全 文 ：广 西 植 物 Guihaia 27(3)：401—405 2007年 5月
长筒石蒜居群遗传多样性 RAPD分析
邓传良 ，刘 建2，3，周 坚
(1．河南师范大学 生命科学学院，河南 新乡 453007；2．南京林业大学 森林资源与环境
学院，南京 210037；3．广西林业科学研究所 ，南宁 530000)
摘 要 ：利用 RAPE标记对长筒石蒜 3个居群的遗传多样性及分化程度进行了研究。l2条随机引物扩增出
94个可分析位点，多态 位点 比率 (PPB)为 65．96 ，表 明长筒石蒜 具有 比较 高的遗传多样 性。经 POP—
GENE32分析表明 ：Nei，S基因多样性指数(，1)为0．189 7，香农多样性指数(D为 0．294 5，基因分化系数(GsT)
为0．119 1，基因流(Nm)为 3．698 0。经 WINAMOVA分析表明：居群内遗传变异占71．75 ，而居群间只占
28．25 。遗传多样性分析表明，各居群的遗传多样性水平由高到低为琅琊山居群>宝华山居群>盱眙居群。
遗传分化表明：长筒石蒜各居群间遗传分化程度较低；大部分遗传变异存在于居群内部，表明其具有较强的进
化潜力，自然情况下不会处于濒危状态，野生种质资源的破坏，主要来自于人为干扰。
关键词：长筒石蒜；居群；遗传多样性；随机扩增多志性 DNA
中图分类号：Q943 文献标识码 ：A 文章编号 ：1000-3142(2007)03-0401-05
Analysis of population genetic diversity of Lycoris
ongituba(Amarylidaceae)by RAPD
DENG Chuan-Liang1，LIU Jian2，3，ZHOU Jian2
(1．College of Life Sciences，Henan Normal University，Xinxiang 453007，China；2．College of Forest
Resour~s and Environment，Na巧ing Forestry University，NaNing 210037，Chinai 3．Guangxi
Forestry Research Institute，Nanning 530000，China)
Abstract：Random amplified polymorphic DNA (RAPD)method was applied to assess genetic diversity and popula—
tion structure of Lycoris longituba indicated that L．1ongituba had a high level of genetic diversity．A total of 94 dis—
cernible loci were obtained for al populations using 12 primers，of which 63．02 were polymorphic(PPB=
63．O2 )．As analyzed by POPGENE32，the results were showed as follows：average percentage of polymorphic loci
(PPB=59．59 )，nei’S gene diversity(It一0．189 7)，shaanon’S information index(I=0．294 5)．The lOW value 0f
differentiation(Gsr=0．11 9 1)showed that the differentiation among the populations was low
． Result of analyzing of
molecular variance(AMr、 A)showed that 71．75 of genetic variance was found within populations and 28． 25 of
genetic variance among populations．The results indicated that L．1ongituba had strong evolution potential，under nat—
ural circumstance，which would not be in imminent danger．So the wild germplasm genetic resources breakage of L．
1ongituba mainly came from artificial interference．
Key words：Lycoris longituba；population i genetic diversity；random amplified polymorphic DNA (RAPD)
长筒石蒜(Lycoris longituba)隶属于石蒜科
(Amaryllidaceae)石蒜属，自然分布在江苏(后来发
现在安徽也有分布)，为中国特有种(中国科学院中
国植物志编辑委员会，1985)。其花型大，似百合，花
色很丰富。在我们收集的种质资源中，有很多长筒
石蒜的变异类型，花色奇特，并具罕见的淡绿色花，
收稿日期：2005—09-05 修回El期；2006—03—29
基金项目：国家科技部“863”项目(2002AA241051)[Supported by National High Technology Research and Development Program of China
(2。02AA241O51)]
作者简介：邓传良(1975一)，男．山东定陶人，博士，主要从事植物遗传学研究，(E—mail)DC1 75@163．corn。
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而花型变异也很大，有的还具幽香，为杂交育种选配
亲本提供了丰富的种质资源。同时，它也是优良的
地被植物和切花材料(李淑顺等，2004)。有关石蒜
属植物的研究，多集中在核型(刘琰等，1989)、花粉
形态(任秀芳等，1995)、杂交育种(徐炳声等，1986)
及亲缘关系(Hsu等，1994；张露等，2002)等方面，
而在居群遗传结构方面研究不多(Chung，1999)。
天然居群遗传结构等的研究，有助于阐明植物变异
的性质与环境的关系，对解决该植物系统与进化生
物学问题，以及遗传育种与利用具有重要意义。
随机扩增的DNA多态性分析(RAPD)是 9O年
代发展起来的一种快速、方便的分析不同个体间遗
传差异的技术，可以直接对基因组 DNA进行检测，
已广泛应用于种内不同居群间亲缘关系的研究(杭
炎等，2004；钱韦等，2000；王中生等，2004；Xie等，
2004；Fahima等，1999；Qian等，2001)。本文利用
RAPD技术对长筒石蒜的居群遗传结构进行研究，
了解其遗传变异水平，有助于对其种质资源情况进
行评价，进而采取有效的保护措施。
1 材料与方法
1．1材料
实验材料长筒石蒜采集于安徽琅琊山林场、江
苏盱眙铁山寺国家森林公园、江苏宝华山国家森林
公园。根据 Chung(1999)研究石蒜居群遗传结构采
样方法，每间隔5 m以上采集5个单株，作为一个小
居群，每个采样地选取了 12个亚居群，分别用硅胶
表 l 采集地与样品数目
Table 1 Origin and number of samples
干燥，室温保存(表 1)。将每一个小居群的 5个单
株，等量混合，提取总 DNA(钱韦等，2000)。
1．2方法
1．2．1 DNA提取 采用改 良 CTAB(Rogers等，
1988)和硅珠悬浮(Miligan，1998)两种方法对样品
进行 DNA提取，1 琼脂糖凝胶电泳进行检测。
1．2．2 RAPD扩增 利用 3份分别来 自琅琊山林
场、铁山寺国家森林公园、宝华山国家森林公园的材
料进行预备实验，从 200条随机引物(A、B、C、D、E、
F、G、H、S、X组，每组 2O条)筛选出12个能获得清
晰条带，稳定的引物(A-10、A一16、B一18、C-04、D一20、
E一17、E-19、F一05、G-15、X-2、X一4)用于进一步分析。
扩增反应在美国 PE公司 9600扩增仪上进行，扩增
反应总体积为 20fL：10×Taq酶扩增缓冲液 2 L
(Tris—HC1 200 mmol／L pH8．3，KC1 500 mmol／L，
0．5 9，6 Triton—X 100)，3fL Mg抖 (2O retool／L)，0．4
t~LdNTP(dATP、dCTP、dGTP、dTTP各 10 retool／
L)，1 L随机引物(Operon公司产，10 fmmol／L)，
0．75U Taq聚合酶(上海 Promega公司)，DNA模
板 1O～3O ng。扩增反应程序为：94℃预变性 3
min，进入 4O个 PCR循环(94℃变性 30 S，38℃复
性 30 S，72℃延伸 9O s)，最后于 72℃延伸 7 min。
扩增产物加 2 L上样缓冲液，用 0．5 t~g／ml溴化乙
锭(EB)染色，1．2 琼脂糖凝胶(5 V／cm)在 0．5×
TBE缓冲液中电泳分离，天能 UV一2 000系列紫外
分析仪中300 nm紫外灯下观察并照相。
1．2．3数据统计分析 RAPD是显性标记，同一引
物扩增产物中迁移率一致的条带被认为具有同源
性，属于同一位点的产物并按扩增阳性(1)和扩增阴
性(O)记录电泳带谱，形成 RAPD表型数据矩阵用
于进一步分析(钱韦等，2001)。为反映 RAPD标记
的多态性，统计各引物的多态条带比率(PPB)，并
利用 POPGENE32软件(Yeh等，1997)计算 RAPD
扩增产物的 Shannon多样性指数 J、等位基因数
( n)、有效等位基因数( e)和基因多样性指数(h)。
另外，用 WINAMOVA软件(张富民等，2002；Excofi—
er，1993)分析居群内与居群间的遗传变异水平。同
时，利用 TFPGA软件包(Mark等，2000)计算遗传距
离相似系数，并用 UPGMA法进行聚类分析。
2 结果
2．1引物筛选及 PCR扩增结果
通过两次筛选，共得到 12条扩增产物清晰且多
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3期 邓传良等：长筒石蒜居群遗传多样性 RAPD分析 403
态性强的引物用于 RAPD分析(图1)。共得到随机
扩增谱带 94条，分子量基本都分布在 400～3 000
bp之间，其中有多态谱带 62个，占总的谱带比率为
65．96 (表 2)，平均每个引物扩增出5．2条多态谱
带，表明长筒石蒜遗传多样性水平是比较高的。每
个引物扩增的谱带不等，最多 lO个，最少 6个，平均
每个引物扩增 出 7．8条谱带。这表明长筒石蒜
DNA多态性是丰富的，因此 ，利用 RAPD标记能从
图 1 引物 OPA-16对模板的扩增
Fig．1 Amplified RAPD electrophorestic pattern of Lycoris longituba using primer OPA一16
表 2 RAPD扩增结果
Table 2 Results of RAPD amplification
表 3 居群遗传指数
Table 3 Indices of population genetics
DNA水平上检测长筒石蒜居群的遗传结构。
2．2居群遗传结构
POPGENE32软件分析得到长筒石蒜居群遗传
结构的4个指数：等位基因数(n“)、有效等位基因数
(nP)、基因多样性指数(^)和 Shannon多样性指数 J
(表 3)。此外，进行物种水平分析，得到总基因多样
度Ht=0．189 7，各居群基因多样度 Hs=O．167 1，基
因分化系数 一0．1l9 1，基因流 Nm 3．698 0。
2．3 AMOVA分析结果
AMOVA分析结果表明大部分遗传变异存在
于居群内(表 4)。
表4 AMOVA分橱结果
Table 4 Results of Analysis of Molecular
Variance(AMOVA)
变异来源
Source of
variation
变
Va
异
ri
期
anc蓍e Per笔ce ntageexpectalonF0Pv ‘【)
注：1 000次 permutation显著性检测。
2．4 UPGMA结果
TFPGA软件包计算遗传距离相似系数，并用
UPGMA法进行聚类分析，得到长筒石蒜不同居群
的聚类图(图 2)。
4 讨论
4．1居群内遗传多样性
本文用 RAPD标记分析了长筒石蒜的遗传多
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态性。根据等位基因数(”n)、基因多样性指数(h)
和香农多样性指数(J)，各居群遗传变异由高到低为
居群 LYS>BHS>XY，而有效等位基因数(ne)的
分析结果有所不同，遗传多样性 由高到低为居群
BHS> LYS> XY。
琅琊山居群
盱眙居群
宝华山居群
图 2 UPGMA 聚类 图
Fig．2 UPGMA dendrograms
石蒜属植物是单子叶植物中颇为特殊的类群，
主要表现在：不同种的发叶期存在着显著差异，一部
分种于秋末发叶而另一部分则于初春展叶，物候期
相差数月，故区分为秋出叶种和春出叶种两类，但它
们的开花期却基本一致；该属植物的营养生长期与
生殖生长期是不连续的，即具有明显的阶段性，当夏
季气温高于 25℃，叶片开始枯萎直至落叶，进入秋
季，该属植物又陆续开花。因此呈现出有叶无花，有
花无叶的奇特现象，这在显花植物中是十分罕见的
(张露等，2002)。长筒石蒜是春出叶种，作者于8月
份调查长筒石蒜的花色情况，结果表明：琅琊山居群
及宝华山居群花色都非常丰富，有白色、粉红色、黄
色、淡绿色等；花型变异也比较大，有大花型，也有小
花型；有百合型，也有略微反卷型；花朵数 目也有差
异，有5～7朵，还有 10朵以上。并且长筒石蒜在琅
琊山分布最广，变异类型最多。而盱眙居群主要以
白色为主，变异类型不太丰富。这与基于 RAPD标
记的分析结果一致，即不同居群表型的差异得到基
因多样性的证实。
4．2居群遗传结构
用 POPGENE32分析的基因分化系数 G 及用
AMOVA进行的遗传变异分析都说明遗传变异大
部分存在于居群内部，也即居群间没有产生显著的
遗传分化。基 因分化系数 G =0．119 1，表明
l1．9l％的遗传变异存在于居群间，而 88．09 9／6的遗
传变异存在于居群内部。单子叶植物G田 平均值为
0．231(Hamrick等，1990)，因此长筒石蒜各居群遗
传分化偏低。同样，AMOVA分析也表明，居群间
的遗传变异占了 28．25 ，居群内的遗传变异达到
了 71．75 。长筒石蒜居群内如此高的遗传变异水
平，可能是因为长筒石蒜与石蒜属其它种进行杂交
的结果。石蒜属植物在天然状态下极易杂交(Hsu
等，1994)，且在长筒石蒜分布地域，存在着其它石蒜
属种类，如中国石蒜 (L．chinensis)、换锦花 (L．
sprengeri)、安徽石蒜(L．anhuiensis)等二倍体可育
种，长筒石蒜与这些种之间可能会产生种问杂交，进
而产生不同类型的变异。从基因流来分析，基因流
(Nm)可通过 Wright的公式 Fst一1／(1+4Nm)得
到。公式中Nm表示每个世代所迁移个体的数量。
长筒石蒜居群 的基因流 Nm 为 3．698 0。据报道，
如果每代迁入个体数 Nm>4，或更普遍地认为 Nm
>1，基因流就能抵制居群内遗传漂变的作用，也同
时防止了居群分化的发生；若 Nm<1，漂变就成为
刻划居群遗传结构的主导因素(刘占林等，2001)。
因此，长筒石蒜各居群间没有出现明显的分化。在
植物中，基因流是借助于花粉、种子、孢子、营养体等
遗传物质携带者的迁移或运动来实现的，其中花粉
和种子的扩散和传播是两种最主要的形式(Ham—
rick，1987)。长筒石蒜 既可 以进行有性繁殖 ，又可
以进行无性繁殖。不过，石蒜属植物种子与花粉传
播能力有限，有性繁殖产生的个体只存在于 2～6 1TI
的空间内(Chung，1999)，并且长筒石蒜分布区域之
间间隔距离是比较大的。因此，长筒石蒜居群间的
基因交流通过花粉与种子的扩散方式进行几率是很
小的。但是，在琅琊山、盱眙及宝华山，长筒石蒜分
布区域附近都有大的寺庙铁山禅寺、隆昌寺、琅琊
寺，因此可以推断僧人可能在长筒石蒜传播中起到
一 定的作用。
4．3种质资源的保护
保护物种，从某种意义上说，就是保护物种的遗
传多样性或进化潜力。种内遗传多样性愈丰富，物
种对环境变化的适应能力愈大，其进化潜力也就愈
大。因此，了解物种遗传变异在空间上的分布格局
对于制定科学的保护策略起着极为重要的作用。显
然，对一个遗传变异主要分布于居群之间的物种和
一 个遗传变异主要分布于居群之内的物种应该有完
全不同的取样和保护方针。在实际取样时，对于一
个基因流比较小，G 值为 0．6O的物种，至少要取样
6个居群才能保护其 95 的遗传多样性，而对于
G 值为0．2O的物种，要达到同样的效果只需取样
2个居群就足够(葛颂，1997)。在本文的研究中，长
筒石蒜居群间的G 值为0．119 1，这就意味着只需
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3期 邓传良等：长筒石蒜居群遗传多样性 RAPD分析 405
取 l～2个居群就可 以了，但必须在居群内采集尽可
能多的个体。因此，在天然状态下，长筒石蒜具有很
大的进化潜力 ，不会 自然灭绝 ，而是人为干扰对植物
破坏较大。随着对石蒜属植物药用成分的研究，人
们过多注意它的药用价值，对其进行无计划地采挖，
使野生资源受到很大破坏。因此 ，尽快制定保护长
筒石蒜野生资源的相应措施势在必行，且长筒石蒜
的人工栽培蕴含巨大的市场前景和社会效益。
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