全 文 ：广 西 植 物 Guihaia 21 (1)：5 3— 58 2001年 2月
柑桔无病原体苗培育研究进展
董高峰．李耿光，张兰英，黄 涛
中国科学院华南植物研究所．广东广州 5】0550)
摘 要：简述了柑桔无病原体苗培育的 2种主要方法：热处理法和组织培养法 其中重点介绍了利用珠心培
养、胚珠培养以及茎嫁接脱陈柑桔病原体的研究现状和最新进展，并就 目前存在的问题及今后的发展方向
进行了探讨 。
关键词：热处理；茎尖嫁接：组织培养
中国分类号：Q943．1 文献标识码 ：A 文章编号：1000—3142(2001)叭 0053—00
Advances in the research of cul tivating
pathogen-free seedl ings of citrus
DONG Gao—feng，L1 Geng—guang，ZHANG Lan—ying，HUANG Tao
(South China 1,utitute ofBotany．Academia 5in&a，Guangzhou 510650，China)
Abstract；Two major methods on cultivating pathogen—free seedlings of citrus were briefly recounted：heat
treatment and tissue culture．W e particularly introduced the recent researching—situation and advances to elimi-
nate citrus pathogens by nucellus culture．ovule culture and shoot—tip grafting，an d also discussed the present
questions and future direction of development．
Key words：Heat treatment；shoot tip grafting；tissue culture
柑桔的病原体病害在全世界 40多个柑桔生
产国普遍都有发生，它们的病原体通常存在于长
期进行无性繁殖的老系品种中，能使植株长势减
弱，生活力降低，生长期变短 ，产量降低，供应期
缩短，品质变劣，严重地威胁柑桔类的生产。
柑桔的病原体病害主要可分为病毒病、类病
毒病和类菌原体病 3种，其中最重要的包括：青果
病 (Greening)或黄龙 病 (Yelow—shoot)、衰退病
(Tristeza)、裂皮病(Exocortis)、鳞皮病(Psorosis)、
碎叶病(TaferleaD等。： 蚜虫传播的衰退病是一
种广泛传播的病毒病，在巴西圣保罗州，衰退病
就曾使 600万株甜橙死亡(占总数的 75 )；美国
1939年在加利福尼亚州，l951年在佛罗里达州；
以色列在 1970年，也先后造成毁灭性灾难 阿
根廷也曾因病毒危害毁灭了l 000万株柑桔 。
在我国南方地区如广东、广西、福建等地柑
桔黄龙病为害尤为严重。经过 4O多年的研究，已
证明是由类菌原体病原和术虱的传延媒介引起
的。这种毁灭性的病害，尚在向云南、江西、浙江、
四JI等地扩散传延，造成很大损失。l975～l976
收稿 日期：1999 07—19
作者简介：董高峰(1 971一)．男．在读博士研究生，植物细胞工程专业
基金项目：中国科学院地方台作基盎项 目(9802)．广东省科技创新百项工程(99) 中美 日国际合作项日(9807)
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广 西 植 物 21卷
年，仅广东汕头地区因黄龙病而死掉的柑桔树就
达 600万株以上“ 。柑桔裂皮病，自1965年由摩
洛哥传人四』I}重庆以来，据 Roistacher。 的调查．
四JI}的柠檬已 100％的感染．并在广西、湖南及湖
北姊归等地传延到甜橙及密柑上
由于柑桔病毒、类病毒以及类菌原体病害主
要通过无性繁殖传染，因此，建立无病原体母本
园、采穗圃，进行无病原体的工厂化育苗，供应无
毒接穗和苗木是消灭柑桔病原体病的重要途径
美国、埃及、巴西、菲律宾、西班牙、日本和其它一
些地方都在开展这方面的工作 ．并已经取得一定
的成效“ ：。西班牙还决定从 1975年起开始全面
供应无毒苗木，10 a内使全国 l8万 hm 柑桔无病
原体化。
目前，无病苗的培育成为发展柑桔生产的重
要一环。它主要分为热处理法和组织培养法 2大
类，后者又可分为：(1)胚珠培养；(2)珠心培养；
(3)茎尖微型嫁接法。
1 热处理脱毒
热处理脱毒法由于其简便易行，效果 比较显
著，在国内外应用较久。最早热处理法是应用于
治疗桃苗的 ‘x 病毒。最初主要是采用温水 50。c
浸泡接穗，但对接芽的伤害 比较严重。’。林孔湘
等“ 在华南农学院首创用蒸汽热处理柑桔黄龙
病接穗，取得了良好效果 。柑桔 的接穗热处理要
求在暖房中先预处理(白天最高温度 28～40。C，
夜晚 24~27。C)3~4个月，效果较好。接穗从果
园取回后，如果立即用湿热空气处理时，它们不
能成活。但当接穗首先通过预处理后再进行热处
理(50。C，4 h)，接穗都能很好地存 活。骆学海
等“”则进一步对两 2种典型的黄龙病症状“均匀
黄化病型 和“斑驳型”的柑桔苗进行了热处理，
他们发现 49。c湿热空气处理 50～6o min或用
50℃ 处理 5O min就可以消灭黄化病病原一类立
克 氏体。但高 日霞和郑和睦“”的实验却表明：尽
管柑桔苗木经 49。c温热空气处理 50 min后疗效
颇佳．但以后苗木的生长势却较弱。
日本的家城洋之“”详细研究了热处理对柑
桔衰退病毒、矮缩病毒和碎叶病毒的去毒效应
他们发现去除夏橙、柠檬上的CTV病毒(衰退病
毒)．最短的热处理 8 d即可得到无毒苗．但要保
证去毒，则需4～5周。另一方面，对于较大的母树
则需要 30周以上的热处理才可以保证全株无毒。
矮缩病毒(SDV)：盆栽温州蜜桔白天 40℃ 下 l2
h，夜间 30℃ 下 12 h进行 6～7周热处理，即可获
得无 SDV的苗术；碎叶病毒(cTLV)：2～4年生
盆栽树苗以白天 41℃ 下 l2 h，夜间 3l。c下 12 h
的交替温度处理，要经 92 d以上才可获得无毒苗
术。因此，不同品种．不同的病毒，热处理的温度
和时间各异。
柑桔植株防毒热处理的方法：林孔湘等“ 将
柑桔用塑料罩放在温室中．处理 3～4个月，白天
温度 28～30。C，夜晚 27～28。c，放置少量水在培
养箱容器底部，即可发生湿热气体。美国加州大
学将要处理的品种，嫁接在特洛亚枳橙砧上，放
人调温培养箱中，温度保持 白天 40。c(6 h)，夜晚
30。C 8 h，芽接后的植株生长 4～5周后弯倒在培
养箱中，放置 7～l 2周后，取出促进芽的萌发生
长“ 。苹果、葡萄植株的防毒，也可用同样的热处
理装置，如能应用自动控制的人工气候箱进行热
处理就更为方便。
热处理法治疗柑桔病原体虽然有较显著的
效果，但经处理后 的苗木和接穗 的存活率较低，
且对护理要求较严格，护理不好易造成苗木大量
死亡 。因此热处理法 目前还不宜广泛用于处理
生产上种植 的苗木和接穗，仅可用于消毒少量苗
木和接穗，以供各地建立无病原体母本园。
此外，热处理虽然对去除大多数柑桔病原体
有效，但是对于那些基本的病毒如裂皮病毒、顽
固病毒的脱除却非常困难。 。
2 柑桔组织培养法脱毒
柑桔组织培养法一般通过珠心培养、胚珠培
养以及茎尖微型嫁接来获得无病原体种苗。前两
种技术主要依据大多数柑桔病原体不能通过种
子传染，由无性胚胎发生所产生的珠心胚植株具
有同母本相同的特性；茎尖嫁接技术的有效性主
要是依据 White。”和 Morel等“ 的研究：病原体
在植物体内分布的不均一性，顶端分生组织几乎
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漫有或检查不出病原体；嫁接后存活后的植株与
母本是完全一致的。
2．1离体珠心培养
人们很早就 已意识到可以对多胚性柑桔品
种进行珠心培养以获得无病毒珠心胚植株“ 。最
早 Ranga—Swamy 通过培养多胚性品种的珠心
获得珠心胚，但是他在培养的时候就已经形成了
珠心前胚。西班牙的Gonzalez Sicilia等 播种主要
的带病良种甜橙，从多胚性种子得到避毒的新生
系。Rangan等 ”则第一个成功地诱导出单胚品种
珠心胚的形成 。Esan等 还对单胚品种的不定胚
胎发生进行了大量的研究。
目前，珠心胚培养已在诱导许多单胚柑桔品
种产生珠心胚上获得成功。Navarro等。”先后在
无核良种 的 Navelate、Washington Navel、Precoz、
Navelima Foyos Washington、Newhal和无核温州
蜜桔上用组织培养法培养珠心胚得到了无病毒
植株。后来 Navarro等 “ 又从单胚性的克里曼
丁桔上，用组织培养方法，培养出无病毒的 Fina、
Nules、Oroval等良种珠心苗。这些无病毒珠心苗
嫁接在抗病毒的特洛亚梗橙砧木上，还可以进行
结果品质的鉴定 。
从不同果龄的果实中获取的珠心在很大程
度上可以影响珠心胚的形成 。Bitters等 曾先后
成功地诱导出授粉后 10～18周的 Temple tangor
品种珠心胚的形成，但是其早期和后期的果实都
没能成功。Esan。 也诱导出授粉后 11～1 2周的
Etrog citron产生珠心胚。Juavel等。 则使用授粉
后 1 2～l4周的Clementine果实诱导产生珠心胚。
实践证明；适合于产生珠心胚 的果实，应是从心
形期到早期子叶形成的阶段。
利用珠心胚培养新生系避毒的方法简便 易
行，其缺点是约有 26 的变异，同时珠心胚实生
苗会具有各种童期性状，如多刺和结果晚，多数
品种往往需要 10 a以上才能结果 ：，这极大地影
响了它在实践中的应用。
2．2离体胚珠培养
从无籽的多胚柑桔品种中获取珠心胚植株
是 比较困难的，一些受控制的杂交品种则比较容
易诱导 出种子，但 是对 另外一些 品种 如脐 橙
(Nave1)，由于其大孢子母细胞极易降解而导致很
难获得任何种子。这种问题可以在它们败育之前
通过离体胚珠培养加以解决。Biters等。 在授粉
时分离胚珠中的珠心加以培养获得了 Robertson
navel、sweet orange的 珠 心 胚植 株。Button和
Bornman。 则从发育的果实胚中分离出完整的胚
珠和珠心进行培养而获得了Washington navel的
珠心胚植株。
胚珠培养主要被用来诱导那些种子易降解
的多胚 柑 桔品 种产 生 珠 心 胚，如 Washington
navel、
．Robertson navel以及 Precoz、Ponkan等品
种。以前从单胚品种中试图培养不育或未授粉的
胚珠都失败了。胚珠可以从发育的果实或花芽分
化期的子房中分离出来，分离时的果龄不会明显
影响其外植体诱导产生胚状体的成功率。胚珠通
常来源于外源授粉后花发育所形成的果实，从实
践的观点来看，使用去雄后花发育成的果实中的
胚珠最适宜。 。
Navarro等。 还发现柑桔胚珠诱导胚状体产
生的机率是相当高的。胚珠能够产生一种类似愈
伤的组织，迅速分化形成胚状体，与前胚很相似。
Button和 Bornman 对此进行了详细的研究，并
将之命名为假胚芽。胚珠的发育非常缓慢，它们
必须移人不含麦芽提取物并附加 1 mg／L GA3或
27 mg／L腺嚎呤的培养基中才可诱导生根“ 。
和珠心胚一样，胚珠培养获得的植株同样具
有多刺，童期长，易产生变异的特点。”。已有报道
表明：胚珠培养对于去除Exocortis、Psorosis、Con—
cave gum和Vein enation病毒十分有效 ，但对
于去除其它柑桔病毒的效果还不太清楚。
2-3离体茎尖嫁接
通过茎尖培养获得无病原体植株最初主要
是运用在草本植物上。 ，但以后却被广泛应用到
其它植物上，如葡萄。”、苹果 、梨。 “ 、大豆。”、
龙眼等。 。但是到目前为止，试图在柑桔类上通
过茎尖培养来获得无病原体苗都没有成功。为
此．在茎尖培养的基础上发明了茎尖微型嫁接技
术．并已初步获得了一些无病原体品种。
Murashige等。”最早将几种柑桔的茎尖嫁接
在砧木实生苗上获得 了成功。经检测，这些存活
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的植株不含有exocords病毒并且不具备童期性
状 。1 975年．Navarro。 详细研究了柑桔的茎尖嫁
接技术，他先后将Lemon、lime和Citron等多种柑
桔品种的茎尖嫁接到“Troyer”枳橙实生苗上．并
且获得得了 30 ～5O 的嫁接成功率，嫁接苗从
室内移植到大田的存活率也超过了 95 。通过田
间指示植物鉴定表明：Lemon、lime和Citron的嫁
接苗都成功地去除了 Tristeza、Psorosis病毒以及
Stubborn spirolasma、Exocortls类病毒．并且所有
这些无病毒苗都没有产生童期性状。在此基础上
他还总结出一套规范性的茎尖嫁接程序，已被以
后的许多实验室所采用。它们具体包括z(1)砧木
的准备 ；(2)接穗的准备；(3)嫁接；(4)嫁接苗的
管理；(5)移植八大田。其中他们所设计的倒“T”
字形嫁接法已成为应用虽为广泛的嫁接方式。
随后，离体 茎尖嫁接技术迅 速发展起来。
1 976年，Navarro 开始在西班牙应用这种方法来
生产无病毒的柑桔母本树，大量推广无病毒接
穗。1 980年以来 ，西班牙、美国、以色列、巴西、El
本等国也都在研究采用茎尖微型嫁接法来培育
无病原体柑桔母本树 ，以防治柑桔速衰病、鳞皮
病、裂皮病、青果病等病毒、类病毒和类菌原体
病“ 。Navarro“”应用茎尖微型嫁接，采取甜橙、克
里曼 丁桔茎尖带有 3个叶原基、约 0．14～0．18
mm长的生长点，嫁接到灭菌组培的特洛亚枳橙
上，获得了 100 的无病毒苗，去掉了包括裂皮
病、速衰病、叶脉突出病、缩叶病等病毒病，但鳞
皮病病毒难以根除。茎尖若从田间或温室 18~25
℃ 气温下采取，经过茎尖嫁接获得的苗木只有
10 以下的植株无毒，而从 27～32。C的暖室中
采集的茎尖经微型嫁接所获得的苗木则有 72
是无毒的植株。说明茎尖嫁接法脱除病原体的效
果 还 与一定 的生态 环境有关。Mukhopadnysy
等。 还首次采用双嫁接法来鉴定 Tristeza、Green
[ng等病毒，并且成功地获得了无病毒的 Darjeel
[ng orange嫁接苗，将 良种繁殖的时间从 2 a缩短
到 l a左右。目前西班牙、美国已经将现有的所有
柑桔 良种都用茎尖嫁接法生产出无病原体的母
本树(如脐橙、夏橙、温州蜜柑、克里曼丁柑、柠檬
等)，然后采取接穗进行繁殖推广。
通过茎尖嫁接技术来获取无病原体苗的工
作在我国开展的也较早。早在 1 978年，李耿光
等 就获得了暗柳、雪柑和柚子等 3个柑桔品种
的离体茎尖培养植株．并首次采用“倒 T字形”方
式将甜橙(Citrus sinensis)带 3个叶原基的茎尖嫁
接到枳壳实生苗上，获得了嫁接绿苗 18．j 的成
活率。但他们没有进一步做病原体鉴定的工作。
从 1 980年开始，华中农大“ 进行了大量的柑桔茎
尖微型嫁接研究，目前已经取得一定的成功，先
后得到了将脐橙、夏橙等优势株系嫁接到抗病毒
的特洛亚枳橙、卡里佐桔橙、枳柚等砧木的 良种
营养系无毒母本树，并繁殖推广到四JI『、广西、湖
北、湖南、江西等省。但他们的工作以去除速衰
病、裂皮病病毒为主，对其它一些病毒、类病毒和
类菌原体未做更详细的鉴定。同时，中国农科院
柑桔所也在茎尖嫁接脱毒方面做了大量的工作。
赵学源等 利用茎尖嫁 接获得 了无裂皮病 毒
(Exocortis)的暗橙、伏令夏橙、尤力克柠檬和费米
耐劳柠檬的植株。蒋元晖等“ 则获得了无裂皮病
的脐血橙品种。他们还进一步将传统的倒T字形
嫁接切 口改为三角形切口，提高了嫁接成活率，
并通过采用“二次嫁接法”将从茎尖嫁接到鉴定
脱毒效果的时间从 1 a缩短至 0．5 a。蒋元晖“ 还
具体研究了柑桔茎尖嫁接过程所应着重注意的
问题，并提出了相应的改进措施，如切割技术、茎
尖切口方形 以及茎尖大小对脱毒率和嫁接成功
率的影响。张秋胜等“ 则进一步对传统的茎尖嫁
接技术作了改进。他将Navarro原有的 5个步骤
缩短为 3个步骤：(1)砧木不剥皮播于培养土；
(2)茎尖嫁接；(3)移栽．从而完全省去了试管培
养过程。
除了柑桔类外，茎尖嫁接技术还广泛运用于
其它果树的脱毒上。如桑树“ 、梨“”等品种，已成
为果树脱除病原体病虽主要的方式。
3 小结与展望
尽管柑桔珠心胚培养能够有效地去除绝大
多数病毒和类菌原体，但是珠心胚植株常常带有
许多童期性状：过 量旺长，多刺 ，结果期极长等
等．往往要栽培许多年后才具备商业价值。此外，
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1期 董高峰等：柑桔无病原体苗培育研究进展
珠心胚 植株尤其是离体培养的珠心胚植株常常
会发生许多变异。
热处理柑桔种苗不会导致明显的变异，也不
会带有各种童期化性状。但是这种技术不能有效
地 去除裂皮病 (Exocorfis)和木质陷 L病(Xylo-
porosis)等世界范围内大量传播的病毒。而且也很
容易损伤种苗。
茎尖嫁接结台适 当的热处理则很容易去除
绝大多数的病毒和类菌原体，包括那些不易被热
处理法所去除的病毒 ，而且茎尖嫁接不会产生变
异，也不具有童期性状。因此，茎尖嫁接法是 目前
最有效的获得无病原体柑桔植株的途径，现在它
已被广泛应用于各种柑桔品种的改良以获取可
以大量繁殖的无病种苗。相信随着生物技术的迅
速发展，茎尖嫁接技术将会与柑桔常规育种、体
细胞杂交以及抗病基因转化等技术结台起来，在
生产中发挥越来越大的作用。
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