全 文 ：广 西 植 物 Guihaia 22(3)：259— 263 2002年 5月
农杆菌及基因枪在玉米遗传转化中的应用
韩双艳，郭 勇
(华南理工大学生物工程系，广东广州 510640)
摘 要 ：目前外源基因导人玉米受体细胞的方法很多 ．最受瞩 目的是农杆菌介导法和基因枪法 。就农杆菌、
基因枪转化玉米的基本原理、影响转化率的因素 ．以及近年来在玉米遗传转化 中的最新动态进行 了综述。
关键词 ：玉米 ；遗传转化 ；农杆菌；基因枪
中图分类号 ：Q943 文献标识码 ：A 文章编号 ：1000—3142(2OO2)03—0259—05
Appl ication of genetic transformation in maize
by Agrobact erium and gene gun
HAN Shuang—yan。GUO Yong
(Depa7 ￡Ⅲ 7 0／B 72g 7￡ r卉￡g，South China Unive7 sit5。／Technology．Guangzhou 510640，China)
Abstract：Agrobacterium and gene gun h孙 e aroused most attention among various genetic transformation meth
ods for exogenous gene into maize．Here．the basic principle of Agrobacterium and gene gun，the factors that af
fect the efficiency of transformation and the latest development in maize genetic transformation are reviewed．
Key words：maize；genetic transformation；Agrobacterium；gene gun
玉米是一种重要 的粮食兼饲料作物 ，也是现代
食品工业和化学工业的重要原料 ，具有多种遗传特
性。其遗传转化的研究一 直受到人们 的普遍关注 。
到 目前为止 ，已建立了多种外 源基因导人玉米受体
细胞的遗传转化方法 。其中 ，农杆菌和基 因枪在玉
米遗传转化中担任着重要角色。农杆菌介导的遗传
转化可转移相对较大的 DNA 片段 ，获得较多 的单
拷贝转基 因植株 ，转化效率高，目前已成 为研究 的
热点 ；而基因枪法因其无宿主限制、受体类型广泛、
操作简便快捷，近年来在玉米遗传转化中得到最广
泛的应用。本文就农杆菌及基因枪转化玉米的研究
进展做以综述，以期对玉米的遗传转化研究提供参
考 。
1 农杆菌介导的遗传 转化
1．1农杆菌介导的遗传转化发展
1987年 Grimsley等通过农杆 菌将 玉米条纹病
毒导人 玉米 幼苗 ，第 一 次证 实农 杆菌 能够浸 染玉
米⋯。1991年 Gould等用 gus报告基因和 NptⅡ基
因通过农杆菌介导法转化玉米 Funk’S G90的芽尖 ，
得到的再生植株及其子 一代基 因组中带有标记基
因，从而为玉米建立高效的遗传转化体系奠定了基
础 。 。1996年，Ishida等建立了一套农杆菌介导的高
效转化体系。通过对菌株、菌液浓度、幼胚基因等各
种因素的优化 ，使玉米的转化效率 达到了 30 ，证
明了外 源基 因地整合、表 达及稳定 遗传，成 为玉米
收稿 日期：2001—03—1 9
作者简介：韩双艳(1 976一)，女 ，河南郑州人 ，华南理工大学食品与生物工程学院在读博士生，发酵工程专业 。
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遗传转化过程 中的一个里程碑 。随后 ，I．upoto等
和 国内的黄璐 等也相继成功地 实现 了农杆 菌介导
的玉米遗传转化。 。
1．2遗传转化原理
目前在玉米遗传 转化 中应 用 的主要是根癌农
杆 菌，其介导的转化过程 主要包括 ：(1)细菌在植 物
敏感细胞 上吸附 ；(2)农 杆菌 中的 Ti质粒 上的 Vir
区基 因被激活 ；(3)T—DNA切割和 T DNA复合 物
形成 ；(4)T—DNA 复合 物 由农杆 菌进 入植 物细胞；
(5)T—DNA 以单 或多拷 贝随机整 合到植 物染色体
上并且进行表达 。
Ti质粒(Tumor inducing)是约 200 kb的环状质
粒 ，包括毒性 区(vir区)、接合转移区(Con区)、复制
起始区(Ori区)和 T—DNA 区 4个部分 。T—DNA 区
两个边界 为 24bp重复序列 ，是 T—DNA加工和整合
的重要标记。这两个重复序列之间的任何基 因都可
被 T—DNA转 入植物基 因组 中。其 中 Vir区与 T—
DNA 区在转化中尤为重要。Vir区含有 VirA～J等
至少 10个操纵子 ，决定 了 T—DNA的加工和转移过
程。、。VirA是一种细胞膜内蛋 白，可作 为受体蛋白
接受损伤植物细胞分泌物的诱 导，自身磷酸化后进
一 步磷酸化激活 VirG蛋 白；后者是一种 DNA转录
活化 因子 ，被激活后可 以特异性结合 到其它 Vir基
因启动子区上游的 Vir box，启动这些基 因的转 录。
因此农杆菌侵染玉米的能力主要是 由 VirA位点决
定的。其 中，VirD基因产物对 T—DNA进行剪切，产
生 T—DNA 单链 ，然后 类 似于 细菌 结合 转 移将 T—
DNA与 VirD2组成的复合物转入细胞 。在那里与
许 多 VirE2蛋 白分子 (为 DNA单链结合蛋 白)相结
合，形成 T链复合物(T—complex)。 。Hansen等证
明在 VirE2蛋白存在时，能使玉米转化效率提高 2
倍“”。
1．3影响农杆菌转化玉米效率的因素
1．3．1细菌菌株和载体质粒的构建 在大批已分离
的农杆菌株 中，A281是具有超毒 Ti质粒 ，宿主范
围广、转化率高的一个菌株。 目前玉米转化 中常用
的 菌 株 I BA4404，常 用 的 载 体 是 PSB131和
PTOK233，均 为 超 双 元 载 体；都 含 有 A281中
VirB、VirC、VirG基 因，对转化玉米非常有效。但是
Hiei等人的实验表明，菌株和质粒 的组合在 转化 中
至关重要 ，否则“超强组合 ”(超强菌株 和超 双元 载
体组合 )的转化效率 比普通农杆菌与双元质粒组合
的效率还要低“ 。另外 ，用遗传改造或分离突变体，
使 其能不依赖 于创 伤诱导 物的存在就能诱 导被调
控的 Vir基因高水平或组成型表达，从而促进 T—
DNA转移也是实现有效转化 的新途径。在胭脂碱型
菌株 中引入 VirGN 4D突变能将农杆菌对玉米的感
染率(瞬间表达)从 36 ～40 提高到 78 ～83％，
而在章鱼碱型菌株 中则从 0 ～1 5％提高到 70％～
77％。 。
1．3．2受体基 因型 基 因型是影响农杆菌转化效率
的一个重要因素。Ishida等发现不 同基因型之间转
化效率差异显著 ，最 低可至 0，最高可达 3O 、；黄
璐 等的研究中 ，感染能力很强的农杆菌 EHA101能
侵染不 同品种的玉米愈 伤组织 ，其 中对苏玉 1号的
转化效率可达 8．1％ 。基因型与农杆菌 的相互作
用也影响 了转化效率。一定浓度 (1．0×10。cfu／mI )
的农杆 菌 I BA4404菌 液对玉米 八188、B73的浸染
效果较好 ，转化效率也较高 。
1．3．3受体及发 育状态 不 同来源 的受体 ，其对农
杆菌 的敏 感性 也 不 同。Crimsley等将 Ti质 粒 T—
DNA上 携带有玉米条 纹病毒 DNA 的农 杆菌注入
玉米分生组织或是靠近生长点的部位，得到大量具
有条斑病毒性 状的植株 ，而注 入非分生组织 处，感
染很少出现“。Graves等人也证 明玉米盾片结节和
中胚轴最 易被农杆菌感染 。同时 ，不同发育状态的
受体也会影响转化率“ 。Ishida等发现授粉后 9～14
d，长度在 1．0～2．0 toni_的幼胚 ，最容易被农杆菌感
染。 。结果表明 T—DNA转移依赖受体发育，农杆菌
识别细胞 的关键 受体成分 可能在幼胚 的发 育 中逐
渐获得。
1．3．4其它因素 实现农杆菌对玉米成功转化的因
素还有很多 ，如农杆菌侵染方式、共培养的时间、培
养基成分、培养温度及 pH值等。
2 基因枪法
2．1基因枪法发展
最早是 由美 国康 奈尔大 学 的 Sanford等 (1987
年 )研制 出火药 引爆 的基 因枪，并 与该校 工程技术
专家 Wolf及 Klein合作研究基因转移的新方法“ 。
基 因枪法 ，又称微 粒枪 法 、微 粒轰 击法 (gene gun，
particle gun，particle bombardment)，是依赖 高速 度
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3期 韩双艳等 ：农杆菌及基因枪在玉米遗传转化中的应用 261
的金属微粒将外源基 因引入活细胞 的一种转化技
术 。1990年 ，Gordon Kamm 等用基因枪法将 gus报
道基 因和 pat选择性基 因导人 玉米悬 浮细胞 系 ，且
再生的转基 因玉米植株能够结实“ 。首次获得转基
因玉米后 ，1 993年 Koziel等培育出了抗虫的转基因
玉米。转基因植株能高水平表达 CrylA(b)在温室和
大 田栽培 中表现出很强的抗玉米螟 的能力 ，且在后
代 中稳 定 遗传“”。1994年 ，Rasmussen等 用 质 粒
PBC一17或 PBAR—gus转化 的完整大肠杆菌 DH5a—F
和用质粒 PNY转化的根瘤农杆菌 A208，作 为微弹
转化玉米细胞 ，用 飞盘型氦动力基 因枪轰击 ，每次
得到数个瞬间转化体，6个稳定转化体 。1999年，
张秀君等构建了两个含高赖氨酸蛋白质基因cDNA
的表达载体，用基因枪法将其导入玉米不同杂交组
合 的胚性愈伤组织 。通过潮霉素筛选 ，经 Southern
杂交检测，得到了含该基因的转基 因植株“”。2000
年，刘大文等将 Zml3一Barnase基因转化玉米经高渗
处理的 Q31×Z3、Z31×Q31的胚性 愈伤组 织，经 6
轮的除草剂筛选获得32块抗性愈伤组织，再生得到
24个植株 。Southernblot分析证明，其 中 j个植株 中
整合有 Barnase基因 。
2．2基因枪转化原理及分类
基 因枪法利用 高速运动 的金属离子 ，可非特异
地将外源基因导入致密 的可再生的植物细胞 、组 织
和器官，不再受受体基因型的限制，同时又避开了
原生质体再生的障碍，从而使玉米的遗传转化掀开
了新的一页。其原理是利用火药爆炸 、高压放 电或
高压气体为驱动力，加速金属离子(微弹)使其进入
带壁细胞 。在此过程中 ，质粒 DNA首先沉淀在微弹
(钨粉、金粉)表面(通常以氯化钙、亚精胺作为沉淀
剂来促进 DNA与微弹结合 )，结合着 DNA的微弹
经加速而获得足够的能量 ，进而穿透植物细胞壁进
入靶细胞，随后释放出DNA分子，其中一部分随机
整合到植物染色体中，就可得到稳定 的转化体 。根
据基因枪不同的动力系统，可将它们分为 3类 ：
(1)火药式基因枪；(2)放 电式基 因枪 ；(3)气动式基
因枪 。
2．3影响基 因枪转化玉米效率的因素
2．3．1不 同受体材料对 玉米再生的影响 。圳 目前
基 因枪技术 已能实现对许多 玉米 受体细胞进 行遗
传转化，包括外植体、胚性愈伤组织、胚性愈伤组织
建立 的悬 浮细胞 系及胚性 愈伤组织或悬浮细胞 系
分离出的原生质体。
外植体(包括幼穗、幼胚、成熟胚)的来源和生
理状态对植株再生有较大的影响。玉米幼穗和幼胚
的再生能力明显高于其 它部位，而且它们的发育 阶
段也是 影 响再 生 的重 要 因素。对 玉米 幼胚 而 言，
Todorova等认为 ，授粉后 10～15 d，幼胚长度为 1．0
～ 2．0 mm 时 ，再 生 能 力最 强 ，是 理 想 的 受 体 材
料 。但国内柯遐义等有报道指出 16～20 d胚龄的
幼胚 再生能力较高 ，14 d及 22、24 d胚龄的幼胚 再
生能力较低，其 中以 18 d胚龄之幼胚具最高的再生
能力。!”。这可能与不同培养条件或基因型有关 。
Ⅱ型愈伤组织 即胚性愈伤组织 ”再 生性 好。
1995年王 国英 等用基 因枪将 Bt基 因转入 Ⅱ型愈伤
组织 中，获得大量转基 因植株： 。尽管玉米 Ⅱ型愈
伤组织的诱导受基 因型的影响，由于其愈伤组织较
易获得 ，再生能力强 ，获得转化 植株 的周期 相对较
短 ，仍是 目前应用最广泛 的受体材料 。此外 ，悬浮细
胞系 由均一 的小细胞 团组成 ，易 于大量获得 ，便 于
进行转化体的获得，常用于基因枪的转化。
2．3．2基 因型对玉米体 细胞再生能力的影响 不同
品种的玉米幼胚诱导的愈伤组织的再生能力差异
显著 。许多实验均表 明在相同的培养条件下观察到
A188的再生能力 明显高于其 它品系 ，一起 作为亲
本 的杂交后 代也表 现 出较高 的 再生频率 _” 。
Todorova等对 不 同基 因型 的玉米 幼胚 (0．5～3．0
ram)进行 培养 ，结果发 现 A619表现 出 良好 的再生
能力，而 A344的幼胚不能再生出完整的植株 。黄
璐等也观察到普甜 1号和苏玉 1号 的再生频率高达
78 和 7 ，糯 玉米和掖单 9号 仅为 1O 和 8 。
植株再生途径也有所不 同，普甜 1号 以器官发生为
主要途径，苏玉 1号则以体胚发生途径为主 、。与此
相一致 的是 ，张秀君等用基 因枪将高赖氨酸基 因导
入玉米时，也发现在相同的轰击条件下，相同的筛
选条件下，不同的基因型分化再生能力不同 。这
可能与不同基 因型间的遗传差异有关 。
2．3．3培养条件对玉米细胞再生能力的影响 玉米
的愈伤组织的诱导和体细胞的再生能力也受到各
种培养条件的影响。同其它单子叶植物一样 ，2，4一D
(2～4 mg／I )诱导外植体脱分化产生愈伤组织。细
胞 分裂素对玉米 愈伤组织 的诱导和植株再生 也起
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262 广 西 植 物 22卷
着重要的作用。黄璐等发现低浓度(O．2 mg／I )的细
胞分裂素类似物 (6BA或 KT)能促进玉米幼胚的诱
导和愈伤组织的再生 。其他激素的使用结果的报
告不尽相同。Hodges等还发现硝态氮比例高有利 于
诱 导愈伤组织 ，氨态氮 比例 高有利 于植株再生 ”；
Armstrong等证明培养基中添加高浓度的脯氨酸有
利 于维持玉米愈伤组织的胚性 ；柯遐义等研究发
现加 Ag 至 10 mg／I 可使胚性组织诱导率提高大
约 6倍 ”。
2．3．4其它因素 影响基 因枪转化玉米的因素还有
很多 ，如质粒 DNA的包被、渗透压的影响等 。
3 展 望
目前 ，利用农杆菌介导 和基 因枪转化玉米 已取
得 了可喜 的成绩 ：利用基 因枪 转化 技术 获 得的抗
虫 、抗除草剂的转基因玉米 已率先应用 于玉米的商
业化生产，农杆菌介导法建立 的高效转化体系越来
越多。然而 ，不管是农杆 菌介导法 ，还 是基因枪法 ，
都存在一些需要解决的问题 。如：拓展其宿主范围，
导入较大的 DNA 片段 ，保证外源基因定点 整合 ；提
高基 因枪法 的转化率 ，避 免过 多拷贝 ，增 强稳定表
达 等。那么，能否考虑将 这两种技 术结合 ，取长补
短?事实上，人们已经开始了尝试。1994年，Ras
mussen等用 1．0 的酚类物质处理后的农杆菌细胞
和大肠杆菌细胞结合在钨粉粒上 ，用基 因枪轰击悬
浮培养的玉米细胞，提高 了转化效 率 ” 。1996年 ，
Hansen创 建 了 农 杆 枪 法 (Agrolistic)，将 VirD1、
VirD2基因连同 T—DNA上的 目的基因一同用基 因
枪打入植物细胞 中，表达的 VirD1、VirD2能在植物
细胞 内切割保守序列 的 DNA 并将 T—DNA转入细
胞核，其频率在总的转化事件中约 占 20 。 。该方
法集中了农杆菌介导法中精确切割转移和低拷贝
等特性与基因枪转化范围无 限制性等优点 ，因而是
一 种值得重视的新思路 。
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