全 文 ：广 西 植 物 Guihaia 24(1)：64— 68 2004年 1月
低温 胁迫对 巨尾桉幼苗膜脂
过氧化及保护酶的影响
吕成群 ，黄宝灵
(广西大学林学院，广西南宁 530001)
摘 要：以木本植物巨尾桉幼苗为材料，研究低温胁迫对巨尾桉膜脂过氧化及保护酶的影响，测定了幼苗叶
片的 O7(超氧阴离子)产生速率、H202、(过氧化氢)、MDA(丙二醛)含量 、相对 电导率和 SOD(超氧化物歧化
酶)、POD(过氧化物酶)、CAT(过氧化氢酶)、APX(抗坏血酸过氧化物酶)活性。结果表 明：低温胁迫使 叶片
0_产生速率、H202、MDA含量 和相对 电导率增加 ，但抗寒锻炼植 株的增幅远小于对照 ；抗寒锻炼植株的
S0D、POD、CAT和 APX活性均低于对照。
关键词：巨尾桉；低温胁迫；膜脂过氧化；保护酶
中图分类号：Q945 文献标识码 ：A 文章编号 ：1000—3142(2004)01—0064—05
Effects of lOW temperature stress on membrane
lipid 一 一 and cell defense1~1DeroxlOatlon t enzyme
activity。 leaves of E．grandisin 0 alS×
E．urophylla seedlings
LU Cheng—qun，HUANG Bao—ling
(F0r trv C0 ．G“nncxi【 iverSitv．Nanning 530001．China)
Abstract：E．grandis X E．urophylla seedlings were used as materials，and effects of low temperature stress on
membrane lipid peroxidation and cell defense enzyme in leaves were studied．03-production rate，contents of
H2 02 and amlondialdehyde(MDA)，relative conductance ratio，and activity of superoxide dismutase(SOD)，
peroxidase(POD)，catalase(CAT)and ascrobate peroxidase(APX)were determined．The results showed
that the rate of OT production，the contents of H2 02，and amlondialdehyde(MDA)and the relative conductivi—
ty rate were increased under low temperature stress，but the extent of raise on cold pretreated seedlings were
1ower than that of unpretreated．Activity of SOD，POD，CAT and APX on cold pretreated seedlings were 1ower
than that of unpretreated．
Key words：Eucalyptus grandis X E．urophylla；low temperature stress；membrane lipid peroxidation；cel
defense enzyme
自由基伤害学说(Mccord和 Fridovich，1969)
认为，在正常情况下，植物细胞中存在着活性氧的产
生和清除 2个过程。逆境胁迫会促进活性氧产生，
损伤膜系统(陈少裕，1991)。有些酶如超氧化物歧
化酶(SOD)、过 氧化 物酶 (POD)、过 氧化氢酶
(CAT)和抗坏血酸过氧化物酶(APX)等可清除活
收稿 日期 ：2003—01—08 修订 日期 ：2003—03—20
作者简介：吕Ii~ (1957一)，男，广西平南人，副教授，博士，从事植物生理学和林木生物技术工作。
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1期 吕成群等：低温胁迫对巨尾桉幼苗膜脂过氧化及保护酶的影响 65
性氧自由基，从而防止自由基的毒害，为此将它们称
为保护酶 系统 (Fridovich，1975)。根 据这一 理论 ，
人们对活性氧自由基与植物抗寒性关系的研究正在
日益深入(曾韶西等，1987；王丽雪等，1996)，但这些
研究大多以农作物为材料。巨尾桉树干通直、材质
优良，主伐期短，5～7 a即可采伐，属速生丰产树种，
正在华南地区大面积推广种植(吕成群等，2001)。
我国种植的巨尾桉从澳大利亚引种，属热带亚热带
喜温树种，它不耐低温，在低温胁迫下，树木非常容
易受到伤害甚至被冻死，严重影响了桉树在更大范
围的地区栽培。本文以巨尾桉为材料，研究低温胁
迫对巨尾桉叶片膜脂过 氧化及体 内保护酶的影响 ，
为巨尾桉的引种、栽培和育种等提供一些科学依据。
1 材料与方法
1．1实验材料
选取根系发达、长势一致的巨尾桉 (Eucalyptus
grandis×E．urophylla)组培苗分成 2组，一组温度
控制在 5℃，称为经过抗寒锻炼的植株；另一组温度
控制在 25℃，为对照即未经锻炼的植株。培养2O d
后，将两组幼苗分别置于一5℃下进行低温胁迫处
理。处理 0、24、48、72、96 h分别取叶片(从下 自第
二叶片起，同一测定指标取同一序号的叶片)测定。
1．2相对电导率的测定
叶子用蒸馏水冲洗干净，然后切成块(1 cm×1
cm)，分成甲、乙两组，乙组样品置沸水浴中 15 min。
然后分别浸于 2O mL重蒸馏水中，经抽真空减压，2
h后用 DDS-11A型电导仪测定浸泡液中相对电导
率 。
1．3丙二醛(MDA)测定
参照 Hendry等 (1993)的 方 法 提 取 和 测 定
MDA的含量。0．5 mL提取液，3 mL 0．5 9／6硫代巴
比妥酸，煮沸 15 min，迅速冷却，1 800×g离心 10
rain后，在 534 nm和 600 nm波长下测定光密度值 。
用标准MDA溶液作标准曲线，计算样品中 MDA
的含量。
1．4超氧物歧化酶(SOD)活性测定
参照 Donahue等 (1997)，Schickler和 Caspi
(1999)的方 法。3 mL反 应 液 中 含 甲硫 氨 酸 13
mmol／L，氯化硝基四氮唑蓝(NBT)75 fmol／L，核
黄素 16．7 gmol／L，EDTA 0．1 mol／L，磷酸缓冲液
50 mmol／L(pH 7．8)。以抑 制 NBT光 氧化还 原
50 9／6酶量为 1个酶活单位，用 U ·mg protein表示
酶活性。
1．5过氧化物酶(POD)活性测定
参照Amako等(1994)的方法。3 mL反应液中
含磷酸缓冲液 0．2 mol／L(pH6．0)，1．355 fLH202，
愈创 木 酚 0．855 L。以△A470·mg protein·
min- 表示酶活性。
1．6过氧化氢酶 (CAT)活性测定
用曾韶 西等 (1991)的方 法 ，以 1 min酶解 1
fmolH2O2为 1个酶活力单位，用 U·mg protein
表示酶活性。
1．7抗坏血酸过氧化物酶(APX)活性测定
采用沈文飚 和徐朗莱 (1996)的方法 。以 1 min
催化 1 fmol抗坏血酸氧化的酶量为 1个活力单位，
用 U ·mg protein表示酶活性 。
1．8超氧阴离子 (o )产生速率的测定
按照王 爱 国和罗 广华 (1990)的方法测 定，用
nmol·g FW ·min 表示 。
1．9过氧化氢 (H：o：)含量的测定
取0．5 g鲜叶，加人 5 mL冷丙酮研磨提取。按
照林植芳等(1998)的方法测定 HzO：含量。实验重
复 3次，文中数据均为 3次实验结果的平均值。
2 结果与分析
2．1低温胁迫对巨尾桉幼苗叶片活性氧自由基含量
的影响
图 1：A结果表明，在 0 h，经过抗寒锻炼植株的
O 生速率略高于对照。但在低温胁迫过程中，锻
炼植株的 O_产生速率 的增加趋势明显低于未锻炼
植株，在24 h，锻炼植株的O 生速率为0 h的 1．4
倍，而对照则为 0 h的 4．3倍。在随后的胁迫处理
时间里，无论是否经过抗寒锻炼，Q 生速率缓慢
上升或稍有回落。
从图 1：B可以看出，在 0 h，经过抗寒锻炼植株
的 H。O。含量稍高于对照，但在低温胁迫过程中，其
H。O。含量的上升速度明显低于对照。在 48 h达到
峰值时，锻炼植株的 H O。含量是 0 h的 2．0倍，而
对照植株是 3．9倍。
2．2低温胁迫对 巨尾桉幼苗体 内保护酶活性的影响
从图 2可以看出，锻炼植株的 SOD、POD、CAT
和APX活性均比对照的低，且其变化趋势较小，酶
活性保持相对的稳定性，而对照植株的这 4种酶活
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性则表现出先大起后大落的急剧变化趋势。在低温
胁迫的前 24 h，无论是否经过抗寒锻炼，这 4种酶的
活性均升高。对照植株上升速度更快，在 24 h，
SOD活性是 0 h的 1．9倍 ，POD活性是 0 h的 1．6
倍 ，CAT活性是 0 h的 1．6倍 ，APX活性是 0 h的
1．6倍；而锻炼植株在 24 h，SOD活性仅是 0 h的
1．3倍，POD活性比 0 h仅上升 14．O ，CAT活性
比0 h仅上升 25．0 9／6，APX活性 比 0 h仅上升
l6．7 。在以后的低温胁迫过程中，这 4种酶的活
性呈下降趋势，对照植株下降的速度更剧烈，到 96
h，SOD活性比24 h时的下降 45．0 9／5，POD活性比
24 h时的下降 50．0 ，CAT活性比24 h时的下降
45．8 9／5，APX活性比24 h时的下降41．7 9，5，而锻炼
植株的酶活性下降较慢，保持相对的稳定。
Timo t／h
— -◆一 Co Id pretreated —-卜 UnDretreated
图 1 低温胁迫对0一产生速率(A)和
H202含量(B)的影响
Fig．1 Effects of low temperature stress on oT
production rate(A)and H2 02 content(B)
2．3低温胁迫对巨尾桉幼苗叶片相对电导率和
MDA含量的影响
从图 3：A可以看出，低温胁迫都增加了巨尾桉
幼苗叶片的相对电导率，并随着胁迫的进程，相对电
导率在上升。在前 24 h，抗寒锻炼植株的相对电导
率稍低于对照。从 24 h以后，两者的差异明显加
大，在 96 h，对照的相对电导率是锻炼植株的 1．8
倍，锻炼植株保持相对平稳的变化趋势，而对照则急
剧上升 。
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Time t／h
— ◆一 CoId pretreared —．卜-Unpret reared
图 2 低温胁迫对 S0D(A)、POD(B)、
CAT(C)和 APX(D)活性的影响
Fig．2 Effects of low temperature stress on activities
of S0D(A)，POD(B)，CAT(C)and APX(D)
图 3：B结果表明，在 0 h，经过抗寒锻炼的植株
MDA含量稍高于对照。但在低温胁迫过程中，锻
O O O 0
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1期 吕成群等：低温胁迫对巨尾桉幼苗膜脂过氧化及保护酶的影响 67
炼植株的MDA含量只有微小的上升，在 96 h内都
保持相对的稳定 。而对照植株 的 MDA含量在低温
胁迫24 h内急剧上升，比0 h增高了2．0倍，并是锻
炼植株 24 h时的 2．0倍 ，以后也 明显 高于锻炼植
株。
3 讨 论
0．伤害植物的机理之一在于参与启动膜脂过
氧化或膜脂脱酯作用(吕成群等，1996)，H：O：不是
自由基，但由于其具有强氧化性，也是可以造成氧毒
害的活性氧之一。在植物的生长过程中，植物体的
一 些氧不可避免地活化形成对细胞有伤害的活性
氧。但巨尾桉幼苗经过抗寒锻炼后，虽然 O_产生速
率和 HzO：含量都有所上升，但它对低温的敏感程
度却明显下降，在相同低温胁迫下，锻炼植株 O_和
H：O：的增加趋势却远小于对照(图 1)。由此可见，
低温胁迫下活性氧 O_产生速率和 H：O：含量的增
加与抗寒性密切相关，增加的速率越小，抗寒性越
强，反之抗寒性越弱。
20
16
0 24 48 72 96
Time t／h
— -—●_ Co ld pretreated ·-■●一 Unpretreated
图 3 低温胁迫对相对电导率(A)和
丙二醛含量(B)的影响
Fig．3 Effects of low tempertature stress on reative
conductance ratio(A)and MDA content(B)
在低温胁迫过程中，体内产生过量 O ，SOD活
性有随底物 O_浓度增加而上升的特性(田长恩等，
l999)。在前 24 h，无论是否经过抗寒锻炼 ，SOD活
性都明显 升 高 ，SOD 活性 提 高，歧 化产 生较 多 的
H：O：，又诱导 POD、CAT和 APX活性提高(图 2)。
值得注意的是，经抗寒锻炼的巨尾桉的 4种保护酶
活性均低于对照，但这并不意味着经抗寒锻炼的巨
尾桉在遭受低温胁迫时这 4种酶清除活性氧 O_和
H O 能力的下降，因为在低温胁迫进程中，与对照
相比，锻炼植株的这 4种酶活性能保持相对稳定，其
活性下降的速度明显小于对照(图2)。这些酶的相
对稳定性利于保持活性氧与保护系统的平衡。而对
照植株在低温胁迫过程中，这 4种酶活性呈先大起
后大落的急剧变化，会造成活性氧的突然大量产生，
从而使机体受伤害。
低温引起细胞膜系统受损是植物低温伤害的一
个重要原因，这是因为植物在低温胁迫下会导致活
性氧代谢的失调和 自由基的积累，并进一步导致细
胞结构的损伤和生理代谢的紊乱(陈亚华等，2000)。
在连续的低温胁迫下，巨尾桉幼苗叶片相对电导率
和作为膜系统损伤重要指标之一的 MDA含量都在
增加。值得注意的是，对照植株在低温胁迫的前 24
h，叶片相对电导率变化不大，但 MDA含量在前 24
h就急剧上升，并明显高于锻炼植株，说明未经锻炼
的巨尾桉在防止或降低 MDA产生的能力较低。经
过抗寒锻炼后，虽然相对电导率和 MDA含量都有
所增加，但在低温胁迫进程中其增加幅度远远小于
对照(图 3)。说明经过抗寒锻炼，在一定程度上阻
止膜脂过氧化反应，保护膜的完整性，这意味着抗寒
性的提高。
经抗寒锻炼的植株，其 O一产生速率与 H：O：含
量的增加相比较，前者小得多；而它的相对电导率和
膜脂过氧化形成的 MDA亦很小，而未经低温锻炼
过的植株则变化很大。说明膜脂过氧化引起膜通透
性的改变主要是由于 O一起作用。由于经抗寒锻炼
过的植株对低温有较好的抗性，故叶片内 O 的增加
不大，对膜的破坏性也不大，而保护酶活性的变化也
不大。因此，经低温锻炼过的植株对低温有较强的
抗性主要是抑制了 O 的产生速率。从未经抗寒锻
炼的的植株看，在低温胁迫 24 h内 o7的产生速率
很快，膜脂过氧化引起 MDA在明显增加，但由于保
护酶活性也相应增强，故膜遭受破坏较轻，但当低温
胁迫 24 h后，o瑚 产生速率仍在增加，而保护酶活
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性明显下降，尽管此肘 MDA含量无明显的增加，但
膜被破坏则较明显，这也表明膜被破坏主要是由于
0_的产生。从以上实验的结果综合分析都说明了
在低温胁迫下 O_是破坏膜的主要因素。保护酶一
旦超出了它们清除 O7-的能力，即会造成 O7-的累积，
加大对膜的破坏。
综上所述，造成巨尾桉幼苗低温伤害的主要原
因是体内活性氧代谢的失调。低温锻炼可以减弱低
温胁迫引起的活性氧增加，在低温胁迫过程中降低
了活性氧对膜系统的伤害程度，从而减轻了低温胁
迫的伤害，提高了巨尾桉的抗寒性。
参考文献 ：
Amako K，Chen GX，Asade K．1994．Separate assays spe—
cific for ascorbate peroxidase and guaiacol peroxidase and
for the chloroplastic and cytosolic isozymes of ascorbate
peroxidase in plants[J]．Plant Cell physiol，35：497—
504．
Chen SY (陈少裕)．1991．Injury of membrane lipid peroxi—
dation to plant cell(膜脂过氧化对植物细胞的伤害)
[J]．Plant Physiol Commun (植 物生理学 通讯)，27
(2)：84—9O．
Chen YH (陈亚华)，Shen ZG (沈振 国)，Liu YL (刘友
良)．2000．Effects of chilling and high pH stresses on the
ATPase activities of plasma membrane and tonoplast vesi—
cles isolated from rice(oryza sativa L)roots(低温、高
pH胁迫对水稻幼苗根系质膜、液泡膜 ATP酶活性的影
响)[J]．Acta Phytophysiol Sin (植物生理学报)，26
(5)：407—412．
Donahue JL，Okpodu MC，Cramer CL．1997．Responses of
antioxidants to paraquat in pea leaves[J]．Plant Physi—
ol，113：249—257．
Fridovich r．1975．The biology of oxygen radical[J]．Sci—
ence，201：875—880．
Hendry GAF，Thorpe PC，Merzlyak MN．1993．Stress indi—
cators[A]：lipid peroxidation．In：Hendry GAF，Grime
JP(des)．Methods in Comparative Plant Ecology[C]。
London：Chapman& Hall，154—156．
Lin ZF(林植芳)，Li SS(李双顺)，Lin GZ(林桂珠)，等．
1988．Senescing leaves and chloroplasts in relation to lipid
peroxidation(衰老叶片和叶绿体中 H202的累积与膜脂
过氧化的关系)[刀．Acta Phytophysiol Sin (植物生理
学报)，14 (1)：l6—22．
L0 CQ (吕成群)，Huang BL (黄宝灵)．2001．Studies of
the growth promoting and physiological effects of rare-
earth on E．grandis×E．urophylla seedlings(稀 土对
巨尾桉苗木生长的影响及生理效应) [J]．Journal of
Central South Forestry University (中南林学院学报)，
21：61～ 64．
Lti Q (吕 庆)，Zheng RL (郑荣梁)．1996．Membrane lip—
id peroxidation and deesterification of wheat induced by
drought and active oxygen(干旱及活性氧引起小麦膜脂
过氧化与脱酯化)[J]．Sin Chin(Ser C)(中国科学．C
卷)，26 (1)：26～3O．
Mccord JM，Fridovich J．1969．Superoxide dismutase：an
enzymic function for erythrocuprein(Hemocaprein)[J]．
Biol Chem ，224：6 049—6 055．
Schickler H，Caspi H．1999．Response of antioxidative an—
zymes to nickel and cadmium stress in hyperaccumulator
plants of the genus Alyssum [J]．Physiol Plant，105：
39— 44．
Shen WB(沈文飚)，Xu LL(徐朗莱)．1996．Study on de—
termination of ASP activity(抗坏血酸过氧化物酶活性测
定的探讨)[J]．Plant Physiol Commun(植物生理学通
讯)，32 (3)：203—205．
Tian CE (田长恩)，Liang CY (梁承邺)．1999．Effect of
polyamine on the metabolism of protein，DNA，RNA and
activated oxygen in the panicles of CMS rice and its main—
tainer line(多胺对水稻 CMS系及其保持系幼穗蛋白质、
核酸和活性氧代谢的影响)[J]．Acta Phytophysiol Sin
(植物生理学报)，25 (3)：222—228．
Wang AG (王爱国)．Luo GH (罗广华)．1990．Quantita-
tive relation between the reaction of hydroxylamine and
supexoxide anion radicals in plants(植物的超氧物 自由
基与羟胺反应的定量关系)[J]．Plant Physiol Commun
(植物生理学通讯)，26 (6)：55—57．
Wang LX (王丽雪)，Li RF(李荣 富)，Zhang FR (张福
仁 )．1996．Changs of total protein and peroxidase activity
in grape shoots，and their relationships to cold resistance
(葡萄枝条中蛋白质、过氧化物酶活性变化与抗寒性的
关系)口]．Inner Mongolia Institute Agric Animfl Hus-
bandry(内蒙古农牧学院学报)，17(1)：45—5O．
Zeng SX (曾韶西)，Wang YR (王 以柔)．1987．The effect
of chiling stress on the content of ascorbic acid in rice
seedlings(低温协迫对水稻幼苗抗坏血酸含量的影响)
[J]．Acta Phytophysiol Sin (植物生理学报)，13(4)：
365— 37O．
Zeng SX (曾韶西)，Wang YR (王以柔)，Liu HX (刘鸿
先)．1 9 9 1．Some enzymatic reactions related to chloro—
phyll degradation in cucumber cotyledons under chiling in
the light(低温光照下与黄瓜子叶叶绿索降低有关的酶
促反应)[J]．Acta Phytophysiol Sin(植物生理学报)，
17 (2)：177—182．
维普资讯 http://www.cqvip.com