全 文 ：广 西 植 物 Guihaia 24(5)：418—421 2004年 9月
杉木第四号染色体特异性 RAPD片段的获得
李湘阳1，2，周 坚1
(1．南京林业大学森林资源与环境学院，江苏南京 210037；2．中国林科院热带林业研究所，广东广州 510520)
摘 要：分别分离杉木(Cunninghamia lanceolata(Lamb．)Hook)同一细胞中的第四号具随体染色体及剩余
2O条非随体染色体，进行 DOP—PCR扩增，分别以随体染色体及非随体染色体的 DOP—PCR产物为模板，用成
对随机引物进行 RAPD分析。用弓I物对 OPB07+OPB10进行扩增，在 500~250 bp之间，随体染色体有 4条
特异扩增带；用引物对 OPB07+OPB18在 900 bp左右获得 1条随体染色体特异带；用引物对 OPD07+
OPDO5在 250 bp左右得到随体染色体 1条特异扩增带。
关键词：杉木；染色体；DOP-PCR；RAPD
中图分类号：Q943 文献标识码：A 文章编号：1000—3142(2004)05—0418—04
RAPD special fragments 0f satellite chromosomes
^ ^ ● ■ ● - - [rom cunnm 2，zam ta la ceolata
LI Xiang—yang，ZHOU Jian
(1．College of Forest Resoures and Environment Nanjing Forestry University，Naniing 210037，China；
2．The Research Institute of Tropical Forestry。Guangzhou 510520，China)
Abstract：A pair of satellite chromosomes and 20 other non—satellite chromosomes in one cell from Cunning—
hamia lanceolata were isolated．The two kinds of chromosomes were amplified by DOP—PCR．And the DOP—
PCR products were analyzed by RAPD-PCR using pairwise combinations of primers．There were four specific
fragments between 500—、 250 bp which belong to satellite chromosomes in the RAPD profile with pairwise
primers OPB07 and OPBIO．Another specific about 900 bp fragment of satellite chromosomes was obtained in
the amplified products with pairwise primers OPB07 and OPB18．And a specific about 250 bp fragment also
belonged to satellite chromosomes，which was get in the RAPD profile using pairwise primers OPD07 and
0PDO5．
Key words：Cunninghamia lanceolata；Chromosome；D0P—PCR；RAPD
染色体微分离、微切割及微克隆技术自1981年
Scalenghe等创立至今已经在人和动物的基因组研
究中发挥了巨大的作用。该技术在二十世纪 9O年
代初应用于植物材料 的研究 (Sandery等，1991)。
目前国内植物材料的染色体微分离、微切割及微克
隆技术主要应用于单染色体文库的构建(党本元等，
1998)、特定染色体上基因的分离(田毂等，1997)、B
染色体的进化等方面(郭歌等，1998)。马有志等
(1999)应用氩离子激光分离普通小麦的1B染色体
及体细胞，证明以分离的细胞核为模板进行 RAPD
研究与常规 RAPD反应(用从幼叶提取的基因组总
DNA为模板)扩增式样相同。我们先后进行了有关
杉木单染色体的微分离(李湘阳等，2002)以及分离
的各单染色体扩增产物的RAPD研究(李湘阳等，
收稿 日期：2004-01-15 修订 日期 ：2004—03-26
基金项目：国家 自然科学基金资助项 目(39970626)
作者简介：李湘阳(1970一)，女，湖南宁远人，助理研究员，博士。*通讯作者
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5期 李湘阳等：杉木第四号染色体特异性 RAPD片段的获得 419
2003)。在此基础上，我们开展了杉木第四号染色体
的特异性 RAPD片段的筛选，并得到了该染色体的
特异性片段。
1 槠料与方法
1．1材料
杉 木 (Cunninghamia lanceolata (Lamb．)
Hook)种子采自贵州省。DOP-PCR引物设计参照
文献(Telenius等，1992)报道序列，引物由上海申友
生物技术有限责任公司合成。
1．2染色体标本的制备
详细过程参见文献(李湘阳等，2003)。
1．3染色体微分离
把制好的玻片放人液氮中冰冻，揭去盖玻片，风
干，立即用于染色体微分离。在显微操作仪上用玻
璃针(尖端直径为 1～3 m)从一个处于中期分裂相
的细胞中将一对带随体的第四号染色体轻轻挑起，
折断粘有染色体的玻璃针尖于 0．2 mL的 Eppen—
dorf管中。再将该已除去一对随体染色体的剩余
2o条染色体挑起，同样将粘有染色体的玻璃针尖折
断于另一 0．2 mL的 Eppendorf管中，高速离心数
秒，立即用于PCR扩增或-20℃保存待用。在4O×
1O倍光学显微镜下，随体的形态很清楚，因此不会
造成误分离。在挑2条随体染色体以外剩余部分染
色体时，如需用玻璃针分批挑起放人同一 Eppen—
dorf管中，则必须每次换用新的无菌的玻璃针。染
色体的分离空间在进行染色体分离前需在紫外灯下
照射至少 2 h以上，所用器皿需经严格灭菌处理。
后续扩增反应均在PE 9600基因扩增仪上进行。
1．4随体染色体及非随体染色体的体外扩增
将分离的随体染色体及非随体染色体分别用
0．05 mg／mL蛋白酶 K液 2O L(用 1×Taq酶缓冲
液(Promega)配制)在37℃消化 90 m?n后 ，于95℃
下保温 10 min以灭活蛋白酶 K。同时设置严格的
阴性对照反应管(不加任何底物)。样品与对照同时
进行PCR扩增。采用引物为一可随机扩增的简并
引物(5，_CCG ACT CGA GNN NNN NAT GTG
3 )(Telenius等，1992)。在经蛋白酶 K消化的
Eppendorf管中加入以下成分：
1O×Taq buffer(Promega)3 L，25 mmol／L MgC12
5止 ，25 t~mol／L的弓I物 3 L，10 mmol／L dNTP 1 L，
Taq酶2．5 U(5 U／t~L)，无菌水补至 5O L。
反应条件根据文献(Telenius等，1992)略有改
动。第一轮 PCR：94℃预变性 10 min，随之进行 5
个低退火温度循环：94℃ 1 min-~30℃ 1．5 min一
30~72℃缓慢升温(3 min)-~72℃ 3 min。然后在
下列条件下进行 25个高退火温度循环扩增：94℃ 1
min--~57℃ 1 min一72℃ 2．5 min；循环结束后，72
℃延伸 10 min。
第二轮 PCR：取初次 PCR扩增产物 5 l做模
板，其余反应试剂成分的浓度与第一轮PCR扩增相
同，反应条件为：94℃预变性 5 min，然后进入 25个
循环：每个循环 94℃ 1 min--~57℃ 1 min一72℃ 2
min。循环结束后 72℃延伸 10 min。4℃保存。
取第二轮 DOP-PCR产物5 L于 1．2 琼脂糖
凝胶电泳，在天能 UV-2000系列紫外分析仪 300
nm紫外灯下观察并照相。扩增效果见图1。
1．5扩增产物Southern杂交分析
用常规 CTAB法从杉木种子萌发的幼苗中提
取杉木总基因组 DNA，用随机引物法，根据 Roche
公司产品 DIG High Prime DNA Labeling and De-
tection Starter Kit I说明书所提供的方法将杉木总
基因组 DNA进行地高辛标记。将分离的杉木随体
染色体及非随体染色体的 DOP—PCR第二轮扩增产
物进行琼脂糖电泳及 Southern转膜，然后与标记的
杉木基因组 DNA探针杂交、洗膜、显色并拍照。杂
交结果见图2。
1．6 PCR扩增产物的纯化
将DOP-PCR第二轮扩增产物经酚抽提纯化。
1．7染色体扩增产物的 RAPD分析及特异片段的
筛选
1．7．1 RAPD反应条件 RAPD反应程序根据文献
(李湘阳等，2003)而略有改动：
94℃变性 4 min，38℃退火 45 S，72℃延伸 9O
S，共一个循环；然后 94℃变性 45 S，38℃退火 45 S，
72℃延伸 90 S，共 4O个循环；最后 72℃延伸 7
min，4℃结束扩增并保存。反应体系(2O L)组成
为：模板浓度：2O ng左右(以非随体染色体 DOP—
PCR产物为模板进行单引物筛选)25 ng左右(以非
随体染色体及随体染色体 DOP-PCR产物为模板进
行双引物扩增时)；10倍反应缓冲液：2 L(pro—
mega)；MgC12浓度：2．5 mmol／L；4种 dNTP浓度：
各为 200 t~mol／L；引物浓度：1 t~mol／L(单引物扩增
时)，1．5 tLmol／L(双引物扩增时，每种引物浓度各
为 0．75 t~mol／L)；Taq聚合酶：1 U。
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420 广 西 植 物 24卷
扩增产物于 l_6 琼脂糖凝胶电泳，在天能Uv_
2000系列分析仪 300 nm紫外灯下观察并照相。
1．7．2引物筛选及特异片段的获得 先用单细胞的
非随体染色体扩增产物对OPA、OPB、OPC、OPDI—
l2共 72个备选引物进行初筛，然后从中挑选出重
复性好、扩增谱带清晰的引物组合成任意引物对，再
衷 l 随机引物序刊
Table 1 Arbitrary 10 bp primers
将随体染色体扩增产物和非随体染色体扩增产物对
组合引物对进行复筛。最后筛选出多态性强的三对
引物组合 OPB07+OPB10、OPB07+OPB18和
OPD07+OPD05对杉木随体染色体扩增产物和非
随体染色体扩增产物进行正式扩增。表 l是用于扩
增的随机引物序列。图 3显示了扩增结果。
圈l 杉木随体染色体及非随体20条
染色体 DOP—PCR扩增产物
Fig．1 DOP—PCR products from satel Lite chromosome
and 20 nDn*satel te chromosomes of
Canninghamm tanceola d
M；分于置；1．阴性对照I 2．陡体染色体 DOP-PCR产物I
3．20条非肚体染色体 DOP-PCR产物
M M k 1．negative cot~t rol I 2．D0p-PCR products 0f
satelite chromosora~l 3．DOP—PCR products
0f 20 non—sa【eltite ch rOn1O5啪 es
2 结果与分析
2．1 DoP-PCR扩增结果及 Southern杂交分析
从电泳结果图可看出，随体染色体的 DOP—
PCR产物片段大小约在 250～900 bp之间；非随体
染色体的 DOP—PCR产物片段大小约为 200～1 100
bp。同时还可见同一细胞的非随体染色体的扩增
信号比随体染色体的扩增信号强得多，这可能是非
随体染色体的模板量大(有 20条染色体)的原因(图
1)。阴性对照无扩增信号。以杉木总 DNA为探针
的Southern杂交图表明，随体染色体与非随体染色
体的扩增产物都是来自于杉木基因组 DNA(图2)。
2．2染色体 DOP-PCR产物纯化与否对 RAPD-PCR
的影响
一 般情况下，从植物中提取的总 DNA并不需
要进行氯化铯梯度离心或使用任何纯化试剂盒就可
以用做RAPD-PCR反应的模板 然而以分离的染
色体DOP-PCR扩增产物为模板时，必须考虑到该
模板是经过两次 PCR反应的产物，其中残留的Taq
酶、dNTP、M 以及 引 物有 可能 会对后 续 的
RAPD-PCR反应产生不良影响。本实验对纯化和
非纯化模板进行比较，发现非纯化模板的扩增信号
弱且带数少，因此，对 DOP-PCR产物先进行纯化，
再进行 RAPD—PCR是必要的。
2．3杉木第四号染色体 RAPD特异片段的获得
RAPD扩增结果表明，用随机组合的成对引物
对杉木随体染色体(杉木第四号染色体)扩增产物和
非随体染色体扩增产物进行扩增时，约有5O 的引
物组合对表现出一定的多态性，但所得到的扩增谱
带稳定、清晰且重复性好的引物组合对并不多。图
3显示 的是用 三对 引物 组合 OPB07+OPB10、
OPB07+OPBl8和 OPD07+oPD05对杉木同一细
胞中一对随体染色体及其余 2O条染色体的 DOP—
PCR产物分别进行扩增的结果。在引物对 O-PB07
+OPBIO的扩增 中可见带随体的第 四号染色体在
500、450、350、280 bp左右处有 4条特异带是非随
体染色体扩增产物中没有的；以OPB07+OPB18为
引物的扩增中，随体染色体在900 hp处有一明显的
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5期 李湘阳等：杉木第四号染色体特异性 RAPD片段的获得 421
A B C D
图2 DOP-PcR产物 Southern杂交分析图
Fig．2 Southern blot aria】ysis 0f DOp-PCR products
A．20条非随体染色体DOP-PCR产钉I＆髓悼染色体DOP-
PcR产物 c．哦性对照，D．EcoRl酶切杉木基因组 DNA．
A．20 non-~telite chromosomes 130p-PCR product~|B．Satetlite
chromosome DOp-PCR p~oductsl C Negat[ve Controll
n c⋯ l g Ⅱm ianceolata genomJc DNA digented EcoRI
特异扩增带；而在引物对 OPD07+OPD05的扩增
结果中可见随体染色体在250 bp左右有一特异扩
增带。在多次重复的情况下，实验结果稳定不变。
因此，用任意组合的成对引物对随体染色体扩增产
物和非随体染色体扩增产物进行 RAPD扩增并筛
选出属于随体染色体特异性带是可行的。在后续工
作中，可将特异带分离出来，进行测序分析，然后再
以 PCR的方式重新定回到随体染色体上。
3 讨 论
RAPD-PCR的灵敏度极高，Wiliams等(1 990)
以大豆基因组 DNA为例证明。在被试引物的 3’端
依次改变一个碱基即引起扩增式样的完全不同，因
而产生的多态性很高。人们相信在模板中因为一个
核苷酸变化也会引起同样效应 因此，在理论上，
RAPD能检测 出单个核苷酸顺序的变异。本实验
用 RAPD-PCR检测随体染色体和非随体染色体之
间的多态性．正是基于该技术极高灵敏度的特点
不过，考虑到本实验所用的随体染色体和非随体染
色体都是来自同一个体的同一个细胞，他们的遗传
差异有可能会很小而难以找到属于随体染色体特异
性片段，而使用双引物会有效增加多态性位点，从而
!：g 型!：型 !
图3 用引物对 OPB07-EOPBIO，OPB07+OPB18
OPD07+OPD05对随体染色体和非随体肋
条染色体DOP—PCR产物进行扩增
Fig．3 RAPD proliIe 0f DoP—PCR prodUCtS(rom
satel【ire chromosome and Z0 non—satel】 te chromosomes
using pa Lrwise primers ol OPBO7上OPB10．
0PB07+OPBI8 and OPD07+OPD05
M 分子量1 l，3，s 楱板为随体染色体 DO P—PCR产物l
2．4，6：模板为 20荣非随体染色体DO ~PCR产钉。
MlMarkI 1．3，5；Templat路 0f sa【dllte chrom㈣ eI
2，4，6：tcmp]ates of 2O no．~zatel[ire chromosomes
获得更丰富的 DNA指纹信息(Welsh和 MeCLel—
land，1 991)。故实验中采用双引物进行 RAPD分
析。另外，本实验中还发现用单个随机引物进行
PCR扩增时，实验结果的重复性较差，而用双引物
却能得到较稳定的实验结果 实验结果表明在醢体
染色体和非随体染色体之间的确存在多态性，并获
得了属于随体染色体特异性片段 所得到的这些特
异性片段可做为随体染色体的特异性标签．用于该
染色体的鉴定或该染色体上特定基因的分离以及高
密度物理图谱的构建等相关分子生物学研究。另
外，在获得杉木随体染色体特异性片段的基础之上，
可进一步将该技术扩展到杉木其它染色体，从而有
望实现在分子水平上对杉木染色体进行编号，这将
极大推动杉木染色体的研究 也为植物染色体的研
究提供了新的研究思路。不过．考虑到RAPD反应
的退火温度低(38℃)，且 RAPD的引物序列短(只
有l 0个碱基)，所以获得的RAPD特异片段是否为
稳定的特异片段还存有疑问。因此．要得到稳定的
属于杉木第四号染色体 (随体染色体)的特异性片
(下转第 425页 Continue OFt page 425)
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5期 王恒昌等：丰都车前的细胞学研究，兼论它的多倍体起源 425
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段，还有待于进一步将 RAPD标记转换成更稳定、
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