全 文 ：广 西 植 物 Guihaia 24(5)：463—465 2004年 9月
南瓜种子超氧化物歧化酶某些性质的研究
区炳庆，何丽烂，任吉君
(佛山科学技术学院，广东南海 528231)
摘 要：采用NBT光化还原法，分别研究了不同缓冲溶液、pH值、温度及抑制剂等因素对南瓜种子SOD活
性的影响，并对其类型进行了鉴定，结果表明：南瓜种子萌芽过程中 SOD的合成以Mn-SOD为主，其热稳定性
很高，在酸性条件下活性完全丧失，在 pH8．0 NazHPO4-NaHzPO4缓冲溶液下酶活性最高；酶活性容易被 p-
巯基乙醇抑制，对脲及 DMSO有一定的耐受性。
关键词：南瓜；超氧化物歧化酶
中图分类号：Q946．5 文献标识码：A 文章编号：1ooO一3142(2oo4)O5一O463一O3
tUdV 0n S0nle properties Ot SUperoxide n J 1 ■ n ●1
1● n ● ● 1 dlSm utase otDum DKln seedS
OU Bing—qing，HE Li—lan，REN Ji-j un
(Foshan University，Nanhai 528231，China)
Abstract：The activities of superoxide dismutase(SOD)of Cucurbita sp．seeds were studied with the method of
the photochemical reduction of nitrio blue terazolium (NBT)in different cushioning liquer，pH，temperature
and inhibitor．The form of SOD were also studied．The results showed that：Mn—SOD was composed mainly
in the seed process and the heat stability was very high．The activity was the highest in pH8．0 of cushioning
liquer of Naz HPO4一NaH2 P04 and losed completely in acid condition．The activity was inhibited easily by
mercaDt0ethan0l and able tO bear urea and DMSO in a certain extent．
Key words：Pumpkin；Superoxide dismutase(SOD)
超氧化物歧化酶(EC 1．15．1．1简称 SOD)能
催化超氧阴离子自由基(·Oz一)的歧化作用而成为
O2和 H2O2。McCord和 Fridovich(1969年)发现
酶活性以来，已证明它在生体物中普遍存在，并作为
一 种防御活性氧或其它超氧自由基对细胞质膜伤害
的酶来研究。一直以来，人们对大豆种子(王爱国
等，1983；罗广华等，1984)、花生种子 (罗广华等，
1984)、豌豆种子(Giannopolitis et a1．，1977)、小麦
籽粒 (Beauchamp等，1973)及 玉米 (任 大 明等，
2001)中的SOD研究较多。有关南瓜种子中SOD
的研究尚未见报导，本文对南瓜种子 S0D的一些基
本性质进行了探讨，为进一步研究 SOD在南瓜生长
发育过程中的变化及分离纯化、开发南瓜SOD保健
产品提供理论依据。
1 材料和方法
1．1材料
南瓜(Cucurbita sp．)种子(哈本南瓜)购自广州
市蔬菜种子公司。
1．2培育
种子经表面消毒后，用蒸馏水浸泡8 h，于25℃
下萌芽 3 d。
1．3酶液制备
取萌芽后的种子去种皮，称取0．5O g，加入少量
收稿 日期：2003·08-07 修订 日期 ：2003—12—24
作者简介：区炳庆(1966一)，男 ，广东云浮市人，讲师，主要从事生物化学的教学与研究工作。
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464 广 西 植 物 24卷
预冷的蒸馏水，冰浴中研磨匀浆，最后定容为 5 mL，
匀浆于 4℃、10 000 rpm离心 15 rain，吸取上清液
作酶液，一2O℃冰箱保存备用。
1．4酶活性测定
SOD活性测定参照王爱国等(1983)，酶量为 5O
L，酶活性单位采用抑制 NBT光化还原 5O％为一
个酶活性单位表示。
2 结果与分析
2．1不同缓冲系统对南瓜 SOD活性的影响
本实验分别试验了不同缓冲系统对南瓜种子
SOD活性的影响，结果见表 1。由表 1可知，缓冲溶
液(1)至(7)均可用于南瓜种子 SOD活性的测定，但
(1)至(5)效果较好 ，说明南瓜种子 SOD的构象在这
些缓冲溶液中较稳定，能保持较高的活性，其中以缓
冲溶液 Na2 HPO4一NailzPO,最好，而在缓冲溶液(8)
和(9)中SOD活性为 0，SOD结构完全受到破坏。
表 1 不同缓冲系统对南瓜种子 SOD活性的影响
Table Effects of cushioning system on SOD
activities in Cucurbita sp．seeds
缓冲液类型
(0．1 tool／L)
SOD活性
(U)
对 NBT光
化还原
抑制 ( )
注 ：估性值表不为平均值 士标准差 ，重复三次 ，下表 同。
Note：AVerage士MS express activity and repeat three．Next table san1已
2．2 pH值对南瓜 SOD活性的影响
pH值对南瓜种子 SOD活性的影响见图 1。由
图 1可知，pH值为 1．0～7．0时，SOD活性为 0，不
能抑制 NBT光化还原反应，说明南瓜种子 SOD在
酸性条件下酶分子结构受到破坏而失去活性；碱性
缓冲溶液中，南瓜种子 SOD活性随着 pH值升高酶
活性升高，当 pH8．0时 SOD活性最高，之后，SOD
活性反而下降。因此，由试验可知，南瓜种子 SOD
构象在酸性条件下极不稳定，在弱碱条件下能保持
较好的空间结构，其中以 pH8．0时酶活性最高。因
此，在提纯和测定南瓜种子 SOD活性时必须控制体
系中的 PH值。
图 1
Fig．
7 7,2 7 5 7 8 8 8 5 9 9 5 IO ll I2
pH值
pH值对南瓜种子 SOD活性的影响
1 Effects of p H on SOD activities
in Cucurbita sp．seeds
0 20 25 30 35 4O 50 6O 70 80 90 l()(J
Tempemtur~℃
图 2 温度对南瓜种子SOD活性的影响
Fig．2 Effects of temperature on SOD activities
in Cucurbita sp．seeds
2．3南瓜种子 SOD活性的热稳定性
将酶粗提液于不同温度水浴下保温 10 min后
测定酶活性。由图 2可知，南瓜种子 SOD活性随着
温度的升高而升高，当温度为 3O℃时，SOD活性达
到最大值，随后，酶活性呈下降趋势，于 7O℃条件下
尚保持 47％的活性，8O℃时迅速下降，但还保持
2O 的活性，于 9O℃保温 10 min时才明显失活，说
明南瓜种子 SOD对热是较稳定的，与大豆 Cu，Zn—
SOD于 7O℃(王爱国等，1983)、枸杞 Cu，Zn—SOD
于 6O℃(程光字等，1991)、韭菜 Mn—SOD于 5O℃
(杨雄等，1998)几乎完全失活相比，南瓜种子 SOD
的耐热性要强得多，这为提取纯化南瓜 SOD提供了
更宽阔的温度范围。
2．4变性剂对南瓜 SOD活性的抑制作用
人们常借助变性剂来研究酶的结构。本试验用
0．5 mL的 1 p一巯基乙醇、8 mol／L脲和 4O％二甲
基亚砜(DMSO)与酶液于3O℃下保温 10 min或 24
h来观察南瓜种子 SOD的稳定性，p一巯基乙醇主要
破坏蛋白质中的次级键，脲和 DMSO主要使酶蛋白
肽链伸展并显露内部的疏水键。由表 2可知，p一巯
基乙醇使其催化活性完全丧失，这说明南瓜种子
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5期 区炳庆等：南瓜种子超氧化物歧化酶某些性质的研究 465
SOD中的二硫键极容易受到还原剂的破坏；脲对南
瓜 SOD也有明显的抑制作用，保温 10 min时，酶活
性被抑制 47．0％，而保温 24 h时酶活性才完全丧
失；40％ DMSO对南瓜 SOD的抑制率为5．6 。
表 2 变性剂、抑制剂对南瓜种子 SOD活性的影响
Table 2 Efects of denaturants and inhihitors on
SOD activities in Cucurbita sp．seeds
2．5南瓜 SOD的类型
生物体内的 SOD有 3类(Fridovich，1975)：包
括 Cu，Zn-SOD、Mn-SOD和 Fe—SOD，其中，Cu，Zn-
SOD对 H O 敏感，当 H2O2浓度在 5 mmol／L
H O 以上时活性完全丧失；Fe-SOD对 H O 和氯
仿一乙醇敏感，而 Mn-SOD则 为氯仿一乙醇所抑制。
由表 2可知，南瓜种子 SOD在 1 mmol／L H O 下
活性为 762．5 U，抑制率为 2．6％，在 5 mmol／L
H O 下活性为 746．0 U，抑制率为 4．7 ，而只有
Mn—SOD不受5 mmol／L H2O2的抑制，即 Mn-SOD
活性为 746．0 U；在氯仿一乙醇(2：3 v／v)下测得的
SOD活性为 32．3 U，即抑制率 为 95．9 ，即 Cu，
Zn—SOD活性为 32．3 U，而在 5 mmol／L H2O2：氯
仿一乙醇(1：2：3 v／v)下抑制率为 100．0 。因此
南瓜种子萌芽时所合成的 SOD以 Mn-SOD为主，
其次为Cu，Zn—SOD，而无 Fe—SOD。
3 小 结
本试验采用 NBT光化还原法，分别研究了不
同缓冲溶液、pH值、温度及抑制剂等因素对南瓜种
子 SOD的影响，并对其类型进行了鉴定，结果表明：
(1)在测定南瓜种子 S0D时，宜采用缓冲溶液
(1)～(5)，其中缓冲溶液Na HPO 一Nail PO 效果
最好，能使 SOD保持较高的活性，而氯化氨一NH
及邻苯二甲酸氢钾一NaOH缓冲溶液不能用于南瓜
种子 SOD活性的测定；同时，南瓜种子 SOD在酸性
条件下酶结构极不稳定，容易受到破坏，活性完全丧
失，而在 弱碱 性条 件下 能保 持 较高 的 活性，以
pH8．0时活性最高。因此，在提纯和测定南瓜种子
SOD活性时必须严格选择好缓冲体系。
(2)南瓜种子在 25℃萌芽 3 d，在此过程中南瓜
种子主要合成了Mn—SOD，其次合成了少量的Cu，
Zn—SOD。
(3)南瓜种子 SOD活性随着温度的升高而升
高，在 30℃后活性呈下降趋势，80℃下保温 10 min
还具有 18．9 的活性，90℃后才明显失活，这说明
南瓜种子 Mn-SOD有较强的耐热性；同时，南瓜种
子 Mn-SOD结构容易受还原剂 J3一巯基乙醇的破坏，
活性丧失，而对脲和 DMSO有一定的耐受性。
(4)南瓜种子在萌芽中大量合成了Mn-SOD，且
具有较强的耐热性等特点，在对其分离纯化时，先经
过热处理(60~80℃)以除去遇热变性的杂蛋白，可
简化分离步骤、缩短时间及提高酶的收率，这对于利
用南瓜种子分离纯化及开发利用 Mn—SOD有重要
的理论及实际意义。
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