全 文 ：广 西 植 物 Guihaia 26(6)：692— 696 2006年 11月
L一亮氨酸发酵培养基优化试验
伍时华，徐雅飞，张 健，廖 兰，黄翠姬
(广西工学院 生物与化学工程系，广西 柳州 545006)
摘 要 ：应用 PIackett-Burrnan设计试验从 L_亮氨酸基础发酵培养基的 10种成分 中筛选出 5种重要成分，然后
应用响应面分析试验确定 5种重要成分的最适用量。培养基优化后摇瓶分批发酵 72 h产 L_亮氨酸 18．05 g／L。
关键词 ：L_亮氨酸；发酵培养基 ；优化；响应面分析
中图分类号 ：TQ922 文献标识码：A 文章编号 ：1000—3142(2006)06—0692—05
Study 0n medium optimization 0f
T 0 - 一 』 』0 L—leUcine t-erm entation
wu Shi—hua，XU Ya—fei，ZHANG Jian，
LIAO Lan，HUANG Cui— i
(Department of Biological and Chemical Engineering，Guangxi University of Technology，Liuzhou 545006，China)
Abstract：Five main factors were screened by the Placket-Burman design method from ten ingredients of L-leu—
cine basic fermentation medium．Then，the best level of five factors was determined by response surfaca analy-
sis．The strain TQ9806-1 could produce L-leucine 18．05 g／L after fermentation with optimum medium for 72
hours by flask—shaking batch fermentation．
Key words：L—leucine；fermentation medium ；optimization；response surface analysis
L-亮氨酸是人与动物自身不能合成而必须依赖
外源供给的八大必需氨基酸之一，对维持人体健康
和促进动物生长具有重要作用。由于目前发酵法生
产 L_亮氨酸的菌种产酸偏低，发酵周期长，发酵副
产物多，分离纯化困难(刘建军等，2004)，致使其产
量低，价格高，使之尚主要用于配制复方氨基酸输液
(宋超先等，2004)，因此，进行 L_亮氨酸菌种选育和
发酵工艺条件优化，提高 L_亮氨酸发酵水平，具有
重大研究意义。
近年来，国内对发酵法生产 L_亮氨酸的研究报
道较少，而目前又尚未见到应用响应面分析法进行
L．亮氨酸发酵培养基优化的研究报道。但应用响应
面分析法进行其他发酵培养基 (Zheng等，2000；钟
环宇等，2004；Ooijkaas等，1999；Li等，2002)或产
物分离提取条件(魏安池等，2006；任凤莲等，2006)
优化的研究报道较多，且优化效果明显。
微生物发酵培养基的最佳组成，是保证高产菌
株的高产性能得以充分表达的物质基础。作者在
L_亮氨酸发酵培养基单因素试验(另文发表)的基础
上，参考有关文献(欧宏字等，2001；惠大丰等，1996；
胡良平，2001；Wong，1996)。首先应用 Plackett—
Burman设计试验法从 L_亮氨酸基础发酵培养基的
10种成分中筛选出 5种重要成分，然后应用二次回
归的旋转中心组合设计 5因素 5水平的响应面分析
试验来确定 5种重要成分的最适用量。
1 材料与方法
1．1菌种与培养基
(1)黄 色 短 杆 菌 (Brevibacterium flavum)
收稿日期：2006—06—21 修回日期：2006—10—09
基金项目：广西科学基金项目(GKQ0229012)资助 [Supported by Science Foundation of Guangxi(GKQ0229012)]
作者简介：伍时华(1963一)，男，广西岑溪市人 ，副教授 ，博士，主要从事微生物育种与代谢控制发酵的研究。
维普资讯 http://www.cqvip.com
6期 伍时华等：L-亮氨酸发酵培养基优化试验 693
TQ98O6—1：由广西工学院发酵工程研究室提供，从
黄色短杆菌 TQ98O6改良获得(伍时华等，2001)。
(2)种子培养基：葡萄糖 25，玉米浆 20 mL／L，尿素
2．0(分 消 )，KH2PO4 1．3，MgSO4 0．4，MnSO4
0．01，Met 0．3，VB11300 ttg／L，VH200 ttg／L。(3)
发酵培 养 基 (g／L)：葡 萄 糖 130，玉 米浆 40 mL，
(NH4)2SO4 20，NH4Ac 20，KH2PO4 1．0，MgSO4
0．4，MnSO4 0．01，M et 0．4，lie 0．05，Glu 0．4，VB1
300 p．g，VH 50 p．g，CaCO3 30(分消)，pH7．0～7．2，
0．75 kg／cm 蒸汽灭菌 20 min。
1．2培养方法
种子培养方法：①菌种活化：取斜面保藏菌种划
线接种于活化斜面，28℃恒温静置培养 2O～24 h。
②种子培养：将 1支(j2『18试管)生长良好的活化斜
面种子用适量无菌水洗下，吸取 1／4菌液转入装有
50 mL种子培养基的500 mL三角瓶中，8层纱布封
口，置旋转摇床上，220 r／min，28℃恒温振荡培养
至对数生长末期 。
摇瓶发酵培养方法：将发酵培养基中被研究的
成分(因素)设计成不同水平，其它成分及用量同基
础发酵培养基；按 1O 接种量将种子液 5 mL接人
装有 45 mL发酵培养基的 500 mL三角瓶中，8层
纱布封口，置旋转摇床上，220 r／rain，28℃下振荡
培养 72 h。
发酵分析方法：L一亮氨酸测定：用“纸色谱一薄层
扫描测定法”测定(伍时华等，2003)。
2 结果与讨论
2．1应用 P-B设计试验筛选重要因素
2．1．1试验条件分析 根据发酵培养基单因素试验
结果，取葡萄糖等 1O种成分作为 PB试验的 1O个
因素 X。，Xz，)(3⋯X。。每个因素取两个水平，高水
平取低水平的 1．25倍。以L_亮氨酸产量y(g／L)为
响应值，筛选对产酸影响较大的主要因素。P—B设
计试验因素、水平见表 1。
表 1 P-B设计试验的因素、水平及影响效果
Table 1 Factors，levels of P-B design test and their effect
因素Factors 堡 查 里! ! ! T-检验 概率>ITI 排列
一 1 +1 T-test Prob> lTl Ranking
葡萄糖 Glucose(g／L) 110 137．5 12．65 0．0502 2·
玉米浆 Corn syrup(mL／L) 35 43．75 13．85 0．0459 1一
醋酸铵 Ammonium acetate(g／L) 18 22．5 l1．86 0．0536 3·
硫酸铵 Ammonium sulfate(g／L) 18 22．5 7．81 0．0811 5
蛋氨酸 Metione(g／I ) 0．4 0．5 4．12 0．1513
异亮氨酸 Isoleucine(mg／L) 50 63 —1．22 0．4381
谷氨酸 Glutamic(g／L) 0．4 0．5 8．40 0．0755 4·
生物索 Biotin(~tg／L) 5O 62．5 2．33 0．2586
磷酸氢二钾 Dipotassium hydrogen phosphate(g／I ) 1 1．25 1．44 0．4582
硫酸镁 Magnesium sulfate(g／I ) 0．4 0．5 3．58 0．1732
注：“置信水平 95 l 置信水平 9O 。 Note：”Significant for a 95 confidence level；。Significant for a 9O confidence leve1．
2．1．2试验设计及结果 用 SAS安排 P-B表头，进
行试验。试验安排及结果如表 2。SAS分析的输出
结果 ，经整理后列入表 1。从 T一检验结果可知 ，玉米
浆 Xz、葡萄糖 X。、醋酸铵 X。、谷氨酸 X 、硫酸铵 X
这 5个因素的可信度分别为 95．41 ，94．98 ，
94．64 ，92．45 ，91．89 ，高于 9O ，说明这 5个
因素是对 L一亮氨酸发酵产酸影响较大的重要因素。
2．2应用响应面分析设计试验筛选重要因素的最优
浓度水平
在发酵培养基优化试验中，二次回归的旋转中心
组合设计是一种常用的响应面分析方法。每个因素
取5个水平，以(一2，一1，0，+1，+2)编码。根据相应的
试验表进行试验后，对数据进行二次回归，得到一定
水平范围内的响应面，最后分析响应面，求出最优值。
2．2．1试验条件分析 通过 PB试验 已筛选 出影响
L，亮氨酸产量的5个重要因素是玉米浆、葡萄糖、醋
酸铵 、谷氨酸 、硫酸铵。在此基础上用响应面分析试
验法来寻找上述 5个因素(自变量)的最优浓度水
平，以 L．亮氨酸产量(g／L)为响应值，对应于因变量
y。响应面分析试验因素、水平列于表 3。
葡萄糖的浓度(g／L)毒。，对应于自变量 X 。玉
米浆的浓度(mL／L)毒：，对应于 自变量 X：。醋酸铵
的浓度(g／L)毒。，对应于 自变量 。硫酸铵的浓度
(g／L)毒 ，对应于自变量)(‘。谷氨酸的浓度(g／L)岛，
维普资讯 http://www.cqvip.com
694 广 西 植 物 26卷
对应于自变量 X。。编码变换为：X 一毒 一125／5，Xz
=毒2—40／5，X。=毒。一20／5，X4一 一20／5，X5=e5
- 0．3／5。
2．2．2试验设计及结果 运行 SAS软件得到 5因
素 5水平的响应面试验设计表头如表 4所示。其他
因素采用 PB试验的低水平，摇瓶发酵 72 h的 L-亮
氨酸产量列于表 4。
2．2．3二次回归模型拟合及方差分析 SAS软件分
析的结果，经整理后如表 5、6，决定系数 R2—0．912 9，
说明回归方程的拟合程度良好。
表 3 响应面分析试验因素水平表
1 ble 3 Factors and their levels of response surface analysis
表 4 响应面设计表及试验结果
Table 4 Table for response surface design and the test results
意絮． x1 x2 Xs X4 )(s Y(g／L) 意絮． x1 x2 Xs x4 )(s Y(g／L)
1 —1 -1 —1 —1 1 14．99 17 0 0 0 0 0 17．79
2 1 -1 —1 —1 —1 16．38 18 0 0 0 0 0 17．77
3 —1 1 —1 —1 —1 16．98 19 0 0 0 0 0 17．84
4 1 1 —1 —1 1 17．67 20 0 0 0 0 0 17．82
5 —1 —1 1 —1 —1 16．O1 21 0 0 0 0 0 17．78
6 1 —1 1 —1 1 16．88 22 0 0 0 0 0 17．94
7 —1 1 1 —1 1 16．67 23 -2 0 0 0 0 15．75
8 1 1 1 —1 —1 16．81 24 2 O 0 0 0 16．O5
9 —1 —1 —1 1 —1 15．O6 25 0 —2 0 0 0 15．97
10 1 —1 -1 1 1 17．O9 26 0 2 0 0 0 16．3O
11 —1 1 —1 1 1 16．19 27 0 0 —2 0 0 17．O2
12 1 1 —1 1 —1 15．8O 28 0 0 2 0 0 17．15
13 —1 -1 1 1 1 15．O8 29 0 0 0 -2 0 17．O6
14 1 —1 1 1 -1 17．O9 30 0 0 0 2 0 17．18
15 —1 1 1 1 —1 15．49 31 0 0 0 0 —2 17．21
16 1 1 1 1 1 17．85 32 0 0 0 0 2 16．92
由表 6方差分析得知，回归模型的 F-检验极显
著，说明所拟合的二次回归方程合适。回归方程的
一 次项 (99．33 )和二次项 (99．97 )F-检验极显
著，交互项(90．95 )F-检验显著。说明响应面分析
所选 5个因素的主效应显著。不同因素之间的交互
效应不同，其中X 与 X。，X 与 X。，X。与 X。相互间
的交互作用较大，响应面分析的立体图和等高线图
见图 1～3。由图1～3可直观看出，在 X ，X。，X。的
取值范围内有一最佳值与响应面的最大值相对应。
结合表 7可知，当 X1=0．871，X2=0．195 5，)(5=
1．214 6时，L_亮氨酸的产量最大，最大产量为 l8．O7。
2．2．4二次拟合响应面的分析 对全变量二次回归
维普资讯 http://www.cqvip.com
6期 伍时华等：L_亮氨酸发酵培养基优化试验 695
表 5 回归方程偏回归系数的估计值
Table 5 Estimated values of regressive coefficient in regression equation
P 附
标准
Stan
误差dard T
T-
检
te
验
st P
概
ro b> ]
T
Tj P 附 标准Stan误差dard T-检te验st P概ro b>]TTj rarameterestimated va1ue error I rarameter estimated va1ue error I
130 17．835 0．177 101．000 0．000 0 1333 ·0．186 0．082 2．276 0．043 8
131 0．404 0．090 4．473 0．000 9 1314 0．183 0．111 1．649 0．127 4
132 0．231 0．090 2．555 0．026 8 1324 —0．179 0．111 —1．615 0．134 6
133 0．083 0．090 0．913 0．380 8 1334 0．064 0．111 0．576 0．576 2
134 —0．104 0．090 —1．153 0．273 4 1344 —0．177 0．082 —2．169 0．052 9
135 0．093 0．090 1．O24 0．328 0 1315 0．251 0．111 2．270 0．044 3
1311 —0．482 0．082 —5．901 0．000 1 1325 0．238 0．111 2．146 0．055 0
1312 —0．218 0．111 —1．977 0．O73 7 1335 —0．040 0．111 —0．361 0．724 6
1322 —0．424 0．082 —5．182 0．000 3 阻5 0．171 0．111 1．547 0．150 0
1313 0．104 0．111 0．937 0．368 6 1355 —0．191 0．082 —2．337 0．039 4
1323 —0．085 0．111 —0．768 0．458 6
注；Y平均值：16．739 7；误差标准差：0．442 7；决定系数 R ：0．912 9。
Note；Mean value of Y：16．739 7}Standard deviation of error：0．442 7，Coeficient of determination Rz：0．912 9
表 6 方差分析表
Table 6 Table for variance analysis
方差来源
Source variance
自由度 平方和
Degree of Sum of
freedom squares
F值
F value
概率>F
Prob·> F
注：显著水平9O Note；Significant at 90
Y
模型进行规范形式分析(canonical analysis，又称典
范形式分析)，考察所拟合响应曲面的形状。SAS
运行结果如表 7
由响应面的规范分析可知，回归模型存在稳定
点，稳定点为最大值。Y的最大估计值为 18．O7。
根据表 7各因素的对应值和 2．2．1所列的 5个公
式，可以计算出 5个主要因素的最佳水平值 ，分别为
葡萄糖(专1)129．36 g／L，玉米浆(专2)4O．98 mL／L，醋
酸铵(专。)22．06 g／L，硫酸铵 (专 )23．59 g／L，谷氨酸
图 1 Y—f(Xl，Xz)响应面立体图和等高线图
Fig．1 Three-dimensional and contour line figure of response surface analysis for Y—f(Xl，X2)
Y
图 2 Y—f(Xl，X5)响应面立体图和等高线图
Fig．2 Three-dimensional and contour line figure of response surface analysis for Y— f(Xl，X5)
维普资讯 http://www.cqvip.com
696 广 西 植 物 26卷
Y
图 3 Y=f(Xz，Xs)响应面立体图和等高线图
Fig．3 Three-dimensional and contour line figure of response surface analysis for Y=f(Xz，Xs)
表 7 响应面的规范分析
Table 7 Canonical analysis of respond surface
L-亮氨酸产量 Yield of L-leucine(g／L) 16．95 17．06 16．93 16．89 17．01 16．97 18．05 18．15 17．93 18．02 18．09 18．05
(毒 )0．42 g／L。考虑到试验的实际情况，上述 5个
因素的实际水平分别取 130 g／L、41 mL／L、22 g／L、
24 g／L和 0．42 g／L。根据上述结果，优化后发酵培
养基配 比为 (g／L)：葡萄糖 130，玉米浆 41 mL，
NH4Ac 22，(NH4)2SO4 24，KH2PO4 1．0，MgSO4
0．4，M nSO4 0．01，FeSO4 0．01，M et 0．5，Glu 0．42，
Ile 0．06，VB1 300／~g，VH 50 g，CaCO3 20(分消)。
对优化后发酵培养基进行了验证试验，并与优
化前作比较，摇瓶发酵 72 h的试验结果列于表 8。
分析表 8结果可知，由回归方程所得出的最高
产酸量的预测值与验证试验的平均值很接近，说明
回归方程能够比较真实地反映各筛选因素对 L一亮
氨酸发酵产酸的影响。
3 小结
(1)应用 Placket-Burman设计试验法从 L-亮氨
酸基础发酵培养基的 10种主要成份中筛选出5种重
要成分：玉米浆、葡萄糖、醋酸铵、谷氨酸、硫酸铵。
(2)应用响应面分析试验法确定玉米浆等 5种
重要成分的最适用量，从而优化出摇瓶分批发酵培
养基的最佳组成为 (g／L)：葡萄糖 130，玉米浆 41
mL，NH4Ac 22，(NH4)2SO4 24，KH 2PO41．0，Mg—
SO4 0．4，M nSO4 0．01，Met 0．4，Ile 0．05，Glu 0．42，
VB1 300／~g，VH 50／~g，CaCO3 30(分消)，pH7．0。
参考文献：
Hui DF(惠大丰)，Jiang CJ(姜长鉴)．1996．统计分析系统 SAS
软件实用教程[M]．北京：北京航空航天大学出版社：83．
Hu LP(胡 良平)．2001．Windows SAS 6．12＆ 8．0实用统计
分析教程[M]．北京：军事医学科学出版社：183．
Liu JJ(刘 建军)，Zhao XY(赵祥颖 )，Tian YJ(田延军)，et a1．
2004．Application of L-Leucine and the breeding idea(L-亮
氨酸的应用及其生产菌的育种思路)[J]．Amino Acids＆
Biotic Resource(氨基酸和生物资源)，26(1)：49—52．
Li C，Bai J，Cai Z，et a1．2002．Optimization of cultural medium
for bacteriocin production by Lactococcus lactis using re-
sponse surface methodology[J]．Biotechnol，93：27—34．
Ou HY(欧宏宇)，Jia SR(贾 士儒 )．2001．The application of
SAS system in optimization of microbial culture conditions
(sAs软件在微生物培养基优化中的应用)[J]．J Tianjin
Univ Light Industry(天津轻工业学报)，3：14—17．
Ooijkaas L P，Wilkinson E C，Tramper J，et a1．1999．Medium
optimization for spore production of Coniothyrium minitans
using statistically-based experimental designs[J]．Biotech-
nolBioeng，64(1)：92一 100．
(下转第 701页 Continue on page 701)
维普资讯 http://www.cqvip.com
6期 陈 黎等 ：鱼腥草种质资源氨基酸组成及含量分析 701
Qi YC(齐迎春)，Hu c(胡 诚)，Tian GZ(田国政)，et a1．
2001．Comparison analysis of nutritive composition from the
stem and leaf of Houttuynia cordata(鱼腥草茎 叶营养成分
对 比分析)EJ]．Special Wild Economic Animal and Plant
Research(特产研究)，4：45—46．
Qi YC(齐迎春)，Tian GZ(田国政)，Mou LQ(牟利权)．2002．
Studies on dynamic changes of nutrients in Houttuynia cor’
data Thunh．cultivated in different seasons(不同季节鱼腥草
营养成分的动态变化研究)EJ3．J Hubei Institute for Na·
tionalities(Nat Sci)(湖 北 民族学 院学 报 自然科 学版 )，20
(40)：24—25．
QiaoCZ(乔传卓)，wu MS(吴美 枢)，Dai FB(戴 富宝)，et a1．
1989．Studies on polyploid breeding of Isatis indigotica Fort
(菘蓝多倍体育种的研究)[J]．Acta Bot Sin(植物学报)，31
(9)：678．
Ren YC(任玉翠)，Zhou YG(周彦 钢)．Ling WJ(凌 文娟)，et
a1．1998．Preparation of the nutritional liquid of the Hout·
tuynia cordata(鱼腥草营养液的研制)[J]．Food&Machin-
ery(食品与机械)，1：13—14．
Wu SQ(吴 三桥)，Li XS(李新生 )，Zhou JJ(周建 军)．2000．
Determination of amino acids and other nutritious component
in munda japonica Thunh．and Houttuynia cordata
Thunh．(薇菜、蕺菜中氨基酸及其他营养索含量的测定)
EJ]．AminoAcids& Biotic Res(氨基 酸 和生 物资源 )，22
(3)：65—67．
wu w (吴 卫)，Zheng YL(郑有 良)，Yang RW (杨瑞 武)，et
a1．2003a．Variation of the chromosome number and cyto-
mixis of Houtuynia cordata from China(国产蕺菜的染色体
数目变异及核穿壁现象)[J]．Acta Phytotax Sin(植物分类
学报)，41(3)：245—257．
Wu w(吴 卫)，Zheng YL(郑有良)，Chen L(陈 黎)，et a1．
2002．Isozymes variations among the germplarm resource of
Houttuynia in Sichuan(川产鱼 腥草 种质 资源的 同工 酶分
析)EJ]．J Chin Med Mat(中药材)，25(10)：695—698．
Wu W (吴 卫)，Zheng Y(郑有良)，Chen L(陈 黎)，et a1．
2002．RAPD analysis on the germplasm resources of herba
Houttuynia(鱼 腥 草 种 质 资 源 的 RAPD 分 析)EJ]．Acta
Pharm Sin(药学学报)，37(12)：986—992．
Wu w(吴 卫)，Zheng YL(郑有良)，Chen L(陈 黎)，et a1．
2003． Analysis on genetic diversity of germplasm resources
of Houtuynia cordata by ISSR marker(利用 ISSR标记分析
鱼腥草种质资源的遗传多样性)EJ]．World Sci Tech-Mod-
ern Trad Chin Med(世界科学技术一中药现代化)，5(1)：7o
一 77．
Yang XS(杨小生)，Kang wY(康文 艺)，Liang DN(梁 东妮 )．
2001． Health beverage including Houttuynia cordata
Thunh．and Ligustrum robustum(鱼腥草 苦丁茶保健饮料)
EJ]．Food Sci Tech(食品科技)，O6：44—45．
Yang YX(杨玉 霞 )，wu W (吴 卫 )，Zheng YL(郑有 良)．
2003．Study on comparative anatomy of diferent population
of Houttuynia(蕺菜属不同居群间 比较解剖学研究)[J]．
Guihaia(广西植物)，23(5)：429—435．
Zhu ZY(祝正银 )，Zhang SL(张士良)．2001．A new species of
Houttuynia medicinal plants in Emeishan(峨眉 山蕺菜属 药
用植物一新种)EJ]．Bull Bot Res(植物研究)，21(1)：1—2．
(上接第 696页 Continue from page 696)
Ren FL(任凤莲)，Gu FF(谷芳芳)，wu ML(吴梅林)，et a1．
2006．Optimization of extraction for flavonoids from haw-
thorn by response surface method(利用响应 面分析法优化
山楂中总 黄酮提 取条 件)EJ]．Nat Product Res Develop-
ment(天然产物研究与开发)，18：126—129．
Song CX(宋超先)，Chen N(陈 宁)，Xie YF(谢玉锋)，et a1．
2004．Selection of L-leucine producing strain and study on
its fermentation conditions(L-亮氨 酸产生菌 的选育及其 发
酵条件优化)EJ]．Food and Fermentation Industries(食品
与发酵工业)，3：61—65．
Wei AC(魏安池)，Dai LH(代 丽红 )，Gu wY(谷文英)．2006．
Optimization of extraction conditions for saflower yellow
pigments by response surface methodology(响应面分析法优
化黄色索提取工艺条件)EJ3．Food& Machinery(食品与
机械)，22(2)：1】一13，52．
Wu SH(伍时华)，Li JS(李军生 )，Yu w(余 炜 )，eta1．2003．
A study of the method of determining the amount of L-leu·
cine in fermented liquid(发酵液 L_亮 氨酸 的定量 测定方法
研究—一纸色谱一薄层扫描测定法)EJ3．J Guangxi Univ
nch(广西工学院学报)，14(3)：1—4．
Wu SH(伍 时华 )，Zhang J(张 健 )，Fang J(方 杰)，et a1．
2001．Studies on the breeding of high-yield L-leueine produ-
cing strain by protoplast fusion(原生质体融合技术选育 L_
亮氨酸产生菌的研究)EJ3．Food and Fermentation Indus-
tries(食品与发酵工业)，27(1O)：30—34．
Wong MY．1996．On the statistical analysis of bioassays[J]．
ComputerM ethods and Programs in Biomedicine．49：191—
197．
Zhong HY(钟环宇)，Xu JJ(许 建军)，Jiang B(江 波)．2004．
Medium optimization for S-adenosyl—L-methionine produc-
tion by recombinant Pichia using statistics·based experimen-
tal design(利用响应面分析法优化 氨基丁酸发酵培养基)
[J]．J Wuxi Univ Light Industry(无锡轻工大学学报)，23
(3)：19—22．
Zheng Y，Das P K．2000．Improved response surface method
and its application to stiffened plate reliability analysis[J]．
Engineering Structures，22：544— 551．
维普资讯 http://www.cqvip.com