全 文 ：广 西 植 物 Guihaia 27(1)：121— 126 2007年 1月
农杆菌介导 GUS基因对多年生黑麦草转化的研究
张振霞1，2，刘 萍1，杜雪玲3，苏 乔4，杨中艺l*
(1．中山大学 生命科学学院，广州 510275；2．韩山师范学院 生物系，广东 潮州 521041；3．安徽淮北煤炭
师范学院 生物系，安徽 淮北 235000；4．大连理工大学 环境与生命学院 ，辽宁 大连 116024)
摘 要 ：通过检测愈伤组织中GUS基因的瞬间表达，研究农杆菌 LBA4404／pCAMBIA1301介导多年生黑麦草
的转化体系。通过对多年生黑麦草瞬间表达率的比较，确立了其遗传转化的最佳优化条件。研究发现，多年生
黑麦草不同品种的转化率在 25 ～45 之间变化。多年生黑麦草遗传转化最佳优化条件是预培养 10 d的胚性
愈伤组织、浓度为 0．5～0．8 OD的农杆菌菌液以及 2 d共培养时间。在共培养基中添加 100 t~mol／L乙酰丁香酮
能有效地提高植物瞬间表达率。两种侵染处理方法比较结果为滤纸滴加法比浸泡法更优。转化后对愈伤组织
的干燥处理能抑制农杆菌过度繁殖，能改善愈伤状态，有利于提高转化率。
关键词 ：多年生黑麦草；农杆菌转化；GUS基因
中图分类号 ：Q943 文献标识码 ：A 文章编号：1000—3142(2007)01—0121_06
Study 0n Agrobacterium—mediated GUS
transformation for Lolium perenne L．
ZHANG Zhen-Xia ， LIU Ping ，DU Xue-Linga，
SU Qiao4．YANG Zhong-Yi1
(1．College of Life Sciences，Sun Yat-sen University，Guangzhou 510275，China；2．Department of Biology，Hanshan Normal
College。Chaozhou 521041，CNm ；3．Department of Biology，Huaibei Coal Industry Normal Co lege，Huaibei 235000，
Chim ：4．School of Environmental and Biological Sciences，Dalian University of Technology，Dalian 116024，China)
Abstract：Agrobacterium tumefaci~s mediated transformation system of Lolium perenne was studied by using GUS
gene transient expression method．M ature seed derived calus from L．perenne was transformed by GUS gene contai—
ning A．tumefaciens LBA4404／pCAMBIA1301．Frequency of the transformation was detected，and the optimal condi—
tions for L．perenne genetic transformation were determined．It was found that the transformation frequency varied
from 25 ～45 ac~rding tO different genotypes(variety)．The optimal conditions to get higher transformation ef—
ficieney were 2 days co-cultivation with 0．5～0．8 OD A．tumefaciens solution in dark after 10 days pre-culturing．
The transform ation frequency was significantly improved by adding 100 t~mol／L acetosyingone into co-cultivation me—
dium．Adding A．tumefaciens solution on surface of filter paper was found to be a better infecting method of A．tume—
faciens rather than suspending in A．tumefaciens solution．The partial desiccation treatment after transformation was
beneficial to prevent over-growth of A．tumefaciens and increase the transformation eficiency．
Key words：Lolium perenne；Agrobacterium-mediated transformation；GUS gene
多年生黑麦草作为草坪草种，在国外已经有许多
通过常规育种方法育成的品种，在生态环境改善、水
土保持、城市绿化、运动场建设等方面发挥了重要的
作用。但是，由于我国草坪草育种工作起步很晚，至
收稿 日期；2005—04—11 修回日期 ：2005—10-13
基金项目：国家转基因植物研究与产业化专项 (J2002一B-O06)[Supported by the National Special Program for Research and lndustfiali-
zation of Transgenlc Plants(J2002-B-006)]
作者简介：张振霞(1975一)，女，甘肃兰州人 ，博士，主要从事生物技术及草业科学方面的研究，(E-mail)zhangzhenxia@yahoo．com．cn。
’通讯作者(Author for c0rresp0ndence，E-mail：adsyzy@ZSU．edu．on)
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今尚无真正的草坪草育成品种，因此，与发达国家相
比，我国的草坪草育种工作极其落后 ，有必要通过非
常规手段加快新品种的培育工作。其中，通过转基因
技术导入优良性状是培育新品种的较快速的途径 ，尤
其是对于多年生的草坪草种而言，这一育种方法有着
传统育种方法不可比拟的优势(闫新甫，2003)。在草
坪草的转基 因技术方面 ，国内外 已经开展了一些研
究，也取得了一些成果，但在所查的文献中尚未见应
用该技术手段育成的品种。其中，在多年生黑麦草的
转基因技术研究方面已有人开展了一些工作，大多数
采用基因枪转化方法(Dalton等 ，1999)，在农杆菌遗
传转化方面的研究很少(Devereaux等，2002)。为此，
有必要在多年生黑麦草农杆菌遗传转化体系方面开
展更多的研究，为建立稳定而有效的多年生黑麦草转
基因育种技术体系奠定基础；同时本研究还使用了多
个品种开展试验，以探讨农杆菌介导 GUS基因对多
年生黑麦草转化的方法及基因型对转化效率的影响。
1 材料和方法
1．1材料
1．1．1植物材料 供试的多年生黑麦草(Lolium pe—
te~Tle L．)品种旋风(CV,Pirouette)、百宝(cv．Barbal1)
及和平(cv．Peace)种子由美国百绿有限公司北京代表
处和北京克劳沃草业技术开发中心提供。其中品种
旋风和百宝是草坪型，品种和平是牧草型。
1．1．2农杆茵茵株及质粒 根癌农杆菌(Agrobacteri—
Um tumefaciens)菌株 LBA4404／pCAMBIA1301由大
连理工大学安利佳教授提供。载体 pCAMBIA1301
的T-DNA区含有潮霉素抗性(HyG)基因和 葡萄
糖苷酸酶(GUS)基因，在 GUS基因编码 区内有一 内
含子，因此GUS基因只能在植物中表达而不能在细
Xho I BsxI BstelINheI
图 1 pCAMBIA 1301质粒图谱
Fig．1 The plasmid map of pCAMBIA 1301
菌中表达(图 1)。
1．1．3供试培养基 植物培养基：MS基本培养基+5
mg／L 2，4-D+0．05mg／L BAP+2 mg／L ABA+30 g／
L蔗糖+3～4 g／L Phytegal，pH5．8；农杆 菌培养基 ：
胰蛋白胨5 g／L，牛肉浸膏 5 g／L，酵母提取物 1 g／L，
MgSO~一7H2O 0．493 g／L，蔗糖 5 L，pH值 7．0。
2 实验方法
2．1农杆菌培养和植物转化
挑取-70℃保存的农杆菌转化子在 YEB培养基
上划线，28℃下暗培养；挑取单菌落于YEB液体培养
基中，28℃下 200 rmp摇床振荡培养。在波长 600
nm下用分光光度计测定农杆菌菌液紫外吸收值 OD
达到 0．8时，重悬培养。当菌液 OD值达到 0．5～O．6
时，用于转化。将转化材料浸没于菌液中，28℃下
100 rmp振荡20 min，再静置 10 min。再将转化材料
在无菌滤纸上吹干，转移到共培养基上，在 25℃下共
培养后，进行 GUS组织化学染色以检测 GUS基因瞬
间表达，并计算瞬间表达率。其计算方法是：GUS阳
性发生率( )一目测到的 GUS斑数／检测的外植体
数×100。
2．2 GUS活性的组织化学染色分析
经与农杆菌共培养后的愈伤组织中GUS基因的
瞬间表达按Jeferson的组织化学染色法进行(Jefer—
son，1987)。
染色方法：取待检测的植物组织于 1．5 mL离心
管中，加入 GUS缓冲液 1 mL以浸没组织块，再加入
5 (v／V)用量的 GUS染色液，混匀后 37℃下保温
16~24 h，用 7O 乙醇固定后取出组织置解剖镜下观
察染色结果。
2．3实验处理
不同共培养时间对黑麦草转化率的影响实验设
置了 1、2、3、4 d四个处理 ；在转化过程中，通过添加和
不添加 乙酰丁香酮 (AS，100~mol／L)处理 ，测定 AS
对黑麦草愈伤转化率的影响；比较了转化后干燥处理
与没有干燥处理的愈伤转化率，干燥处理是将农杆菌
转化后的愈伤放在铺有一层无菌滤纸的培养皿中，1
d后再移至培养基；比较了两种侵染方式的转化率：
一 种是菌液直接浸染愈伤，另一种是培养基上铺一层
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无菌滤纸，愈伤转至滤纸上，然后将菌液滴加到愈伤；
将转化受体转置高渗培养基(继代培养基+30 mg／L
甘露醇)，进行 10 d的预培养后进行农杆菌转化，观
察预培养时间对转化效率的影响。在农杆菌菌液浓
度对转化 效率 的影 响实 验 中，设 置 了 四个 农杆 菌
O130．5、O130．8、OD1．0和 ODl_5浓度 ；研究两种不同
侵染处理方法(浸泡法和滤纸滴加法)对多年生黑麦
草转化率的影响；共培养时不同光照条件对黑麦草转
化频率的影响，采用 了全黑暗和 12 h光照／12 h黑暗
两种培养条件。以上实验处理都是经过共培养 2 d
后，进行 GUS组织化学染色分析。每个实验重复 3
次，数据采用 8．0软件作差异显著性检测。
表 1 共培养时间对不同黑麦草愈伤组织
转化瞬间表达率的影响
Table 1 Effect of the days for co-culture with
A．tumefaciens on GUS transient expression
in calus of L．perenne
”根据 LSD检验结果，同品种内不同小写字母表示共培养时间处理
间差异显著(P
between the Co-culture time treatments being significant at P< 0．05 levd
according tO ANOvA and LSD test．Different eapital letters among dif—
ferem varieties indicate significant diference between varieties under the
2d Co-euhure treatment，at P< D_O1 level according to ANOVA and
I—sD test．The鼯me as follows．
3 结果与分析
3．1共培养时间对多年生黑麦草瞬间表达率的影响
多年生黑麦草与农杆 菌分别共培养 1、2、3、4 d
后的瞬间转化频率见表 1。转化受体与农杆菌共培
养 1 d后的表达率较低；共培养 2 d后表达率明显提
高；经 3 d共培养后，瞬间表达率出现轻微的降低；继
续延长共培养时间，即受体材料与农杆菌共培养 4 d
或4 d以上，由于细菌生长过度抑制了植物细胞的
生长，使得转化受体的瞬间表达率出现下降。以最
高值计，多年生黑麦草的和平、百宝和旋风品种的
GUS基因转化率依次为 45．45 、25 和 36．96 ，
均出现在共培养 2 d的处理；差异显著性分析结果
表明，在大多数情况下，共培养 2d的处理所得结果
显著高于其它处理，且品种和平的转化率极显著高
于其他品种 。
3．2 AS对多年生黑麦草转化率的影响
在转化农杆菌菌液和共培养过程中添加 100
tmol／L乙酰丁香酮(AS)对多年生黑麦草愈伤转化
率的影响如表 2所示。添加 AS大大提高了多年生
黑麦草各品种转化受体的转化频率，GUS在旋风的
瞬间表达率显著增加了 61．3 ；在和平则显著增加
了 40．3 ；在百宝只增加了 18．8 ，差异不显著。
表 2 乙酰丁香酮(AS)对 GUS基因瞬间表达率的影响
Table 2 Effect of acetosyringone(AS)on efficiency of
GUS transient expression in calus of L．perenne
3．3不同侵染处理方法对多年生黑麦草转化率的影响
不同侵染处理方法对转化效率的影响如表 3所
示。和平和百宝两个品种在采用铺滤纸滴加法的情
况下，其 GUS瞬间表达率均高于采用浸泡法的结果，
和平和百宝 GUS阳性瞬间表达率分别显著增加了
37．88 和 2O．25 。
3．4干燥处理对多年生黑麦草转化率的影响
经干燥处理和未干燥处理的黑麦草转化受体的
GUS瞬间表达率如表 4所示 。两种处理后 GUS瞬
间表达率的差异很明显，旋风品种的 GUS瞬间表达
率从未干燥的 27．08 提高到经吹干的 36．96 ，增
加了36．48 ；和平则从 28．95 提高到 45．45 ，增
加了57．17 。经过吹干处理的转化受体经过2～4 d
共培养后没有观察到农杆菌的生长，而没有经过干燥
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表 4 预培养、干燥处理对黑麦草转化 GUS基因瞬间表达率的影响
Table 4 Effect of preculture and dryness on efficiency of transient expression of GUS in calus of L．perenne
转化愈伤数 No．of transformation calus
瞬间表达愈伤数 No．of transient expression calus
瞬间转化率 Transient expression rate(％)
增加率 Increment( )
48 46 46 39 38 33 33 34
13 17 17 8 11 15 12 6
27．08 b 36．96 a 36．96 a 20．51 b 28．95 b 45．45 a 36．36 a 17．65 b
36．48 78．45 57．17 106．00
表 5 农杆菌菌液浓度和光照培养条件对黑麦草(和平)转化GUS基因瞬间表达率的影响
Table 5 Effect of concentration of A．tumefaciens solution and light period on
efficiency of GUS transient expression in callus of L．perenne var．peace
项目Items
农杆菌菌液浓度(OD值)OD Concentration 共培养光条件 Light condition
0．5 0．8 1．0 1_5 黑暗 Dark 光照 Light
的愈伤在 2 d共培养后便长出了农杆菌。
3．5预培养对多年生黑麦草转化率的影响
农杆菌浸染前对经过长时间培养的愈伤组织进
行 10 d预培养，可以明显地改善愈伤的转化状态，提
高转化率(表 4)。预培养后多年生黑麦草旋风和和
平的GUS瞬间表达率要比没有经过预培养的增加
78．45 和 106 。
3．6农杆菌菌液浓度对多年生黑麦草愈伤转化率的
影响
用不同浓度(0130．5、ODO．8、OD1．0和 oD1．5)
的农杆菌转化品种和平的 GUS瞬间表达率如表 5所
示。农杆菌菌液浓度在 OI30．5和OD0．8时 GUS瞬
间转化率最高，且差异不显著，都在 4O 左右；OD1．0
时的瞬间转化率有所下降，为 31．71 ，而 oD1．5时
GUS瞬间表达率明显降低到 12．45 ，均显著低于
oD0．5～O．8处理。因此，农杆菌菌液浓度应以不超
过 OD0．8为宜。
3．7共培养时不同光照条件对黑麦草转化频率的影响
全黑暗条件和 12 h光照／12 h黑暗培养条件下
共培养和平转化体后的检测结果见表 5。全黑暗培
养下愈伤组织的转化频率显著高于 12 h光照／12 h
黑暗培养条件下的，显示在黑暗条件下农杆菌对植
物受体的浸染更容易些。
4 讨论
4．1基因型对转化效率的影响
影响农杆菌转化禾本科植物的因素有很多，包
括转化材料的基因型(品种)、外植体种类、农杆菌菌
株和质粒载体、培养基组分、共培养时间、浸染方式、
菌液浓度、转化前预培养等等，凡是影响农杆菌 Vir
基因活化和愈伤组织生长和再生的因素都可能影响
到多年生黑麦草的成功转化(黄霞等，2002)。
翟文学等(2000)认为，转化效率的差异反应了
受体品种遗传背景的不同，例如在水稻各品种间，籼
稻的转化效率明显低于梗稻。但以往在这一方面的
研究是 比较欠缺的。品种的差异性与细胞的生理状
态有关，具体说来与细胞受体的生理反应(如小分子
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1期 张振霞等：农杆菌介导 GUS基因对多年生黑麦草转化的研究 125
信号物质的分泌)、细胞内源激素水平(影响细胞的
生长、分化)、细胞壁的结构(影响细菌吸附)等有关
(Rashid等 ，1996)。本研究 中不同多年生黑麦草 品
种对农杆菌转化的响应在效率上有明显的差异，在
相同条件下获得的不同品种的转化率范围为 25
～ 45 ，表明多年生黑麦草遗传转化所用材料的选
择对于提高转化效率是很有意义的。所以在进行转
化时有必要对受体材料进行考虑和选择。与此同
时，不同品种所适用的愈伤组织培养基成分也应有
所不同，因此，应该通过筛选研究作出适当的调整。
4．2 AS对多年生黑麦草转化效率的影响
绝大多数单子叶植物不是农杆菌的天然寄主，
主要原因是由于其不能积累足够的酚类物质，从而
难以激活农杆菌的侵染能力 ，因此通过添加酚类诱
导物可以促进农杆菌的转化效率(Vain等，1993；
Hiei等，1994)，其中 AS已被证明是诱导效果最好
的酚类化合物(Moore等，1992)。尽管这种诱导作
用并不是农杆菌介导转化所必需的，但可提高转化
效率(王力等，1999)。例如，在水稻转化中添加 100
t~mol／L的 AS可大 大提 高转化 效率 (Hiei等，
1994)。然而也有研究结果表明 ，对于某些植物 ，如
草莓、芹菜等的转化，AS的使用则是无效甚至有害
的(James等，1990)。在本研究不添加 AS的情况
下 ，多年生黑 麦草 的 GUS瞬间转 化率 只有 2O～
3O ，说明多年生黑麦草对农杆菌转化体系的敏感
性不是很强。在农杆菌浸染液和共培养基中加入了
100／lmol／L AS后 ，多年生黑麦草的 GUS瞬间转化
率最高提高了61 9／6，证明了多年生黑麦草可以通过
AS提高农杆菌的侵染能力。
4．3共培养时间对多年生黑麦草农杆菌转化体系转
化效率的影响
农杆菌和外植体的共培养在整个转化过程中是
非常重要的环节，T-DNA的转移及整合都在共培
养时间内完成。很多实验表明农杆菌细胞的生长状
态和菌液的浓度是转化成功的关键因素(Hiei等，
1997)，当浓度过低时，不利于基因的转入，但如果菌
液浓度过高，菌体本身易相互聚结，从而影响其在外
植体上的附着，同时还可能引起以下问题：一是共培
养后农杆菌不能被有效抑制；二是筛选培养基中加
入的抑制农杆菌的抗生素的量要大大增加，不仅提
高了实验成本，而且控菌效果也不会太好。共培养时
间对转化率有很大影响，不同物种、外植体种类，最佳
共培养时间是有差异的(农友业等，2005)。在多年生
黑麦草愈伤组织与农杆菌的共培养中，2 d培养时间
和相对较低的菌液浓度看来是比较有利的。
4．4影响多年生黑麦草农杆菌转化体系的转化效率
的其他因素
本研究结果还表明，预培养、培养温度、光周期
等也影响多年生黑麦草的农杆菌转化效率，这与以
往许多研究结果是相吻合的。例如，对于预培养和
高渗培养，黄益洪等(2003)认为预培养 1O～15 d的
水稻幼胚愈伤组织具有较高的瞬间表达率和再生能
力。另外，添加 30mg／L甘露醇的高渗处理还可以
使细胞失水形成内高外低的渗透压梯度，有利于植
物细胞在极短时间内吸收其周围的农杆菌，对转化
有利(黄霞等，2002)。
在干燥处理方面，周玲艳等(2003)在农杆菌转
化水稻的研究中，对干燥处理和非干燥处理后的抗
性愈伤组织获得率进行了对比。经干燥处理后，抗
性愈伤组织转化平均获得率为 4．13 ，而不经干燥
处理，抗性愈伤组织获得率仅为 0．18 oA，结果表明
干燥处理不仅可以有效杀死农杆菌，而且可以改善
愈伤组织状态，提高转化率(田文忠等，1994)。可
见，影响多年生黑麦草农杆菌转化效率的许多因素
具有与农杆菌转化水稻时相似的作用效应。
不同侵染处理方法对黑麦草转化率的影响中，
铺滤纸滴加法获得的 GUS瞬时表达率明显要高于
采用浸泡法，可能是浸泡法转化植物受体时要经过
摇床振荡、清洗、干燥等过程，这会对受体细胞造成
一 定的损伤，而铺滤纸滴加法则不需要这些过程，避
免了这些操作对转化受体的伤害。
5 结论
本研究 中，用农杆 菌 LBA4404／pCAMBIA1301
转化多年生黑麦草的和平、百宝和旋风品种，检测
GUS的瞬间表达 ，以优化多年生黑麦草的农杆菌转
化体系。获得的主要结论如下：以 2 d作为最佳共
培养时间，滤纸滴加法比浸泡法更优，黑暗条件下的
转化率要比经过 12 h光照／12 h黑暗培养条件下的
高；农杆菌菌液的013600以0．5之间为宜；转化后对
愈伤的干燥处理有利于改善愈伤状态，提高转化率，
降低农杆菌污染程度；预培养 10 d左右的胚性愈伤
组织是较好的转化受体；100／lmol／L乙酰丁香酮的
施加有利于提高植物的瞬间表达率。优化条件下获
得的多年生黑麦草和平、百宝和旋风品种最高 GUS
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126 广 西 植 物 27卷
瞬间转化表达率依次为45．45 、25 和36．96 。
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