等，1982)；是桂西北山区常
用于消炎止痛、排毒，治疗急慢性肝炎和肝硬化等疾
病的一种中草药(何金祥，2003；蒋水元等，2002)。
岩黄连野生资源少，属于石山特有种(文和群等，
1993b)，被列人中国南部石灰岩濒危植物名录(文
和群等，1993a)。目前制成岩黄连总生物碱的注射
液和片剂，临床主治肝炎，疗效较佳，特别是乙型肝
收稿日期 ：2007—04-01 修回 日期：2007—12—28
作者简介：程华(1978一)，男 ，湖北应城人，博士 ，从事植物生理生化与天然产物方面研究 ，(E-mail)hbchh2008@163．corn。
。通讯作者(Author for corespondence，E—mail：yulongjiang@bust．edu．cn)
796 广 西 植 物 28卷
炎、肝硬化、肝癌等 (柯珉珉等，1982；蒋水元等，
2002；何金祥，2003)。由于岩黄连巨大的经济价值，
引起人们大量采挖和收购，导致岩黄连资源匮乏。
因此，有必要考虑开发其他途径来获得更多的岩黄
连资源，维持其可持续开发利用。
植物细胞培养是利用现代生物技术开发植物资
源的重要手 段之 一 (Yang等 ，2001；Ramachandra
等，2002；Cheng等，2006)。如能实现岩黄连细胞的
大规模培养，将为解决岩黄连资源短缺提供新的方
法。我们已经建立岩黄连的细胞悬浮培养体系，并
确定其中含有脱氢卡维丁、小檗碱等活性生物碱成
分(Cheng等，2006)。由于培养细胞中岩黄连生物
碱的含量低以及细胞的增值速度较慢，利用岩黄连
细胞培养生产岩黄连生物碱的研究进展缓慢。为了
提高岩黄连细胞生物碱的含量，找到细胞增殖缓慢
的原因，必需了解在悬浮培养过程中的细胞生长和
生物碱的合成情况，以及营养物质消耗的动态变化，
这对于培养过程控制、优化和放大必不可少。依此
作为理论基础，才能设计出适合岩黄连细胞快速增
殖的营养水平，合理调整培养基的组成结构，为岩黄
连细胞的放大培养奠定基础。本文主要研究了悬浮
培养过程中岩黄连细胞的生长、生物碱合成以及 主
要营养物质消耗的动态特性。
1 材料与方法
1．1实验材料
岩黄连悬浮细胞系的建立和培养条件参考文献
(Cheng等，2006)。培养基为改 良的 B5(Gamborg)
培养液，添加 0．5 mg／L 2，4一D，2 mg／L BA，30 g／L
蔗糖。使用 250 mL三角瓶，分装 8O mL培养液进
行摇瓶培养，接种量 10 (W／V)。于 25℃，13O r／
min摇床培养。
1．2 pH值的测定
采用 PHS一2C酸度计(t-海梅特勒一托利多仪器
有限公司)测定。
1．3糖的测定
还原糖含量测定：吸取 1 mL适当稀释的培养
液，加入 0．5 mL DNS。混匀后沸水浴 中加热 5
rain，测定在 520 nm处的吸光值，从标准曲线中计
算还原糖含量。总糖含量测定：将 1 mL适当稀释
的培养液置于试管中，加入 1 mL 6 mol／L盐酸，在
沸水中消化 10 rain，立即用冷水冷却，加入 2滴酚
酞试剂，用 10 氢氧化钠滴定至微红，定容到 1O
mL。再用 DNS法测定其中的还原糖。利用公式换
算成总糖含量。总糖一样品水解后还原糖 mg数×
样品稀释倍数／样品重量。蔗糖含量测定：吸取 1
mL适当稀释的培养液于试管中，加入 0．1 mL 2
mol／L氢氧化钠溶液，在沸水中加热 10 rain(盖住
试管口)，破坏其中的还原糖，立即冷却至室温，加入
1 mL问苯二酚溶液，3 mL 10 mol／L盐酸 ，摇匀后
放入 8O℃水浴中加热 8 rain，冷却后于 500 nm处
测定吸光值。根据标准曲线计算蔗糖含量。
1．4磷酸盐的测定
用磷钼蓝显色法测定磷酸根离子(无机磷)含量。
测定时吸取 1 mL适当稀释的培养液于试管中，加入
2 mL水和 3 mL定磷试剂，立即混匀，于45℃水浴中
加热 25 min，取出冷却至室温，测定 660 nm处的吸光
值。根据标准曲线计算磷酸盐含量。
1．5硝酸盐测定
吸取 1 mL适当稀释的培养液，加入 1 乙酸和
0．8 mol／L的乙酸钠 4．0 mL，摇匀后，加入 20 mg
锌粉，摇动20 rain，过滤，取滤液 4 mL，加入 1 mL a一
萘胺一磺胺试剂，摇匀 10 rain后，测定 540 nm处的
吸光值。根据标准曲线计算硝酸盐的含量。
1．6铵盐测定
吸取 2 mL适当稀释的培养液，加 3 mL茚三酮
试剂，0．1 mL 1 的抗坏血酸，混匀。盖上漏斗或球
形盖，沸水浴 15 rain，试管从水中取出后，间歇搅拌
并于空气中冷却 15 rain。加热形成的红色茚满酮
在冷却和氧化而退色，得到茚三酮与氨基酸的蓝紫
色反应产物，在 580 nm下测定吸光值。
1．7细胞生长的检测
用布氏漏斗真空抽滤后收集培养液作下一步的
分析，得到的细胞用多倍体积蒸馏水充分洗涤，抽干
后称取细胞湿重，然后于 5O℃烘箱中烘至恒重，冷
却后称取于重。以培养基中的干重作为细胞生长的
依据。
1．8总生物碱含量测定
参考 Cheng等(2006)的方法。将烘干的细胞
研磨成粉次，精确称取 100 mg细胞和叶样品，加 5
mL 75 乙醇(含 1 盐酸)，室温下超声提取 3次，
每次 I h，过滤去沉淀，滤液用氨水调至 pH9．0，然
后用 5 mL氯仿萃取 3次，加少量无水硫酸钠，过
滤，滤液加热蒸干，加入 0．1 mL甲醇溶解备用。取
5 mL培养液，氨水调 pH值为 9．0，然后用 5 mL氯
6期 程华等：岩黄连细胞生长与营养物质消耗的动态学研究 797
仿萃取 3次，合并有机相，加少量无水硫酸钠，过滤，
滤液加热蒸干，加入适量甲醇溶解备用。上样前过
0．45 m滤膜，取 1O L上样，采用 Waters 510液
相色谱仪，C18柱(Dikraa Diamonsil，5 m，250 iTlm
×4．6 mm)，流动相为乙腈 ：水(40：60)，每升流动
相加 3．4 g磷酸二氢钾和 1．7 g SDS，检测波长 345
nlTl，流速 1 mL／min，柱 温：室温，灵敏 度：0．08
AUFS。样品中生物碱含量包括细胞和培养液中的
生物碱含量。
2 结果与分析
2．1培养过程中培养液 pH值的变化
在培养过程中，培养液 pH值在 5．O～7．0范围
内波动，呈先降后升的变化，即先短期上升，然后下
降，至 10 d后再慢慢上升(图 1)。
2．2培养液中的糖浓度变化
由图 2可以看出，总糖浓度在整个培养过程中
逐渐降低，开始 6 d，下降缓慢，6 d后，含量下降迅
速，直至降低为 0。蔗糖浓度在培养的前 10 d急剧
降低，10 d后，在培养液中已几乎检测不到蔗糖。
还原糖的浓度在培养的初期逐渐升高，第 9 d最高，
之后迅速降低，至培养末期降低为 0。
2．3培养过程中培养液的含氮盐消耗
图 3为培养液中硝酸盐和氨盐浓度变化曲线。
氨盐代谢的相对速度( )比硝酸盐代谢的相对速度
快，至9 d左右消耗殆尽。而硝酸盐浓度在培养的
前 12 d下降较快，之后逐渐被消耗完全。
2．4培养过程中培养液磷酸盐消耗
如图4所示，磷酸盐浓度在培养的初期(前 6 d)
急剧降低，表明磷酸盐已经大部分被吸收。之后磷
酸盐逐渐被消耗完全 。
2．5培养过程中岩黄连细胞生长
岩黄连细胞悬浮培养的生长周期为 2O d左右，
细胞鲜重和干重增长的时间曲线相似(图5)。在培
养的前 6 d，细胞生长缓慢，有明显的延迟期，之后，
生物量迅速增长，为指数生长期，第 18 d鲜重和干
重都达到最高值。与培养初期相比，细胞鲜重增长
了3倍左右，干重提高了5倍左右。18 d后，细胞生
物量趋于稳定，进入稳定期。
2．6培养过程中生物碱合成
图 6显示岩黄连细胞悬浮培养过程中主要生物
碱的合成情况。脱氢卡维丁在培养前 6 d合成缓
d：
I豇
语
O 5 10 15 20 25
培养时间 0uIture time(d)
图 1 培养液的 pH值变化
Fig．1 Time course of pH value in liquid medium．
Values are means of three independent cultures．
Error bars represent士 S．D．The same below．
莹
0 5 1O 15 2O 25
培养时间 Time(d)
图 2 培养液中糖代谢曲线
Fig．2 Sugar metabolic curves in liquid medium
》
量
宝
三’
莹
8
寻
一
C
图 3 培养基中硝酸盐和氨盐代谢曲线
Fig．3 The metabolic curves of nitrate and
ammonium in liquid medium
筠车
河
慢，之后含量迅速增加，到第 21天达到最高，8．22
mg／L。小檗碱的含量变化与脱氢卡维丁相似，但增
长比较缓慢，也在第 21天达到最高值，4．31 mg／L。
在培养过程中，脱氢卡维丁的含量较小檗碱的含量
高，合成速度也较小檗碱快。
3 讨论
在植物细胞悬浮培养过程中，培养液的 pH值
8 7 6 5 4 3 2
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798 广 西 植 物 28卷
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0 5 10 1 5 20 25
培养时间 0uIture time (d)
图 4 培养基中磷酸盐消耗曲线
Fig．4 The metabolic curves of phosphate
in liquid medium
图 5 岩黄连细胞生长曲线
Fig．5 The growth curves of C．saxicola
suspension—cultured cels
0 5 10 15 20 25
培养时间 0uIture tifle(d)
图 6 悬浮培养中生物碱合成曲线
Fig．6 Time courses of alkaloid production
in C．saxicola suspension cultures
会随着培养时间出现波动性变化。在本实验中，培
养液 pH值在 5．0～7．0之间变化，先降后升。一般
认为，培养早期出现 pH下降与植物细胞吸收培养
基中的NH 有关，其结果为细胞水解蔗糖所需的
某些酸性水解酶提供适宜的环境(候学文等，2001)。
另外，细胞在生长过程中，能对周围环境 pH值进行
细微调节，使保持在一个恒定的外环境中，以利于细
胞 自身的生长代谢。
蔗糖是本实验培养基中的主要碳源供给体。随
着细胞的生长，蔗糖逐渐被消耗，在延迟期，蔗糖消
耗较慢，进入快速生长期培养液中蔗糖基本被水解
完全(图2)，为细胞的增殖提供大量能量。在开始
培养的初期，可以检测到一定量的葡萄糖，这主要是
由于培养基在高压灭菌时部分蔗糖被水解。灭菌过
程中通常会有 15 ～2O 9／6的蔗糖水解为葡萄糖与
果糖。本实验中总糖含量在培养末期才被消耗尽
(图2)，表明添加 3 蔗糖足以维持岩黄连细胞生长
一 代时所需碳源。蔗糖在培养基中不仅起着碳源供
给作用，还有维持培养基渗透压的作用，蔗糖浓度过
低，不足以满足细胞生长、发育、代谢和维持渗透压
的要求；浓度过高，渗透压高，不利于细胞生长，同时
也不利于降低生产成本(张美萍等，2003)。细胞培
养体系中碳源的消耗因植物种类、培养方式和生长
状态的不同而有所差别，如候学文等(1999)在研究
玫瑰茄细胞悬浮培养时，发现蔗糖第 4天就全部分
解为葡萄糖和果糖，第 16天葡萄糖和果糖全部被吸
收利用，之后细胞因无碳源供给而生长受阻。
B5培养基中的氮源主要为硝态氮(N0 )和铵
态氮(NH )。在本实验中，铵态氮的浓度下降速
度明显超过硝态氮的浓度下降速度(图 3)，表明岩
黄连细胞优先吸收铵态氮。氮源对植物细胞的生长
和次生代谢的合成也是必不可少的(Akita等，
2000)，从利用难易上来说，植物细胞一般优先利用
NH ，随后在利用 NO7。磷可参与糖代谢和能量
代谢中的许多重要中间产物，如 6-p一葡萄糖、6-p一果
糖以及 ATP等。如果磷酸盐浓度过低，会导致细
胞中糖代谢水平降低，影响糖的吸收。本实验中，岩
黄连细胞对磷酸盐的吸收非常快速(图 4)。Ashi—
hara等(1985)研究了磷酸盐限制和非限制下，长春
花细胞的初级代谢，发现磷酸盐被快速吸收，参与合
成核苷酸、DNA、RNA、磷酸化糖及蛋白质等。细胞
内磷酸盐的积累水平对植物细胞生长及培养周期有
重要调节作用，积累水平的不同是引起细胞生理状
况发生变化的重要原因。姜绍通等(2006)研究发现
磷是霍山石斛类原球茎细胞悬浮生长的限制性因
素，提高磷的起始浓度有利于多糖产物的积累。
在岩黄连细胞悬浮培养过程中，碳、氮、磷元素
的吸收与细胞生长以及生物碱的合成密切相关。延
迟期，营养物质消耗缓慢，细胞生长缓慢，生物碱含
量低；进入快速生长期后，营养成分快速被吸收，为
细胞生长代谢提供能量和物质基础，生物碱的含量
快速升高。到生长后期，由于营养植物消耗殆尽，细
∞ 加 ∞ 0
—1／ 5 ∞ 00 o
蔗 甾替 (]／暑一 aM 口
6期 程华等：岩黄连细胞生长与营养物质消耗的动态学研究 799
胞生长受阻，生物量出现缓慢下降，生物碱的合成也
随之降低。比较岩黄连细胞悬浮培养过程中，大量
元素的相对消耗速率，发现磷>氮>碳，在大量元素
中无机磷消耗最快，其中氮和磷在细胞进人快速生
长中期几乎耗尽，提示氮和磷可能是影响岩黄连细
胞培养的主要营养因素。张美萍等(2003)在西洋参
悬浮细胞培养研究中也发现磷酸根消耗最快，氮源
消耗次之。郭志刚等(2002)在研究紫杉细胞悬浮培
养过程中，得到了相似的结果，认为氮、磷和钾是影
响紫杉细胞培养的主要营养因素。
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