全 文 ：广 西 植 物 Guihaia 27(4)：633— 637 2007年 7月
低 pH条件对紫花苜蓿结瘤的影响及机制初探
杨 敏l，2，玉永雄3，黎晓峰l*，顾明华 ，陈秀虎2，张维琚
(1．广西大学 农学院，南宁 530005；2．清远职业技术学院 生物系 ，广东
清远 511510；3．西南大学 动物科学学院，重庆 400716)
摘 要：探讨了低 pH条件下紫花苜蓿根毛变形和结瘤受到的影响及其机制。结果表明，在低 pH条件下，初
生根伸长和根瘤菌 OD6oo值显著下降，根共生结瘤受到明显抑制。在接种根瘤菌、不加 NF的条件下，pH5．0、
pH4．7、pH4．5、pH4．2处理的根毛变形率分别比对照(pH6．5)减少了44．1 、56．4 、60．0 和69．0 ；在加
入NF、不接种根瘤菌的情况下，低pH(4．5)处理，根毛的变形也比对照(pH6．5)减少了45．9 。结果暗示，低
pH条件下苜蓿结瘤初期的结瘤信号传导受阻，这可能是导致酸性条件下苜蓿结瘤减少的重要原因之一。
关键词：低 pH；结瘤；信号传导；根毛变形；苜蓿
中图分类号：$963 文献标识码：A 文章编号：1000-3142(2007)04-0633—05
Preliminary study on the effect of low pH on
the nodulation of Medicago sativa and
corresponded mechanisms
YANG Min1，2，YU Yong-Xiong3，LI Xiao-Fengl*，
GU Ming-Hua1，CHEN Xiu-Hu2，ZHANG Wei_Jun
(1_CollegeofAgriculture，GuangxiUniversity，Nanning 530005，China；2．Department ofBiology，QingyuanPolytechnic
College，Qingyuan 511510，China；3．College ofAnimal Science，SouthwestUniversity，Chongqing 400716，China)
Abstract：Effects of low pH on root hair deformation(RHD)and nodulation in Medicago sati~a were investigated and
corresponded mechanisms was also discussed in present study．It was showed that primary root elongation，the 0D6oo
of Rhizobium meliloti．and symbiotic nodulation of roots were obviously decreased at low pH．At pH5．0，pH4．7，
pH4．5，pH4．2，the rate of RHD was les 44．1 ，56．4 ，60．O and 69．0H respectively than that at pH6．5 in the
presence of R．meliloti．Moreover，in the presence of NF RHD was also less 45．9 at pH4．5 than that at pH6．5．
These results implied that the nodulation signal transduction of Medicago sativa at initial stages of symbiotic nodula—
tion was inhibited at low pH，which might be an important cause resulted in the reduction of nodulation in Medicago
sativa at acidity conditions．
Key words；low pH；nodulation；signal transduction；root hair deformation(RHD)；Medicago satlva(alfalfa)
紫花苜蓿(Medicago sativa)是优质、高产的多
年生豆科牧草，被誉为“牧草之王”，具有很高的营养
价值。通过转基因苜蓿来生产工业酶，应用前景也
十分广阔(Austin-philips等，1994)。但是在实际
生产中，苜蓿的生长、发育受到矿质元素(张健等，
2002；刘美艳等，2004)、微生物 (刘 明志，2005)和
收稿日期：2006-08-02 修回日期 ：2007
[Supported by Natural Science Foundation of Guangxi(0339007)；State Key Basic Research and Development Plan of CNna(2001CB108905)；the National
Natural Science Foundation of China(30360048)；Spec~l Fund for Excelent Youth Teachers of State Education Cornmission(200313553)]
作者简介：杨敏(1971-)，女，四川泸县人，硕士，讲师，主要从事植物营养与环境生态的教学与研究工作，(E-mail)yangmin910@126．com。
。通讯作者(Author for c0resp0ndence，E-mail：lxf@gxu．edu．cn)
维普资讯 http://www.cqvip.com
634 广 西 植 物 27卷
pH值等多种因素的影响。pH值高于 6．2，才能保
持住土壤中的钙、镁、钾等矿质元素，共生细菌才能
正常固氮(Stout，l994)；土壤 pH值低于 5．7，苜蓿
产量会随着 pH 值 的下 降而迅速下降 (Mahler，
2002)。而酸性土壤占到世界可耕地面积的 4O 9，6，
一 些是自然呈酸性的，也有一些是随着季节的变化
呈酸性的，包括过度地使用了一些肥料。由于苜蓿
对土壤酸性非常敏感，土壤酸度大大限制了苜蓿的
栽培种植和利用(Don，2002)，影响南方地区的大面
积种植。
紫花苜蓿在酸性土壤中的生长表现已有相关研
究报道(郭彦军等，2006)，但较系统地研究低 pH条
件对苜蓿结瘤的影响机制国内外尚未见报道。为探
讨苜蓿对酸性土壤的适应性及低 pH抑制共生结瘤
机理，本文以紫花苜蓿为材料，研究了低 pH对苜蓿
根伸长、结瘤、根毛变形、根瘤菌生长的影响，初步分
析了低pH抑制苜蓿结瘤的机制。
1 材料与方法
1．1试验地点和时间
试验在广西大学农业资源与环境实验室及温室
内进行；2002年 7月 2 El开始至2004年 2月 10 El
结束，记录截至 2004年 3月 10 El。
1．2试验材料
(1)紫花苜蓿品种：艾菲尼特(Medicago sativa
cv．Ivynate)，购自山西牧草种子公司。(2)根瘤菌菌
株(Rhizobium meliloti，Strain ASW_1 of R．meliloti)：
由西南大学牧草与草食家畜重点实验室提供。
1．3试验方法
1．3．1幼苗的准备 依次用 75 (v／v)的乙醇和
0．1 (g／v)升汞对种子浸泡消毒 5 min和 15 rain，
无菌水漂洗 8～lO次置于 0．1 (g／v)的水琼脂平
板上，在 25℃恒温箱中黑暗倒置培养 36 h。
1．3．2低 pH值对初生根生长影响的处理 将苜蓿
幼苗植入经过消毒的有孑L塑料板上，幼根浸入于 0．5
mmol·L- CaC1z溶液中，在人工气候箱中培养 1 d
后，选取根长 3 cm左右的幼苗，置于 pH 6．5和 pH
4．5的处理液中培养 24 h。处理培养前后，分别测定
幼根长度，两次测定之差为根伸长量。人工气候箱环
境参数为：25℃，相对湿度 7O ～8O ，光照强度约
54 btmol·m- ·s- ，光周期：昼 l2 h／夜 12 h。
1．3．3不同PH下根瘤菌生长情况的观察 R．7ne—
liloti菌种活化 l d后，各取 l mL接种于 YM液体
培养基中(体积均为 50 mL，pH值分别为 7．0、6．5、
5．0、4．7和4．5)，28℃、l50 r／min振荡培养，每隔 6
h或 12 h后，测其 OD6。值 ( =600 nm，用 UV—
MINI一1240 220VE型岛津紫外分光光度计测定)。
1．3．4根瘤数和地上部生物产量的观测 移植前期
准备的幼苗于内盛经消毒的珍珠岩的培养杯中，培养
杯的底部浸入到 1／5剂量的 Fahraeus无氮营养液
(pH6．5)中使营养液的深度达到培养杯高度的 2／3
(Fahraeus无氮营养液中含 NazHPO4 150 mg·L- 、
MgSO,·7H2O 120 mg·L 、KH2PO,100 mg·L 、
Cac12100 mg·L- 、柠檬酸铁 5 mg·L- 、H3B 2．86
mg·L- 、MnSO,·HzO 2．08 mg·L- 、ZnSO4·7H2O
0．22 mg · L- 、CuSO, · 5H2O 0．08 rng · L- 、
Na2MnO4 0．11 mg·L- )。苗 龄达 到 8 d时，以
pH6．5的Fahraeus无氮营养液为对照，pH4．5作为
处理，同时接种苜蓿根瘤菌，使溶液中根瘤菌数量达
到2×lO 个菌 ·mL- 。处理 3 d后更新处理溶液，并
再次接种。连续处理两次后用经消毒、pH为 6．5的
Fahraeus无氮营养液培养，培养液隔天更换。处理 5O
d后，观测植株根瘤数，称取地上部重量。
1．3．5结瘤因子(Nod factors，以下简称 NF)的制备
参照杨国平等(1996)的试验方法并略为改动：将
水相 NF粗提物在旋转蒸发器 内减压蒸干后用
pH4．5的无菌 Mili-Q超纯水溶解，l×lO Pa下灭
菌 10 min，置-20℃冰箱中保存备用。
1．3．6根毛变形率的观测 将处理液的pH分别调
节至 6．5、5．0、4．7、4．5和 4．2。处理液以Fahraeus
无氮营养液作为基本培养液，并接种根瘤菌(2×10
个菌 ·mL- )。处理 2 d后，在显微镜下观测根毛变
形率。
将苜蓿幼根浸入到 pH4．5和 pH6．5的 0．5
mmol·L- CaC1z溶液中，3 d后观测根毛变形率。
处理溶液在处理前经灭菌处理，不接种根瘤菌，但加
入按 1．3．5准备好的 NF，各处理溶液中NF的加入
量相同，以不加入 NF的处理为对照。
1．3．7统计检验 以上试验重复两次以上，各处理
均设 3个以上重复，邓肯新复级差法进行多重比较。
2 结果与分析
2．1低 pII对苜蓿初生根伸长的影响
将根长约为 3 cm的初生根浸入 pH4．5的 1／5
维普资讯 http://www.cqvip.com
4期 杨敏等：低 pH条件对紫花苜蓿结瘤的影响及机制初探 635
剂量的Fahraeus无氮营养液中，pH6．5为对照。处
理 24 h后观测各处理初生根伸长量。经 pH4．5处
理24 h后，初生根的伸长被抑制了28．6 。多重比
较结果显示，pH6．5与 pH4．5条件下苜蓿初生根的
伸长表现出极显著差异。可见，苜蓿初生根生长具
有比较明显的酸敏感性，低 pH抑制苜蓿初生根伸
长(表 1)。
表 l 低 pH对苜蓿初生根伸长的影响
Table 1 Primary root elongation of
alfalfa at different pH value
pH值 pH value 根伸长量 Root elongation(cm)
6．5 16．92士1．18 A
4．5 12．08士0．90 B
注：表中数据为平均值士标准差，3个重复，每个重复含 15个观测
值。A、B、C、D表示达到 1 的极显著水平，相同字母表示差异不显
著，下同。
Note：Data indicates means士 SE，3 repetitions，15 data per repeti—
tion．A，B，C，D means significant at 1 levels，same letter means no
significance．The same below．
2．2不同pH条件下苜蓿根瘤菌的生长
豆科植物共生固氮的前提之一就是在植物的生
长环境中根瘤菌能正常生长，根瘤菌达到一定的数
量才能对宿主植物维持较高的侵染力。在其他元素
供应充足、氮素水平低的酸性土壤环境中，豆科植物
的结瘤及生长在很大程度上依赖于土壤中根瘤菌的
生长情况和数量的多少(Elkins等，1976)。根瘤菌
的存在不仅导致信号分子量的增加，而且可提高信
号分子的活性。此外，根瘤菌对植物信号分子也有
修饰、分解的作用，并能产生有生物活性 的物质
(Rao等，1995)，有的对 nod基因表达有强抑制作用
(Cooper等，1995)。苜蓿根瘤菌适宜的 pH在 6．5
～ 7．5之间，最适的生长 pH为 6．8～7．2。图 1是
不同pH的 YM液体培养基培养 R．meliloti 24 h
后，R．meliloti菌悬液的 OD60值。
图1表明，在不同酸度的YM液体培养基上接种
R．rneliloti 24 h后，根瘤菌的生长表现出极显著的差
异。以pH7．0为对照，在 pH6．5、pH5．0、pH4．7和
pH4．5条 件下，根瘤 菌 的 OD6。值 分 别 下降 了
23．6 、95．2 、96．8 和 97．O 。这表明低 pH(pH
<5．O)对 R．meliloti的生长有很强的抑制作用。
2．3低 pH对苜蓿共生结瘤的影响
在苜蓿出苗后 8 d，幼苗长出第一对真叶后，以
pH6．5处理为对照，将幼苗培养液 (1／5剂量的
Fahraeus无 氮营养 液)的 pH 调 至 4．5，同时接种
R．meliloti。连续处理 2次共 6 d后，换为 1个剂量
0-8
0-6
0．4
。
0-2
0
7．O 6．5 5．0 4．7 4．5
0H
图 1 接种 24 h不同pH条件下苜蓿根瘤菌的生长
Fig．1 Growth of R．meliloti at different
pH value inoculated 24 h
的Fahraeus无氮营养液继续培养。50 d后植株结
瘤数量及地上部生物产量见表 2。表 2表明，低 pH
抑制苜蓿结瘤和植株生长。与对照处理(pH6．5)比
较，pH4．5处理后，苜蓿结瘤总数减少了 16．9 。
在 Fahraeus无氮营养液培养条件下，植株地上部分
鲜重也相应降低了 15．3 。
表 2 低 pH对苜蓿结瘤及生长影响 (50 d)
Table 2 Effect of low pH on the nodulation and
growth of alfalfa after inoculated 50 d
pH值 pH value 6．5 4．5
总瘤数(个 ·株一 )
Total nodules(nodules·plant- )
地上部分鲜重(mg·株 )
FW of aerial parts(mg·plant- )
9．3士0．2 A 7．7士0．2 B
118．3士2．3 A 98．5士1．1 B
2．4低 pH对根毛变形的影响
植株对酸度最敏感的时期几乎与根毛变形的时
期相一致，或稍早一些(Djordjevic等，1987)。根瘤
菌与豆科植物形成固氮根瘤是一个复杂的过程，在
形态学上宿主植物对根瘤菌入侵最早的反应是根毛
的卷曲。其中，豆科植物与根瘤菌共生互作过程中
的信号识别是一种双向的信号分子交换过程(李庆
逵，1983)。接种根瘤菌条件下，如果根瘤菌与其宿
主植物间无应答反应，宿主根毛是直的(图2：a)，而
被根瘤菌侵染的宿主根毛出现弯曲(图 2：b、图 2：
c)、分枝(图2：d)等变形现象(图2)。
将 Fahraeus无氮 营养液酸度 分别调节 为
PH6．5、pH5．0、PH4．7、PH4．5和 PH4．2，植入苜蓿
幼苗，同时接种 R．meliloti，处理 24 h后观察苜蓿
根毛变形率(表 3)。
由表 3可知，接种 R．meliloti条件下，pH5．0、
pH4．7、pH4．5、pH4．2处理 24 h后，苜蓿根毛变形
维普资讯 http://www.cqvip.com
636 广 西 植 物 27卷
受到极显著的抑制，根毛变形率分别比对照(pH6．5)
减少了 44．1 、56．4 、60．O 和 69．O 。这表明
R．meliloti侵染苜蓿根时，根瘤菌在与宿主植物进
行相互识别的过程极显著地受到低 pH抑制。
图 2 不同处理下苜蓿根毛的变形情况 (×160)
Fig．2 Root hair deformation in different
treatment on alfalfa(×1 60)
a．对照；b，c．根毛弯曲；d．根毛分枝．
a．CK；b，c．Root hair contorted；d．Root hair branched．
表3 接种根瘤菌不同pH对苜蓿根毛变形的影响
Table 3 The effect of different pH at root hair
deformation inoculated R．meliloti
pH值 pH value 根毛变形率 Root hair deformation( )
6．5
5．0
4．7
4．5
4．2
36．24士2．71 A
20．26士1．59 B
15．80士 1．19 C
14．48士1．23 CD
11．22士1．22 D
表 4
Table 4
低 pH对苜蓿根毛变形的影响
Root hair deformation at low pH
pH值
pH value
根毛变形率 Rate of RHD( )
NF(+) NF(～)
从植物根部分泌出的类黄酮化合物，诱导根瘤
菌结瘤基因的表达，结果产生一种叫做 NF的脂寡
糖的合成和分泌(Truchet等，1991)。在没有根瘤
菌存在的情况下，NF可使对应的宿主植物出现根
毛分枝、弯曲及膨胀等变形现象，即根毛变形试验
(root hair deformation assay，简称 Had试验)(Pe—
ters等，1986)。纯化的苜蓿根瘤菌 NF在极低浓度
就可使 苜蓿 出现 Had表 型 (D6nari6等，1993；
Schultze等，1994；Long，l996；Downie等，l999)。
杨国平等研究发现，NF只需与根毛接触 4 h左右，
即能诱导根毛变形(杨国平等，1996)。NF是根瘤
菌引起寄主根毛变形的结瘤信号，高浓度的 NF甚
至可以诱导寄主根系形成空的根瘤(Stokkermans
等，1994)。本研究发现，在苜蓿种子分泌物诱导下
根瘤菌合成和分泌的 NF可以诱导苜蓿根毛发生变
形(图2)。表 4结果显示，在加入 NF的情况下，低
pH(4．5)对苜蓿根毛的变形具有极显著的抑制作
用，根毛变形率减少了 45．9 ；而在不添加 NF也
不接种 R．meliloti的情况下，根毛变形率很低(表
4)。低 pH(4．5)对苜蓿根毛变形无显著影响，说明
缺乏结瘤信号诱导条件下低 pH本身并不抑制苜蓿
根毛的变形。
3 讨论与结论
豆科植物的共生结瘤受到多种因素的影响(慈恩
等，2005)。研究表明，低 pH抑制苜蓿根系的结瘤
(表 2)，这与 Vargas和 Graham在沙培条件下 pH对
菜豆根瘤菌竞争结瘤能力影响的研究结果一致(Vat—
gas等，1989)。低 pH抑制共生固氮结瘤是多因素共
同作用的一系列因果关系，表现为一系列根系的生理
和形态学上的应答反应(杨国平等，1996；Spaink等，
1991)。在苜蓿根系周围有根瘤菌存在的情况下，根
部分泌出的类黄酮化合物，诱导根瘤菌结瘤基因的表
达，产生NF。NF是根瘤菌引起寄主根毛变形的结瘤
信号，在 NF的作用下，根瘤菌侵染苜蓿根系，导致苜
蓿根毛变形——结瘤初期的应答反应。可见，根系结
瘤的过程实质上就是根瘤菌与苜蓿根系问相互作用
的结瘤信号诱导、传导和应答反应过程。在根瘤菌与
苜蓿根系间相互作用过程中，无论哪一环节受到抑
制，都可能会阻碍苜蓿根系结瘤。
在低 pH条件下影响紫花苜蓿结瘤的因素：首
先，根系生长受阻(表 1)抑制了苜蓿的结瘤(表 2)。
苜蓿根系生长受阻使其吸收水分、养分的能力下降，
光合作用降低，影响了结瘤过程中植物向根瘤菌提供
糖类和 ATP能量，从而减弱了根系的结瘤能力。第
二，根瘤菌生长受阻，导致结瘤信号分子数量的减少
和活性的降低；影响信号分子的修饰、分解，降低产生
有生物活性的物质(Rao等，1995)的能力，根瘤菌侵
染根系能力降低，nod基因的表达受到的抑制等
(Cooper等，1995)，从而影响苜蓿的结瘤。Hohenberg
等(1984)和Munns(1970)也报道土壤的酸性条件抑
维普资讯 http://www.cqvip.com
4期 杨敏等：低 pH条件对紫花苜蓿结瘤的影响及机制初探 637
制根瘤菌在土壤中的存活率，从而减少植物的结瘤。
第三，根瘤菌与根系之间的相互作用过程受阻。结瘤
过程中任何妨碍二者间交流的因素均可能导致结瘤
过程受阻。根毛变形是根毛对根瘤菌入侵和 NF诱
导植物共生结瘤初期的应答反应，根毛变形受阻，势
必影响苜蓿的结瘤。低 pH条件下，接种根瘤菌或添
加 NF粗提物情况下，苜蓿根毛变形都受到低 pH的
抑制(表 3、4)，致使苜蓿结瘤受阻。而在不接种根瘤
菌也无 NF存在的情况下，低 pH对苜蓿根毛变形无
显著影响(表 4)，这说明缺乏结瘤信号诱导条件下低
pH本身并不抑制苜蓿根毛的变形。可见，低 pH抑
制了根毛对结瘤信号的感应，在低 pH胁迫下，结瘤
信号传递受阻，根毛变形受到阻碍并最终抑制了苜蓿
的结瘤。
当然，本研究仅侧重于低 pH对结瘤信号的传
导方面做了初步的探讨，苜蓿结瘤的影响机制还有
很多，在今后的研究中进一步深入。
参考文献 ：
李庆逵．1983．中国红壤[M3．北京；科学出版社；74—193
杨国平，朱军，徐苏芸，等．1996．根瘤菌 NF的微量生物检测法
[J]．微生物学通报，23(1)：56-57
Austin-philips S，Bingham E T，Koegel R G．1994．Production of
industrial and animal feed enzymes in transgenic alfalfa[J]．
Springer link，721：234—242
ci E(慈恩)，Gao M(高明)．2005．Research advances in the
efects of environmental factors on the sym biotic nitrogen fixa．
tion of legumes(环境因子对豆科共生固氮影响的研究进展)
[J]．ActaBot Boreali—occident Sin(西北植物学报)，25(6)：1
269— 1 274
Cooper J E，Rao J R，Everaen E，et a1．1995．Metablism of fla—
vonoids by Rhizobia IA．Tikhonovech(eds)．Nitrogen Fixation，
Fundamentals and Applications[M]．Netherland：Kluwer Aca—
demic Publishels：287—292
D~nari6 J，Culimore J．1 993．1ipo-oligosaccharide nodulation fac．
tors：a new class of signaling molecules mediating recognition and
morphogenesis[J]．Cel，74：951-954
D!jordjeric M A，Remond J W，Batley M，et a1．1987．Clovers se—
crete specific phenolic compounds which either stimulate or re-
press nod gene expression in Rhizobiumtrifolii[J]．EMBO．6：
1 173— 1 179
Don Comis．2002．New alfalfa may be ideal for poor soiIs r EB／
0L]．htp／／www．ars usda gov／is／pr／2002／020125．htm，2002
— — 01-04
Downie J A，Walker S A 1999．Plant responses to nodulation fac—
tors[J]．CurrentOpinion in Plant Biology，2：483-489
Guo YJ(郭彦军)，Huang JG(黄建国)．2006．Study on Medicago
sativa L．growth in acid soils(紫花苜蓿在酸性土壤中的生长
表现)[J]．Acta PrⅡ￡Sci(草业学报)，15(1)：84—89
Hohenberg J S，Munns D N．1 984．Efect of the soil addity factors
on the nodulation and growth of V／gna unguiculata in solution
culture[J]．Agron J，76：477—481
Liu MY(刘美艳)，Zhang J(张健)，Zhang w(张伟)．2004．Study
on enhancement of cold resistance of Trifolium by Caz+(Caz+
提高白花苜蓿抗冷性的研究)[J]．Guihaia(广西植物)，24
(2)：174—177
Liu MZ(刘 明志)．2005．The Agrobacterium tumefacien5一media—
ted transformation and characteristics of Medicago sativa(根癌
农杆菌对苜蓿的转化及其特性)[J]．Guihaia(广西植物)，25
(2)：121—12
Long S R．1996．Rhizobium symbiosis：Nod factors in perspective
[J]．PlantCell，8：1 885—1 898．
Mahler R L．2002．Impacts and ma nagement of soil acidity under
direct seed systems-status and efects on crop productions[R]．
Direet seed conference，CA，January．16—18
Munns D N．1970．Nodulation of Medicago sativa L in solution
culture V．Calcium and pH requirement during infection[J]．
Plant Soil，32：9O一102 ’
Peters N K，Frost J W ，Long S R．1986．A plant flavone，luteo—
lin，induces expression of Rhizobium meliloti nodulation genes
[J]．Science，233：977-980
Rao J R，Cooper J E．1995．Soybean nodulating Rhizobia modify
nod gene induces Daidzein and giniste into yield aroma tic prod—
ucts that can influnce gene-inducing activity[J]．MPMI，8(6)：
855——862
Roche P，Faucher C，denarie J，et a1． 1991．Molecular basis of
sym biotic host specificity in Rhizobium meliloti：nodH and nod—
PQ genes encode the sulfation of lipo-oligosaccharide signals[J]．
Ceff，67：1 131— 1 143
Schultze M，Kondorosi E，Ratet P，et a1．1994．Cel and molecular
biology of Rhizobium-plant interactions[J]．Int Rev Cytol，156：
1— 75
Spaink H P，sheeley D M，van Brussel A A N．1991．A novel
highly unsaturated fatty acid moiety of lipo-oligosaccharide Sig—
nals determines host specificity of Rhizobium[J]．Nature，354：
125— 13O
Stokkermans T J W ，Peters N K．1994．Bradyrhizobium Plkai
lipo—oligosaccharide signals induce complete nodule structures on
Glycine SCia Seibold et a1．[J]．Zucc Planta，193：413-420
Stout D G．1994．Growth of alfalfa on acid soils when astablished
with pre-inoculated coated seed[M]．Mricculture and AgriFood
Canada{87——110
Truchet G，Roche P，Lerouge P，et a1．1991．Sulphated lipo-oligo—
sacchride signals of Rhizobium meliloti elicit root nodule organi—
genesis in alfalfa[J]．Nature，351：670-673
Vargas A A T，Graham P H． 1989．Cultivar and pHefects on
competition for nodule sites between isolates of Rhizobium in
beans[J]．Plant soil，117：195-200
Zhang J(张健)，Liu MY(刘美艳)，Xiao w(肖炜)．2002．The
toxic effect of H +on alfalfa leaves(Hgz+对苜蓿叶片的毒害
效应)[J]．Guihaia(广西植物)，22(6)：553—556
维普资讯 http://www.cqvip.com