全 文 ：广 西 植 物 Guihaia 26(1)：85— 87 2006年 1月
一 种可用于分析水稻花药中钙调素蛋白
分布的胶体金免疫电镜标记技术
夏快飞1，2，徐信兰1，叶秀麟 ，梁承邺
(I．中国科学院 华南植物园，广东 广州 510650；2．中山大学 生命科学学院，广东 广州 510275)
摘 要 ：以水稻花药作为实验材料 ，在前人应用胶体金技术标记钙调素蛋 白(CaM)的基础上 ，采用 Epon812
常规包埋方法 ，并在标记过程及染色体系上做了一些改进 ，建立了一套标记特异性较强且超微结构保存较好
的花药中 CaM 的标记方法。
关键词 ：钙调素 ；胶体金免疫标记技术；水稻；花药
中图分类号：Q336 文献标识码：A 文章编号：1000—3142(2006)01—0085—03
A modified immunogold-labeling technique for the
localization of calmodulin protein in rice anthers
XIA Kuai—fei1，2，XU Xin-lan1，YE Xiu—lin ，LIANG Cheng—ye
(1．South China Botanical Garden，Chinese Academy of Sciences，Guangzhou 510650，China；
2．School of Life Sciences，Sun Yat—sen University，Guangzhou 510275，China)
Abstract：A modified immunogold—labeling technique based on Epon812 embedding specimen is used to localize
calmodulin to particular locations within rice anther．Both the labeling specific and the resolution of electron
micrograph improved a little．
Key words：calmodulin；immunogold labeling electron microscopy；rice(Oryza sativa L．)；anther
钙调素(Calmodulin，简称 CaM)是一种广泛存
在于真核生物中的钙依赖型多功能调节蛋白。植物
的细胞生长、分化及植物体对多种体外环境刺激所
产生的应激反应等都被证 明与 CaM、与钙离子结合
引 起 的 反 应 有 关 (Raymond，1998；Wayne等，
1998)。对 CaM 在细胞 内的分布及其功能的研究一
直是钙信号转导研究的热点 。由于 CaM 的分布具
有时空及组织表达的差异性 (Wayne等，l998)，因
此确定 CaM 在植物细胞内的分布对于阐明 CaM 的
功能具有重要意义。傅樱 等(1998)及赵洁等(1998)
采用免疫荧光方法已在烟草胚囊、小麦幼胚 等细胞
中做了 CaM 的定 位研究。杨军 等(2002)及李家旭
等(1989，1992)用胶体金免疫电镜标记技术对水稻
胚囊、玉米幼根中的 CaM 进行了定位研究，但是 尚
未见到用此技术在植物花药 中定位的研究报导。我
们在前人 研究 的基础 上 建立 了一种 较 为理 想 的
CaM 在花药中的胶体金免疫标记方法 。
1 实验材料与方法
1．1实验 材料 及试剂
珍汕 97水稻保持系 (珍汕 97B)花药作为实验
材料 ；抗 CaM 血 清购 自河北 师范 大学生物 系；10
nm 的金标羊抗兔 IgG购 自鼎国生物技术公司。
收稿日期：2004—1O一24 修回 日期：2005—04—1 5
基金项目：国家 自然科学基金(301 70061)；中科院院长基金(20003269)[Supported by the National Natural Science Foundation of
china(3O17OO61)；President Foundation of Chinese Academy of Sciences(20003269)]。
作者简介：夏快飞(1975一)，女，湖南常德人 ，博士研究生 ，主要从事植物遗传方向的研究
通讯作者(Author for c0rresp0ndence)
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广 西 植 物 26卷
1．2实验方 法
1．2．】样品的制备 参照杨军等 (2D02)的方法略有
修改 取珍 汕 97l{的水 稻花药 ．先用 甲苯胺 蓝染色
确定花药的发育剥硝，早 期的花 药朋解剖 刀切去两
端 ．后期 的花药从 中问一 切为二 ．迅速投 ^用 0．1
mol／I 的磷酸缓p1液(PBS．1 I_I 7．2)配制的 3 多聚
IlI群{现配 现 )．2，-t1．i垧戊 二隧 的 定液 巾 4℃ 固定
过夜 0．1 m r-】／I 磷酸缓冲液充分洗涤后．于 5，v／一．
锇献宝潞固定 0．5 h，充分洗涤后系列酒精脱水 ，环
氧丙烷过渡，Epon812常规方法 包埋 修块 、Leica
S 片机钻石刀 田片 ．覆 在 t5O目的镍 网上 。
1．2．2胶 体 金 免 疫 标 记 盈 染 色 参 照 杨 军 等
(g0Ci2)、李 家旭等 (1 989)的方法咯有修改 (j)将覆
有 片的镍刚浸于蒸馏水 r 5 min (2)吸干水分 ．
1
图 I-4 P：花粉；la：城毡层；Nu：细胞榜。每一版淘一 岫箭头所指为胶休金颗粒 I 花粉壁上 CaM的定i2．bar
= _ ㈨)_1『1，×0 clo0；2药 壁 ‘ (：aM 的定 位，bar=50：)nm．×3 )1_lI 3：花精 细袍棱 中 (’ M 构定位 ，bar= ⋯ I~ITI．
、柚 眦lI 4：孵育赦 巾没有加抗 (2aM iltl清的对 ： 匿 ．ba r= J n 2Tt．× 1,2 rio
I i s．I一4 I’：p l_e_l；Ta：ta J~e‘I 1n；Nn：ntic]e一 ¨ I Tl Pacl：：Lale，aTr() 『 clica e LI Le Ial e1lng 01d parIicIes 1：I．o
cal1 aIioI L cI (、 M l r I L)ll l1．hnr一 1 O0】 m ．v 30 )(1l1；2：』．[_c !l II⋯I．cf CaM 1n he t¨h r wal1．bar— 00 nm．
× ． 洲 I 3：L ( caIizaI L：n J¨f【’ M in i uc Jl LIs．J』1)(川 -1IB r— l00 nm ．×：{0：KIO；4：( 【 lltto]stained w LOHI a13ti
【’aM er Ll1]inI}1 l (、 i}1 i l r二 l¨0】1 ．A rrov~~indi aI c【】Le 、!d particles，×30 00 j．
片 下于 l 0 的 H O：巾刮蚀 5 rain ( 哎干
H ()：．在 PI3S i’(0，l、1 mo]／I PBS，pH7．2{1I．J mol／
【J NaCl；0．O2％ TVild1．!I~20；0．Il2％ NaN )洗涤 3
次．用封闭液(PBS r内 当 0．2]litlOI,．L。Id’氯 酸．1
牛血清 白蛋 白)室温封 闭 l0 1 (4)PBSI 洗涤 3
次．用 PBS F(内含 1 BSAj稀 释的抗 CaM 血 清
【 ： 0 J 30 温育 l～!h ( PBST洗涤 3改 ．所
封闭敞(【]BS1、内禽 -：．2 mn-ol I _十氨酸 ，1 牛血
清 白蛋 白)宣温封 闭 30 rain (6)PBST洗涤 后用
(PIJSI、内 l 牛血清 白蛋 白)稀 释的 l0 1金标
羊抗兔1g( (1：2o) )℃温育 l h (7)双蒸水充分
洗涤，自然干燥 对照(1),f4 J正常免咀睛代替抗
CaM 血清 ：(2)没有加抗 CaM 血清 ，其余 程序同上
切片经 2 的醋酸双 氧铀室温染色 60 rain，6 咛檬
霞钳窒温染 色 1 0 rain．用 口立 JEM-l0 0型迂 射电
子显微镜观察并拍照=
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1期 夏快飞等：一种可用于分析水稻花药中钙调素蛋白分布的胶体金免疫电镜标记技术 87
2 实验结果及讨论
2．1 CaM在水稻花药中的定位
在花药的花粉壁 (图 1)、花药壁(图 2)、花粉 细
胞核(图 3)等处均能见到有胶体金颗粒的分布，其中
绒毡层细胞有较多的胶体金分布(图 2)，绒毡层在花
药的整个发育过程中处于非常活跃的状态，通过绒毡
层的解体提供给花粉发育所需的大量物质(Pacini等，
1985)，估计绒毡层细胞中 CaM 分布较多与此有着密
切的关系。在花粉发育的单核期花粉内壁没有形成，
在花粉外壁及花粉的细胞质 中也含有较多的胶体金
(图 1)。图 4为对照，不见胶体金的分布。
2．2标记过程对 CaM 标记的影响
钙调素是一种热稳定性 蛋 白，因此用 Epon812
包埋样品可以获得较好的特异性标记物 ，这 曾被李
家旭等人(1989)证实。我们主要对标记过程中的温
度及时问的选择上做 了一些 比较研 究，结果表 明：
(1)10 H O 的处理时间：比较不同的样品处理时
间和 H O 浓度 ，发现用 10 的 H O。处理 5～lO
min即能得到较好的效果 ，H：O。处理时问过长或浓
度过高会影响细胞 的超微结构 。(2)抗体标记过程
中标记的温度 、时问直接影 响抗体标 记的特异性与
标记效果 ：我们 比较 了 3O、37℃下分别标 记 l、2、
2．5、4 h抗体标记特异性 ，3O℃下标记 1～2 h即可
达到较好的特异性标记 ，标记温度不宜太高 ，标记时
间超过 2 h后标记密度基本没有增加 ，故标记时问
达到 2 h即可。(3)在胶体金免疫标记之前于 3O℃
用阻断液阻断 3O～6O min可有效的防止非特异性
的标记。(4)染色 时间：我们通过 多次 的实验 发现
2 的醋酸双氧铀染色 6O min，及 6 的柠檬酸铅染
耳e耳e耳e心 耳e —．e 耳e—· 耳e心 耳e 心
色 10 min能够达到较好的细胞染色效果 ，细胞结构
反差适度且不影响胶体金颗粒的观察。
参考文献：
Fu Y(傅 缨)，Chen YF(陈以峰)，Liang St (梁世平)，et a1．
1 998．Immuno-Iocalization of calmodulin in unfertilized and
fertilized embryo sacs in N icotiana tabacum var．7nacro—
phylia(烟草受精前后胚囊中钙调素的免疫细胞化学定位)
EJ3．Acta Bot Sin(植物学报)，40(8)：683—687．
I ．Jx(李家旭 )。Liu Jw(刘杰 文)，Sun DY(孙大业 )．1 989．
Localization of calmodulin in corn root tip cels by protein
A—Gold immunoelet ron microscopy(玉米根尖细胞内钙调素
的胶体金免疫电镜研究)l-J]．Plant Physiol Commun(植物
生理学通报)，6：44—45．
Li Jx(李家旭)，Liu Jw (刘杰文 )，Sun DY(孙大 业)．1 992．
The protein A—Gold labeling technique of calmodulin in
plant cels(植 物 钙 调素 的免 疫金 标记 电镜 技术 )[J]．J
Chinese Electron Microscopy Societ(电子 显 微学 报 )，11
(2)：1O0— 103．
Pacini E，Franchi GG． 1 985． Thc tapetum：its form，founda—
tion，and possible phylogeny in Embryophyta[J]．Plant
Syst Evol，149：】55— 185．
Raymond EZ． 1998． Calmodulin and calmodulin—binding pro—
reins in plantsl,J]．Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Bi—
o ，49：697— 725．
W ayne AS，HilIeI F． 1998． CaImoduIin，caImoduIin—related
proteins and plant responses to the environmentl,J]．Trends
i 尸lant Science，3(8)：298— 303．
Yang J(杨 军)，Zhao J(赵 洁 )，Liang SP(梁世平)，et a1．
2002．Changes of calmodulin dist ribution in the embryo sac
0ryza “￡ t ￡before and after fertilization：an immunogold
electron microscope study(水稻受精 前后胚囊 内钙 调素分
布的变化 ：免疫金电镜观察)[J]．A ct Bot Sin(植物学报)，
44：246— 272．
Zhao J(赵 洁)，Zhou C(周 嫦)，Yang HY(杨弘远 )．】998．
Dist ribution of membrane-bound calcium and actived caIm—
odulin in isolated zygotes and young embryos of Triticun
aestivum(小麦分离合 子与 幼胚 中膜钙 和钙 调素 的分布)
[J]．Acta Bot Sin(植物学报)，40(1)：28～32．
(上接第 106页 Continue from page 106)
参考文献：
中国科学院中国植物志编辑委 员会．1997．《中国植物 志》第
四十三卷第二分册[M]．北京 ：科学出版社 。第 】版 ．1 6．
国家 医药管理局中草药情 报中心站．1 986．植物有效成分手
册[M]．北京 ：人民卫生出版社 ，1 82—183．
温尚开．1991．两面针及其伪 品的 比较鉴别[J]．时珍 国药研
究 ，2(1)：2O一22．
Cheng YX(程 永 现 )，Lei ML(雷 茂林 )，Zhou J(周 俊)．
2002．Sesquiterpenoids from M ichelia lacei and their che—
motaxonomic significanxe(壮丽含笑 中的倍半萜成分及其化
学分类学意义)lJ]．Acta Bot Yunnan(云南植物 研究)，24
牛e e e e e e—电 e心 e 牛 e
(1)：129— 132．
Chen X(陈 晓)，Wei FX(魏福祥)，Qu YH(瞿延辉)．2003．
Development in the study of elemenc~the active of principIe
of Rhizoma[ur~uTnae(莪术 中有效成 分一⋯榄香烯 的研 究
进展)[J]．Hebei Chemical Engineering and Industry(河北
化工)，(6)：9—13．
Yan JH(阎建辉)，Tang KW(唐课文)．Xu Y(许 友)，et“f．
2003． Analysis of chemical component of volatile oil from
Zanthoxylum bugeanum Maxin by GC／MS(GC／MS法分析
花椒挥发 油的 化学 成分)[J]．J Chin Mass Spectroznetry
Society(质谱学报)，24(2)：326—33】．
维普资讯 http://www.cqvip.com