全 文 ：广 西 植 物 Guihaia 22(5)：420— 424 2002 年 9 月
一 种简便、快捷的胰蛋白酶抑制剂
基因的分离与克隆方法
秦新 民 ，邓智年
(1．广西 师范大学生物 系，广西桂林 541004；2．广西农 业科学 院 ，广西南宁 530007)
摘 要 ：从 3个豇 豆品种幼嫩 叶片中分离 出核基 因组 DNA，参照 已知 的几 种 Bowman—Birk型胰蛋 白酶抑制
剂基 因序列 ，设计合成 了 27 bp，且 含有 BamH I位 点的寡核苷 酸引物 ，分别 以 3种豇 豆核 基因组 DNA 为模
板 ，PCR扩增 ，均得到长度 约为 340 bp的 DNA片段 。产物 DNA 片段经 DNA 序列分析 ，结果表 明三者 的碱
基 序列相同 ，与报道的胰 蛋 白酶抑制剂基因相 比，同源性为 100 和 99．7 。
关键词 ：豇豆 ；豇豆胰 蛋白酶抑制剂基 因；PCR扩增
中图分类号 ：Q789 文献标识码 ：A 文章编号 ：1000—3142(2002)05—0420—05
A ‘ ’‘ and Did ~thod for paration andsim ple ra O m e O O se
Cl onlng ot COWpea tryotin inhi bit0r Rene ● n ‘ ‘■ ■ l■l●·
QIN Xin—min ，DENG Zhi—nian
(1．Department oJ’Biology，Guangxi Normal University，Guilin 541004．China：2．Guangxi Academy of
Ag*‘kultural Sciences，Nanning 530007，China )
．
Abstract：The total nuclear genomic DNA were respectively extracted from young leaf tissue of three varieties of
cowpea．A 27 bp—long oligonucleotide primer with BamH I in 5 terminus was designed and synthesized by con—
ferring the gene sequence of cowpea Bowman—Birk type trypsin inhibitor that have been known． The special
DNA fragment about 340 bp was amplified through PCR by using the primer and extracted DNA as template
．
M oreover，tlm amplified bands were sequenced．The results showed that they were the same seuuence
． Com—
pared the sequences with that of published CPTI cDNA，the cloned CPTI genes respectively shared 100％ and
99．7 homology with published CPTI eDNA nucleotide sequence．
Key words：cowpea；cowpea tryptin inhibitor gene；polymerase chain reaction amplification
植物 蛋 白酶 抑制 剂是 一类 含量较 为丰 富 ，对蛋
白水解酶有抑制作用的一类小分子蛋白质，在植物
对危害昆虫及病原体侵染的防御系统 中担 当着重
要的角色 。豇豆胰蛋白酶抑制剂(Cowpea Trypsin
Inhibitor，CPTI)属丝氨酸蛋白酶类，Bowman—Birk
家族蛋 白酶 抑制剂 ，具有 2个 抑制活性位点 ，可同时
抑制 胰 蛋 白酶 和凝乳 蛋 白酶 的 活性 ，对鳞 翅 目、鼓
翅 目、双翅 目以及部分鞘翅 目昆虫具有较强的毒杀
作用。由于 CPTI具有广泛的抗虫谱，在植物抗虫基
因工程 中具有广泛的应用前景，从而受到人们 的关
注 ，相 继对 CPTI基 因进 行 了 克 隆 和 转 基 因研
究“ 。
收稿 日期 ：200l—O8一l 5
作者简介 ：秦新 民(1956一)，男 ，广西灵川人 ，博士 ，研究员 ．分子生物学专业 ，主要从 事植物分子生物学研究
。
基金项 目：广西 自然科学 基金资助项 目(编号 ：20007007)；广西师范大学博士启动基金
维普资讯 http://www.cqvip.com
5期 秦新 民等 ：一种简便 、快捷 的胰蛋 白酶抑 制剂基 因的分离 与克隆方法 421
本文参照几种 Bowman—Birk型胰蛋 白酶抑制
剂基 因序 列 ，以桂 林 当地 3个豇豆 品种 (紫红 ，白色 ，
花斑 )为材 料 ，进行 CPTI基 因 的克 隆，旨在 为重要
农作物 的抗 虫基因工程提 供 CPTI基因 。
1 材料 与方法
1．1材料
当地 紫红 、白色 、花斑 3个 豇 豆 品种 的幼 嫩 叶
片 。质粒 pGEM一3zf(十)，大肠杆菌 DH5a。
1．2方法
1．2．1植 物 DNA 的提 取 参 照 Mettlep 的方 法 ，
略作修改。取 0．5 g叶片加入液氮研磨成粉末状 ，加
入 500 I DNA提取液，轻轻摇匀，冰浴 15 min；加
入 250 I T 。E 10 SDS至终 浓 度为 1 ，摇 匀 ，
68。C水浴 15 min；加入 7．5 M NH Ac 275 I ，冰上
放置 40 min；10 000 rpm，4。C，离心 25 min；取上
清 ，加 入 等 体 积 的酚 ／氯 仿 (1：1)，氯 仿 各抽 提 1
次 ；上清加 入 1／10体积 的 3 M NaAc(pH5．2)和 2
倍 体 积 的无 水 乙醇 沉淀 DNA，一20。C放 置 3O min；
10 000 rpm，4。C，离心 10 min；去上清，倒置离心管
凉干沉 淀；加适量 TE溶 液溶解 DNA；然后 加入
RNase A(浓度达到 50～70 ug／mI )，一2O。C保存备
用 。
1．2．2聚合 酶链 式反 应 (Polymerase Chain Reaction，
PCR) 为了便 于克 隆，在 引物 5’端加入 了一个
BamH I酶 切 位 点 。上 游 引 物 ：5’CATGGATCT—
GAACCACCTCGG一3’。下游 引物 ：5’一CCTACTTC—
TACTACTCATTCT一3’。在 灭 菌 后 的 新 0．5 mI
Eppendorf离心 管 中依 次加 入：模 板 DNA 2 I ，
10XPCR buffer 3 I ，dNTP0．2uM ，上 游 引 物 50
pmol，下游引物 5O pmol，PfuDNA聚合酶 5U，双蒸
水补足 至 30 I 。反应 条件：95。C，5 min；93。C，
lmin，50。C，1 min 30 S，70。C，2 min(36个循 环)；70
。C，10 min。PCR扩增产 物的纯化 ，按 PCR产物 回收
试剂盒 的说 明方法进行 。
1．2．3 DNA 序 列 分 析 将 PCR 产 物 克 隆 到 载 体
pGEM一3zf(+)上 ，转化 E．coli DH5a，通过菌落蓝
白斑筛 选 和 限制酶 酶切 鉴 定 ，得 到重组 质 粒 pGM—
CI 27。以重组质粒 pGMCI 27的 T7／SP6启动子 序
列 为 引物 ，采 用 双 脱 氧 链 终 止 法 进 行 双 向 自动 测
序 。由大连 宝生生物工程公 司完成 。
1．2．4大肠杆 菌质 粒 DNA 的提取 用 碱 裂解 法提
取 质粒 DNA 。
1．2．5载体 酶切 产 物 的去磷 酸 化 载 体 pGEM一3zf
(十)用 限制 性 内切 酶 BamH I消化 ，然 后按 文献。
的方 法进行去磷酸化 。
1．2．6 DNA 限制酶切 反应和 DNA 片段 的连接 限
制性 内切 酶 酶解 ，klenow 补齐 末 端 和 DNA 片段 的
连接方 法均按文献 进行 。
1 2 3 4 5
· 一 340bp
图 1 三个豇 豆品种 DNA PCR扩增
Fig．1 PCR amplification of three varieties cowpeas
1 DNA分子量 ；2．对照；3．白色豇豆；4．紫红豇豆；5．花斑豇豆
1．DNA marker(DL一2000)；2．CK ；3．White cowpeas；
4．Purplish red cowpeas：5．Piebald cowpeas
2 结 果
2．1 CPTI基因 PCR扩增
以 3个豇豆品种 DNA为模板 ，在 PCR反应体
系中，用高保真 DNA聚合酶(pfu)来扩增 。36个循
环 后 ，取 10 UI 样 品进 行 琼 脂 凝 胶 电 泳 检 测 ，以
DNA Marker(DI 一2000)为分子量标准 ，结果在 340
bp处有清晰的扩增带(图 1)。然后用 PCR产物纯化
试剂 盒将 340 bp的 DNA 扩增带进 行 回收 ，并 于一20
。C下保存 。
2．2扩增 DNA片段的序列分 析
将 由 3个 豇豆 品种 DNA扩增 出的 CPTI DNA
片段 进行序 列分 析 ，结 果 表 明 3条 DNA 扩 增带 的
碱基序列完全相同(图 2)，含有编码 CPTI成熟蛋 白
80aa碱基序列和 27aa的前导序列 。
2．3 CP FI基 因的克隆
由于合成引物 5’端均带有限制性内切酶 BamH
维普资讯 http://www.cqvip.com
422 广 西 植 物 22卷
I
．
的酶切位点 ，用 BamH I对回收的 PCR扩增 DNA
片段进行酶切 ，使 DNA 片段两 端产生 5’突 出末端 。
然后再 用 PCR产物 试剂盒 进行 回收 。质 粒 pGEM一
340bp．一
51
10
1 5
3zf(+)同样 用 BamH I酶 切 ，经 两次去磷酸 化处理 ，
回收线性载体 pGEM一3zf(+)。将 CPTI片段与线性
质粒 pGEM一3zf(+)按 3：1比例混 合 ，用 T DNA
AAACGACGGC CAGTGAATTG TAATACGACT CACTATAGGG CGAATTCGAG
CTCGGTACCC GGG
． ． ． ．
G
． ． ． ． ．
A
． ． ． ． ．
T
． ． ． ．
C
．．．—
C
—
GA TGATGGTGCT AAAGGTGTGT GTGCTGGTAC
BaSil
TTTTCCrFGT AGGGGTTACT
0
AG l c c ATGATGACTC
A I △鳗 I ATe殴 AA
PstI Neol
AAGCGATGAA CCTTCTGAGT
CCACCTCGGA
CTTCAGAACC
20 l ATGCTGCGAT TCATGCATCT GCACTAAATC AATACCTCCT CAATGCCATT
25 l GTACAGATAT CAGGTTGAAT T． ．C． —G— TGTCACT CGGCTTGCAA ATCCTGCATG
EcoRI
30 1 TGTACACGAT CAATGCCAGG CAAGTGTCGT TGCCTTGACA TTGCTGATTI’
35 1 CTGIqACAAA CCTTGCAAGT CCAGGGATGA AGATGATGAG TAAGAAAAAG
40 l GAGG~FCCTC TAGAGTCGAC CTGCAGC~AT GCAAGCTTGA GTATTCTATA
一
45 1 GTGTCACCTA AATAGCTTGG CGTAATCATG GTCATAGCTG TTTCCTGTGT
50 l GAAATTGTTA TCCGCTCACA ATTCCACACA ACATACGAGC CGGAAGCATA
5 5 I AAGTGTAAAG CCTGGGGTGC CTAATGAGTG AGCTAACTCA CATTAATTGC
60 l GTTGCGCTCA CTGCCCGCTT TCCAGTCGGG 2~s,ACCTGTCG TGCCAGCTGC
65l ATTAA
图 2 胰蛋 白酶抑制剂基 因的 DNA序列
Fig．2 Nucleotide sequence of the cowpea tryptin inhibitor gene
2 3 4
图 3 重组质粒 pGMCI27的 PCR扩增结 果
Fig．3 PCR amplification of recombinant
plasmids pGM CI27
1．2，4．重 组质 粒 DNA；3，DNA2分子 量
l，2，4．DNA of recombinant plasmid；3．DNA marker(DL一2000)
连接酶连接 ，再将产物转化 感受态大肠杆菌 DH5a。
通过蓝白斑选择，挑取 白色菌落进行小量快速提取
重组质粒 ，质粒经 PCR扩增 ，检测到 了 340 bp的
CPTI片段(图 3)，BanH I酶切后可得到一条 3．2 kp
的载体 DNA带和一条 340 bp CPTI DNA 片段 (图
4)。结果证明 CPTI基 因已连接到质粒 pGEM一3zf
(+)上，获得了重组质粒 pGMCI 27(图 5)。
3 讨 论
近 年 来 ，基 因 克隆 的方 法有 了长 足 的进展 ，相
继 发 展 出 一些 基 因克 隆 的新 方 法 。 ，其 中 RNA—
cDNA—PCR为最常用的方法之一。许多学者运用该
方法 成 功 的 克 隆 到 了一 些 生 物 的重 要 性 状 基
因“ “ ，该方法虽省略了分离 mRNA 的程序 ，但仍
需提取总 RNA。由于 RNA易降解 ，提取的实验技
术要 求较 高 ，而 且烦琐 。刘春 明“”，龙立 如“ ，李 江
等人“ 用 DNA 为 模板 ，利 用 特异 引物 进行 目的基
因的扩增 ，相继克隆到 了豌豆外源凝集索基 因，水
稻 10 KD醇溶蛋 白基因和水稻几丁质酶基因。本文
直接以 DNA为模板，利用特异 引物进行 目的基因
维普资讯 http://www.cqvip.com
5期 秦新民等 ：一种简便、快捷的胰蛋白酶抑制剂基因的分离与克隆方法 423
的扩增 (DNA—PCR法 )，从 3个豇豆 品种 DNA 中扩
增 出 了 CPTI基 因。所 得 到 的 3个 CPTI基 因 经
DNA序列 分析，结 果与刘春 明等人 采用 RNA—
cDNA—PCR克隆的 CPTI基因碱基序列完全相同，
含有编码 27aa的前导序列(信号肽，前导肽)和 80aa
的编码 CPTI成熟 蛋 白区的碱基序列 ，同源性 为
100 。而与 Hilder等人 报道 的 CPTI基因仅在前
导序列 中有一个碱基 不同 ，即前 导序列中倒数第 5
340bp—一
1 2 3 4
图 4 重 组质粒 pGMC127的酶切 鉴定
Fig．4 Identification recombinant plasmid by digestion
1．2．重组 质粒 经 Hind ll消化 ；3．重 组质粒 DNA；4．DNA2分子 量
l，2．Digestion of recombinant ptasmids by Hind III：3．DNA of
recombinant plasmid；4．DNA marker(DL一2000)
图 5 质粒 pGMCI 27的构建
Fig． 5 Construction of plasmid pGM CI 27
个三联 体密码 为 CTG，而不 是 TTG，但两 者编码 的
氨 基 酸 都 是 亮 氨 酸 。碱 基 序 列 的 同 源 性 达 到
99．7 。上 述 结 果 证 明采 用 DNA— PCR 方 法 与
RNA—cDNA—PCR方法得到 的 CPTI基 因是一致 的 ，
但 DNA—PC—R方法克隆基因省去了提取 RNA和反
转 录等 步 骤 ，具有 简 便 、快 速 ，费 用低 的特 点 ，可 为
其他基因的克隆提供参考。
DNA 提取现有许 多简易方法 ，产 物虽然可 以用
于 PCR扩增反应 的模 板 ，但要 从其 中扩增 出某 一特
定的 目的基因并用于克 隆时，其纯度 则达不到要
求 ，从而影响 目的基因的扩增 得率 。故采 用 DNA—
PCR方法 扩增 目的基 因时 ，应 将模 板 DNA 进 行纯
化 。本 文采用苯酚 一氯仿 一异戊醇 一核糖核酸酶法
提取 的模 板 DNA，其 纯度 和 片 段 长度 均 可 满 足要
求 。
利用 DNA—PCR法进行 扩增 和克 隆 目的基 因另
一 个值得注意的问题是 Taq DNA聚合酶 的运用。
Taq DNA聚合酶主要用于保真度要求不高的 DNA
扩增 ，它具有很强的 DNA聚合能力，其 DNA延伸
速度在已知高温嗜热 DNA聚合酶 中是最高的。但
是 ，Taq DNA 聚合 酶无 3’一 5’外 切酶 活性 ，因此 在
DNA扩增时没有 校正功能 。如仅以 Taq DNA 聚合
酶来 扩 增 目的基 因，碱 基 的错 误 掺入 率 是 相 当高
的。Pfu DNA聚合酶具有 3’一5’外切酶的活性 ，能
纠正 DNA 扩增 过程 中产 生 的错 误 ，是 目前 所 有高
温 DNA聚合酶中出错率最低的 。在基因克隆中，
由于对 DNA扩增产物的正确率要求特别高，所以
在利用 DNA—PCR方法进行基 因克隆时应选 Pfu
DNA聚合酶，以确保扩增产物 DNA的正确性。
本实验得到广西大学生物技 术实验 中心黄 日
波博士和冯 家勋博 士的大力 帮助 ，谨此 致谢 。
参考文献 ：
[1]周兆斓 ，朱 祯．植物抗虫基 因工程研究进展EJ]．生
物工程进展 ，1994，14(4)：18—24．
C23 Hilder V A，Richard E B B，Reda A S，PfⅡ1．Protein
and cDNA sequence of Bowman—Birk tryptin inhibitor
from Cowpea[j]．Plant Mo1．Bio．，1989，13：701—
710．
C33刘 春明 ，朱 祯 ，周 兆斓 ，等．豇豆 胰蛋 白酶 抑制剂
cDNA在大肠杆菌中的克隆与表达EJ]．生物工程学
报 ，1993，9(2)：152—1 57．
C43刘春 明，朱 祯 ，周兆斓 ，等．豇豆胰蛋 白酶抑制剂
抗 虫转基因烟草 的获得 EJ]．科学通 报 ．1992，(18)：
1 694— 1 697，
C5)Hilder V A，Angharan N R G，Suzanne E S H．Pt(2，
．
维普资讯 http://www.cqvip.com
424 广 西 植 物 22卷
A novel mechanism of insect resistance engineered into
tobacco[J]．Nature，1987，300(12)：16O一163．
[6] Mettlep A J． A simple and rapid method for
minipreparati0n 0f DN A from tissue culture plant cell
[J]．Plant Mo1．Bid．Rep．，1987，(5)：346—349．
[7]Sambrook J，Fritsch E F，Maniatis T M ． (eds．)
Molecular Cloning：A I aboratory Manual[C]．2ed．
CSH I aboratory Press，Cold Spring Harbort， New
York． 1998．19— 21．
[8]彭 秀玲 ，袁 汉英 ，谢 毅 ，等．基 因工 程实 验技 术
[M]．长沙：湖南科学技术出版社，1998．89．
[93潘 映红 ，张 杰 ，黄大 唠．几种微生物杀虫蛋 白基 因
研究进展 [J]．生物技术通报 ，1999，2：1—4．
[1 O]李 捷 ，印莉萍 ，刘维 仲．示差扣 除杂交 法及其 在
分 子生物学 中的应用 [J]．生物技术通报 ，1999，3：
9— 14．
[11]李 鲜 ，朱 本 忠 ，罗 云 波．番 茄 果 实 中 NEVER—
RIPE基 因的克隆及其反义 表达载体的构建 EJ]．农
业生物技术学报 ，2001，4：371—373．
[12]冯 洁 ，何礼远 ，袁风华 ．马铃薯 32KD抗茵 蛋白的
eDNA 分子 克隆 研究 [J]．农业 生物 技术 学 报，
1999，1：37— 4O．
[13]陈海旭 ，胡泰 山，王 新 ，等．抗菌肽 Diptericin cD—
NA 的克隆及 在 E．coli中的融合 表达 EJ]．中 国生
物化学 与分子 生物学报 ，2001，2：182—184．
[1 4]Joshi I ，St Leger RJ，Roberts DW ．Isolation of fl cD—
NA encoding fl novel subtilisin—like protease (PrlB)
from the entomopathogenic fungus， M etarhizium
anisopliae using differential dipay—RT—PCR [J]．
Gene，1997，197：1— 8．
[15]刘春明，于占洋，朱 祯 ，等．豌豆外源凝集素基因
的克隆及序列分析[J]．遗传学报 ，1995，4：302—
306．
[16]龙立如 ，谢 明 ，翟礼 嘉 ，等．水稻富硫 1OKD醇溶
蛋 白基 因 的克 隆和 序列 分 析 比较 [J]．植 物学 报 ，
1995，7：507— 513．
[17]李 江 ，胡学军 ，苏 乔 ，等．水稻几 丁质酶基 因的
克隆及序列分析 [J]．农业生物 技术学 报 ，1998，4：
382——388．
[18]陶生策，张治平，张先恩．PCR技术研究进展[J]．
生物工程进展 ，2001，4：26—29．
(上接第 419页 Continue from page 419)
14(1)：34—39． 业 出版社 ，1999．40
[2o]王金生．分子植物病理学[M]．北京：中国农
图 版 说 明
图版缩写词 ：EN一内果皮；I一异细胞；ICS一胞间隙；I．-皮孑L}P一周皮；PC一薄壁细胞；SC一石细胞}SE一刺看；SU一栓质层；TR一横
条薄壁细胞 ；TU一瘤状突 ；V一维管束
图版 I：龙眼果皮显微结构(×250)1～2．水涨龙眼；3～4．赤壳龙眼；5．福眼龙眼；6～7．普明庵龙眼；8． 蕉眼 龙眼 ；9．红
核子龙眼；1O～11．油潭本龙眼 ；12～13．乌龙岭龙眼 ；14～15．风梨味龙眼 ；16~17．东壁龙眼。
Expl anation of Pl ate
Abbreviations used on al l figures：EN—Endocarp；l-ldioblast；ICS—lntercelu1ar space；I
． - I enticel；p-Periderm ；PC—Parenchy—
mfl cel；SC—Stone cel；SE—Seta；SU—Suberin layer；TR—Trabecula parenchyma cel；TU—Tumor shape projecting；V—Vascu1ar bun—
die．
Plate I ：M icrostructure of 1ongan fruit periearp (× 250)1～ 2
． Shuizhang；3～ 4．Chike；5．Fuyan；6～ 7
． Pumingan；8
Jiaoyan；9·Honghezi；1O～ 11．Youtanben；12~ 13．Wulongling；14～ 15． Fengliwei；16~ 17．Dongbi．
维普资讯 http://www.cqvip.com