全 文 ：广 西 植 物 Guihaia 29(4)：502— 505 2009年 7月
Cd2+胁迫下浮萍叶细胞核超微结构、nDNA
损伤及抗氧化酶系的变化
王如平1，解凯彬2 ，徐 楠2，徐勤松2，施国新2
(1．扬州环境资源职业技术学院，江苏 扬州 225002；2．南京师范大学 生命科学学院，南京 210046)
摘 要：以不同浓度Cd +处理6 d的浮萍为材料，从细胞核超微结构损伤、nDNA一级结构变化及抗氧化酶
系活性改变等方面分析重金属的植物毒理学效应。透射电镜观察发现，5～7 mg／L CdZ+处理的细胞核膜完
整，染色质凝聚并趋边化；10 mg／L Cd +处理后则核仁解体，且 DNA原位末端标记(TUNEL)检测发现 DNA
的 3 一OH断端可被特异标记 ，表现出典型的凋亡细胞特征。而 20 mg／L CdZ+已导致细胞坏死。同时，较低浓
度的 Cd +胁迫可刺激抗氧化酶(S0D，POD，CAT)活性升高，以清除体内活性氧，而随金属浓度的进一步增
高，三种抗氧化酶活性都急速下降。研究发现，活性氧和抗氧化酶系密切参与了重金属 CdZ+诱导的浮萍体细
胞凋亡过程。
关键词 ：CdZ+；浮萍；超微结构 ；nDNA损伤；抗氧化酶 ；TUNEL
中图分类号：Q945．78 文献标识码 ：A 文章编号：1000—3142(2009)04—0502—04
Changes 0f nuclear ultrastructure，nDNA
l - ● l · ● ’ n
and antioxidan t el Y ln leaves 0t
mil,or induced by Cd2+Lemna l
Ⅵ NG Ru-Ping1，XIE Kai-Bin2 ，XU Nan2，
XU Qin-Song ，SHI Guo-Xin2
(1．YangzhouVocational Colege of Enviroment and Resources，Yangzhou 225002，China；
2．College of Li Science，Nanjing Normal University．Naming 210046，China)
Abstract：Damage tO nuclear DNA and ultrastructure and changes of antioxidant enzymes in leaves of Lemna minor
grown in different Cdz+concentration gradient for 6 days were investigated tO clarify the phytotoxicity of heavy met—
als in aquatic plants．The condensation and marginations of chromatin were observed under the electron microscope
when the CA z+concentration was from 5-7 mg／L；nueleolus break up when the Cd + concentration was 10 mg／L．
TdT-mediated dUTP nick end labeling(TUNEL)analysis of cells revealed that the nuclear DNA strand breaks could
be identified by labeling free 3-OH termini，which was the typical feature of the cel apoptosis process
． And necrotic
i~ury occurred in 20 mg／L Cd +group．The activities of antioxidant enzymes could be stimulated exposing to low
Cd +concentration tO clean up the active oxygen，and the cel apoptosis happened when their activities declined rapid—
lY at higher Cd0+concentrations．The results also indicated that reactive oxygen species(ROS)and antioxidant en—
zym es were involved in the apoptosis process．
Key words：Cd + ；Le?nna minor；ultrastructure；nDNA damage；antioxidant enzymes；TUNEL
收稿日期 ：2008一10—06 修回日期 ：2009—05—20
基金项目：国家自然科学基金(30670121)l-Supported by the National Natural Science Foundation of china(3067O121)]
作者简介：王如平(1960-)，江苏扬州人，硕士，副教授。研究方 向为植物细胞及生理生化。
通讯作者(Author for c0rresp0ndence)：硕士 ，剐教授，研究方向为植物细胞生理生化。
4期 王如平等：Cd抖胁迫下浮萍叶细胞核超微结构、nDNA损伤及抗氧化酶系的变化 503
Cd 为重金属污染物之一，不仅对植物具有毒
害作用(吴燕玉等，1997)，还可以进入食物链危及人
类健康(S／zgiyama，1994)。有关重金属对水生植物
生长发育过程和生理生化的影响，国内外学者已作
过较多的研究工作(施国新等，2000；Korichera等，
1997；张玉秀等，1999)，但对于重金属胁迫诱导的植
物细胞程序性死亡(PCD)，国内外报道并不多见。
细胞程序性死亡是指由基因控制的细胞 自主性死
亡，它有别于一般的细胞坏死(deJong等，2002)。
近年来，对植物细胞程序性死亡的研究越来越广泛，
除了植物自身生长发育过程中的 PCD外，逆境条件
也常常导致植物细胞 的程序性死亡 (于维华等，
2004)。目前常用的研究方法是形态学观察法和生
化检测法(谭茂玉等，2006)。
本文以分布广泛的浮萍(Lemna minor)为研究
对象，应用生理测定、透射电子显微镜、TUNEL原
位标记技术对其叶细胞核损伤及抗氧化酶系活性变
化规律进行初步分析，旨在揭示重金属胁迫条件下
水生植物 PCD的发生及其可能原因，以期进一步探
讨植物防御重金属伤害和耐重金属胁迫的机理，为
实践中筛选灵敏的重金属水污染监测植物提供参考
依据和毒害指标。
1 材料与方法
1．1材料培养与处理
浮萍于 2002年 5月上旬(25℃左右)采 自苏州
东山，采集后选取生长良好，长势一致的植株，先用
去离子水培养2 d，然后于上午 9：OO左右，分别移至
已加入 CdC1：的玻璃缸中，处理浓度：0、5、7、10、2O
mg／L(以纯 Cd抖计)。所有处理材料均置于 For-
ma～3744型全封闭光照培养箱中，空气温度(25．0±
0．5)℃／(15．0±0．5)℃(日／夜)，每天光照 12 h(光
强 70 btmol·photons·m ·s- )。第 6天选取直径
6 mm的叶片作为实验材料进行测定。
1．2电子显微镜观察
将叶片自中央位置取材后，放人 2．5 戊二醛
和 2 锇酸双重固定，丙酮系列脱水，Epon812包
埋，LKB切片机切片，经醋酸双氧铀～柠檬酸铅双
重染色后于 Hitachi 600-A-2型透射电镜下观察和
拍照。
1．3 TUNEL检测
另取同样位置叶片，置于 FAA固定液中抽气
固定 24 h，常规酒精系列脱水，二甲苯透明，石蜡包
埋，Leica切片机切片(叶片横切)，厚度 7 m。用作
原位末端标记的切片用含多聚赖氨酸的粘片剂粘片
45℃保存过夜。为避免正常细胞中的 DNA降解，
所用试剂均不 含 DNA酶 。切片经过脱腊，PBS缓
冲液漂洗及微波增透，然后用蛋白酶 K(20 t-cg／mL)
在 37℃消化 20 min，双蒸水清洗，最后按照试剂盒
(In Situ Cel Death Kit，AP)使用说明染色，Olym—
pus显微镜下观察拍照。
1．4抗氧化酶 系的提取和测定
取 0．5 g新鲜材料于预冷的研钵中，加入 0．05
mol／L的磷酸缓冲液(pH7．8)，冰浴，研磨，10 000
r／rain，低温(0～4℃)离心 2O min，取其上清液。
S0D、POD、CAT的测定均按照 Trevor和 Fletcher
(1994)的方法(Trevor等，1994)。实验设 2个平行
组，重复 3次。用系统自带软件对实验数据进行相
关性(R)统计分析。
2 实验结果
2．1细胞核的损伤
对照组叶细胞形态规则，细胞核膜完整，核仁边
缘清晰，染色质分布均匀，细胞质内各种细胞器清晰
(图版I：1)。5 mg／L Cd抖处理 6d的叶细胞，核内
染色质出现凝聚状态。7 mg／L Cd。 处理的叶细胞
核染色 质进 一 步凝 缩 且 周边 化 (图版 I：2)。10
mg／L Cd。 处理叶细胞的核仁已解体分散，核质呈
高电子密度的颗粒或团块状态 (图版 I：3)。2O
mg／L Cd。 则 出现细胞坏死 ，表现为核膜破裂 ，染色
质散出(图版 I：4)。
2．2细胞核 DNA断裂程度的 TUNEL检测
Cd。 胁迫下第 6天，经 TUNEL检测 5 mg／L
Cd抖处理的部分细胞已观察到 DNA断裂信号，细
胞核被标记成棕色，呈 TUNEL阳性(图版 Ⅱ：2中
箭头所示 )。随着 Cd抖处 理浓度 的增高 ，TUNEL
阳性细胞的比例明显上升。10 mg／L Cd抖处理下 ，
约有 5O ～6O 的细胞检测到强烈的 DNA断裂信
号(图版I：3中箭头所示)。而对照组细胞均未检
测到 TUNEL标记阳性细胞(图版Ⅱ：1)。
2．3抗氧化酶系统活性的变化
如图 1所示，SOD含量的变化总趋势表现为低
浓度 Cd 刺激 SOD活性迅速上升(R=0．975，P<
0．01⋯ )，并在 7 mg／L Cd 达到峰值，较对照升
504 广 西 植 物 29卷
4
， ●
图版 I Cd +胁迫下浮萍叶细胞核超微结构变化 1．对照叶细胞的细胞核(X8 000)；2．7 mg／L Cdz+处理的叶细胞，示染色质凝聚
和周边化(X6 ooo)；3．10 mg／Lcd2 处理的叶细胞，示核仁解体成多个小核仁。呈颗粒状分布于核膜附近(×5 000)；4．20 mg／LCdZ+处理的
叶细胞 ，示细胞核解体(×5 000)。
Plate I U|trastructura1 changes of nucleus in L踟 ，m T／li；r／or leaves treated with Cd2+ 1．nucIeus in normal leaf cels(×8 ooo)；2．
Leaf ceils treated with 7 mg／L CAz+，showing condensation and shrinkage of chrormtin at the periphery of nuclear membrane(×6 000)：3．Leaf cells
treated with 10 mg／L Cd2+，showing break of nudeolus into several smal nucleoli mainly distribution nearby the nuclear membrane(×5 000)：4．Leaf
cels treated with 2o mg／L CA2+。showing chromatin highly condcnsed and nucleus broke down(X6 000)．
图版 Ⅱ Cd +胁迫下浮萍叶细胞 nDNA断裂的 TUNEL检测结果 1．对照细胞，无TUNEL标记信号；2．5 m L Cdz+处理组，检
测到DNA断裂信号(箭头所示)．且破标 细胞核形态规则；3．20 mg／LCd2 处理组，检测到大量的DNA断裂信号(箭头所示)。而被标记细胞
核形态不规则。
PlateⅡ Resuhs Of DNA cleavage in Lemna minor leave~treated with Cd2+by TUNEL method 1．Contro1．There was no
positive TUNEL staining in the section；2．After treated with 5 mg／L Cd2+，cels gave positive reaction to TUNEL staining．
which were markedly regular；3．After treated with 2O mg／L Cd2+，cels were also gave positive reaction to TUNEL staining。
which were irregular．
0 5 7 1 0 20
处理浓度Ooncentrat i OH(mg／L)
图 1 CdZ+处理后 SOD活性的变化
Fig．1 Efect of CA + pollution on SOD activity
高 26．16 。当Cd2 浓度进一步加大时，SOD活性呈
急速下降趋势(R一一0．839，P<0．05一 )，10 mg／L
0 5
处理浓度
7 10 20
Concentrat i On(mg／L)
图 2 Cdz+处理后 POD活性的变化
Fig．2 Effect of CA +pollution On POD activity
Cd。 活性低于对照，20 mg／L Cd2 SOD活性仅为对
照 75．3O 。
加 他 8 4 0
一 ．uI E＼oh寸《一
； 。m o。 呈5o。
∞ ∞ ∞ ∞ ∞ O 拟
一>一 0畸 o0∞
一暑／f1弓 凸0∞
4期 王如平等 ：Cd +胁迫下浮萍叶细胞核超微结构、nDNA损伤及抗氧化酶系的变化 505
1000
童 800
600
仆Ⅱ 日
= 400
0 0
200
O
0 5 7 10 20
处理浓度 Concent r at i on(mg／L)
图 3 Cdz+处理后 CAT 活性的变化
Fig．3 Effect of Cd +pollution 012 CAT activity
POD活性变化(图 2)则在 5 mg／L CA 组 中升
高至对照的 156．46 ，而后随 Cdz 浓度的加大 ，POD
活性迅速下降直至对照的 49．7，6 0A(R一一0．937，P<
0．01一 )。
CAT活性的变化相对敏感(图 3)，在整个浓度梯
度中均表现持续下降。5 mg／L CA 处理的比对照下
降了 8．78 ，而 后 急 速 下 降 (R一一0．912，P<
0．Ol⋯ )，20 mg／L则仅为对照 27．15 。
3 讨论
近年来，有关重金属诱导细胞凋亡及其机制的研
究已得到广泛的重视，国内外均有重金属胁迫诱导细
胞凋亡的报道(Habbeebu等，1998；Ishido等，1998；翟
琦巍等，2000)，但从环境污染角度开展重金属诱导水
生植物细胞凋亡的研究还很少。
细胞凋亡的一个重要特征是 DNA发生片段化，
TUNEL原位末端标记出 DNA断裂过程中产生的
3，_OH末端以及细胞超微结构变化特别是细胞核的
变化均为公认的检测细胞凋亡的有效指标(Wijsman
等，1993；Kerr等，1972)。林久生等(2001)的研究表
明，凋亡细胞往往表现为核基因组 nDNA断裂，裸露
出游离的3 0H末端，因而在 TUNEL反应中被标记
成棕色，且细胞核发生染色质凝聚，以至解体。我们
的实验结果有力的证明了这一点：Cd。 胁迫不仅诱使
细胞核出现染色质凝集，周边化等明显的凋亡变化，
而且 TUNEL检测也显示 出 5～10 mg／L Cd 胁迫
下浮萍叶细胞核出现 DNA断裂，这是植物体在低浓
度重金属离子胁迫下主动清除自身冗余，病变或损伤
的细胞，以维持机体内部平衡；而随着 Cdz 浓度升
高，发生细胞核 DNA断裂的细胞数目明显增加，程度
加重，直至 20 mg／L Cdz 已导致细胞解体，组织坏
死，其原因可能是植物细胞依靠自身调节系统无法适
应高剂量的重金属急性毒害。可见 ，重金属诱导植物
细胞 由凋亡转 向坏死，具有典型 的剂量——效应关
系。
夏慧莉等(1999)和陆怡等(1996)的研究表明，
细胞 内活性氧 (reactive oxygen species，ROS)的堆
积能诱导多种细胞发生调亡 。通常细胞内有一系列
有效的抗氧化防御机制，包括清除 ROs的 SOD、
CAT、POD等 。而一旦氧化与抗氧化作用失衡 ，细
胞功能将会受影响 ，细胞凋亡可能就是这种失衡 的
结局之一。本实验检测到：低浓度 的 Cd。 可短暂刺
激抗氧化酶活性以消除体内活性氧，而一旦活性氧
水平超出一定域值，抗氧化酶活性则急速下降，造成
植物体细胞的凋亡。ROS对生物的损害作用机制
还主要 涉及 DNA 的损伤，尤其是线粒体 DNA
(mtDNA)及核 DNA(nDNA)的氧化损伤(曾昭惠
等，1995)，DNA氧化损伤的结果可导致碱基修饰，
碱基缺失，单链和双链 DNA的断裂，DNA交联等
(陆怡等，1996)，所以可以推测细胞凋亡时 DNA片
段的断裂可能与 ROS有关。实验结果表明：Cd
能促使细胞核 DNA受损，同时引发细胞代谢的失
控 ，最终导致细胞凋亡 。
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