全 文 ：广 西 植 物 Guihaia 25(4)：353— 355 2005年 7月
野生天麻 DNA导入马铃薯实现
遗传转化的研究
周鹤峰 ，邵 敏2，葛正龙2
(1．遵义医学院珠海校区生物 工程教研室 ．广东珠海 519041；2．遵义医学院生物化学教研室 ，贵州遵义 563003)
摘 要：采用浸苗法将野生天麻总 DNA导入马铃薯试管苗，对筛选得到的转化植 株进行蛋白及药用成份 的
分析。结果显示：(1)在 200株转化的马铃薯中有 21株的紫外扫描图谱与正常对照组有显著差异，且在
220nm有明显吸收峰。(2)5株经 PCR扩增出野生天麻抗真菌蛋白(GAFP)基因。(3)转基因马铃薯与正常
马铃薯的蛋 白表达有明显差异 ，并且在转基因马铃薯 中有一条与野生天麻抗真菌蛋白(GAFP)相同的条带。
而正常马铃薯中无此条带。(4)通过薄层层析法检测出 3株转基因马铃薯表达野生天麻的有效药用成份天麻
素。说明采用浸苗法进行外源总 DNA导入是可行的。
关键词：野生天麻 ；浸苗法 ；天麻素；转基因
中图分类号：Q943．2 文献标识码：A 文章编号：1000-3142(2005)04-0353-03
A genetic trans formation
wild Gastrodia elata
study of introducing
DNA into potato
ZHOU He—feng ，SHAO Min ，GE Zheng—long
(1．Department ofB 0Pn耳 nPP—n ，Zhuhai Campus，Zunyi Medical College，Zhuhai 519041，China；
2．Department of Biochemistry。Zunyi Medical College，Zunyi 563003．China)
Abstract：After the tuber had grown up，the solution of gastrodin was extracted from the potatoes which were
transformed by wild Gastrodia elata DNA．SDS-PAGE was used tO analyze GAFP gene．TLC was used tO an-
alyze the gastrodin of transformed potatoes．Results：(1)21 transformed plants had obvious obsorption peak at
220nm in 200 transformed potatoes．(2)The fragment of wild Gastrodia elata GAFP gene was found by PCR
from 5 transformed plants．(3)The protein expressions in transgenic potatoes were obviously different from
normal potatoes；A band was detected in transgenic potato and wild Gastrodia elata，but wasn t detected in
normal potatoes．(4)We detected the expression of the gastrodin by TLC from 3 transformed plants．It is fea-
sible tO use the soaking seedling method tO introduce exogenous DNA into plants．
Key words：wild Gastrodia elata；soaking plantlets method；gastrodin
野生天麻(Gastrodia elata，BI)属兰科，是名贵
传统中药，有着非常广泛的药用价值，近年来随着过
度的采伐 以及病虫 害等原因 ，其 资源 已受到严重威
胁 ，因此对珍稀濒危的野生天麻进行可持续利用 的
研究已迫在眉睫。自从二十世纪 7O年代周光宇教
授提出DNA片段杂交假设以来，应用“花粉管通道
法”、“浸泡法”等方法将外源 DNA导人植物已成为
一 种新的有效的遗传转化方法。作为外源基因导人
技术之一的“浸苗法”已在烟草、大豆、蚕豆等作物中
得到了实际应用，并实现了遗传转化，朱生伟等
(1999)应用浸苗法成功的将外源 DNA导人烟草，
导人后代在形态、品质和成分含量等方面已产生广
收稿 日期 ：2004一l1—29 修订 日期 ：2005—03—20
基金项 目：贵州省省长基金 ；贵州省科技厅社发基金 (编号 ：200l112)。
作者简介：周鹤峰(1980一)，男，山东莱阳人．硕士，研究方向为植物转基因。’通讯作者
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泛的变异。本研究旨在探索通过转基因植物来生产
野生天麻的有效药用成份的可行性，试图通过转基
因技术将野生天麻总 DNA导人马铃薯，培育出具
有药用价值或保健作用的马铃薯新材料和新品系。
1 材料和方法
1．1材料
野生天麻 ，购于遵义 ，经贵阳中医学院李涛副教
授鉴定。马铃薯(中薯 1号)，由遵义农科所提供。
1．2野生天麻总 DNA的提取
采用本实验室改进的 CTAB法，琼脂糖凝胶电
泳检测 DNA片段完整性，以 X-DNA作为分子量参
照，电压 4 V／cm，电泳 4 h。
1．3野生天麻DNA对马铃薯试管苗的转化
实验组：选择生长一致的马铃薯壮苗(5～7片
真叶)200株，在超净工作台上，用无菌水将根部冲
洗干净，滤纸吸净水滴，用提取的野生天麻 DNA溶
液(浓度为 500~h／mL)浸泡 36 h，转到 MS高糖培
养基上，温度 25℃，暗培养两个半月。
对照组 ：采用 TE液同样条件下处理。
1．4筛选转化植株
1．4．1粗筛(紫外扫描法) 分别取实验组和对照组
试管薯，称重，液氮研碎，按 1：30(w／V)的比例加
入甲醇，置超声波浴中超声 1 h后静置 24 h，再超声
1 h，静置 2 h，1 000 rpm／min，离心 10 min，取上清2
mL，通过紫外分光光度计在 2O0～300 nm下进行波
长扫描。
1．4．2细筛(PCR扩增野生天麻抗真菌蛋白) 分别
提取通过粗筛得到的转化株试管薯总 DNA，进行野
生天麻抗 真菌蛋 白(GAFP)的 PCR扩增。野生 天
麻抗真菌蛋 白(GAFP)基 因引物参 照相关 文献设
计，引物序 列 如下：上游 5，_AGGGATCGGTT—
GAATTCGGGCI_3’；下 游 5’一GCCAGACGCCGC—
CGCTGT一3’。
PCR反应条件：94℃，10 min；94℃，1 min；52
℃，45 s；72℃ ，45 s；72℃ ，6 min，30个循环。PCR
产物进行琼脂糖凝胶上电泳。
1．5转基因马铃薯中天麻抗真菌蛋白(GAFP)基因
表达的分析
分别取实验组和对照组试管薯，按照王义琴等
方法制成总 的可溶性蛋 白溶 液。采 用 5 的浓缩
胶，15 的分离胶 ，用考马斯亮兰 G250染色。
1．6转基因马铃薯中天麻素成份的分析
分别取实验组和对照组试管薯，称重，液氮研
碎 ，按 1：30(W／V)的比例加甲醇，置超声波浴中超
声 1 h后静置 24 h，再超声 1 h，静置 2 h，1 000
rpm／min，离心 10 min，取上清进行浓缩处理。以
0．5 羧甲基纤维素钠、硅胶 H 自制薄板 ，l1O℃活
化 30 min，各取样品及天麻素标准品 4 L点样，以
氯仿 ：甲醇 ：冰醋酸(6：2：0．15)为展开剂 ，展距
为 15 cm，10 磷钼酸乙醇溶液为显色剂，105℃烘
烤 6 min，观察并拍照。
2 结果与分析
2．1 DNA片段的大小
提取的野生天麻 DNA样品在 0．3 琼脂糖凝
胶上电泳，电压为5 V／cm，电泳 3 h，以~,-DNA作为
分子量参照，电泳结果显示：通过改进的 CTAB法
所提取的野生天麻 DNA样 品为单一条带，且片段
大小为 50 kb左右 (图版 I：A)，符合分子导 人要
求 。
2．2紫外扫描图谱分析
对 200株转化植株和 2O株正常的试管薯甲醇
提取液进行紫外扫描，扫描波长是 200 300 nm，结
果显示：有 21株转化马铃薯的紫外扫描图谱与正常
马铃薯有显著差异，并且转化马铃薯的甲醇提取液
在220 rim处有明显吸收峰(图版 T：B、C)。
2．3野生天麻抗真菌蛋白基因的 PCR分析
抗真菌蛋白是野生天麻皮层中的一种能强烈抑
制真菌生长的蛋白，马铃薯中不存在此蛋白，因此分
别以野生天麻总 DNA和通过粗筛的转化植株总
DNA为模板，通过 PCR扩增来分析野生天麻抗真
菌蛋白(GAFP)基因是否已转到马铃薯中，电泳结
果发现在 5株转基因马铃薯中扩增出与野生天麻抗
真菌蛋白位于同一位置(380 bp)的条带，结果见图
●
版 I：D。
2．4转基因马铃薯中野生天麻抗真菌蛋白(GAFP)
基因表达分析
野生天麻抗真菌蛋白(GAFP)是一种分子量为
14 kD的蛋白质，我们通过 PCR扩增的方法从粗筛
的21株马铃薯中细筛得到 3株含有野生天麻抗真
菌蛋白(GAFP)基因，此三株经过 SDS—PAGE分析
蛋白表达情况，结果显示：经过转基因的马铃薯植株
中含有野生天麻抗真菌蛋白(14 kD处)，而正常马
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4期 周鹤峰等：野生天麻 DNA导人马铃薯实现遗传转化的研究 355
铃薯中无此带，且转基因马铃薯与正常马铃薯的蛋
白表达有明显差异 ，见图版 I：E。
2．5药用成份分析
天麻素是野生天麻的有效药用成份，通过薄层
层析(TLC)法分析转基因马铃薯、正常马铃薯、野生
天麻三者中天麻素，结果可见，转基因马铃薯中可检
测到天麻素(图版 I：F)。
3 讨论
本实验从转化的马铃薯中检测到 5株含有野生
天麻的抗真菌蛋白基因，其转化效率为 2．5 ，比用
农杆菌介导的转化法效率要低，可能原因是：野生天
麻的总DNA导人马铃薯后其基因与受体马铃薯细
胞整合与转化完全是随机的，缺乏控制机制 ，因而实
现的目的性较差 ，以致转化效率低。尽管采用此法
转化效率不高，但仍表明 ：采用浸苗法将野生天麻总
DNA导人马铃薯中的方法是可行的。
野生天麻抗真菌蛋 白(GAFP)，其分子量为 l4
kD，它能强烈抑制腐生性真菌生长 ，从 而阻止密环
菌侵染顶生球茎，使其得以正常生长。马铃薯中不
存在此蛋白，我们通过 SDS—PAGE发现在转化的植
株中有野生天麻抗真菌蛋白，说明 GAFP基 因已整
合到马铃薯基因组中，并且通过基因表达调控而翻
译成野生天麻抗真菌蛋白。
野生天麻的有效药用成份为天麻素(gastrodin)
即对羟基苯一p—D-葡萄糖吡喃糖甙，它是一种小分子
有机物质 ，其 甲醇液在 220 nm 有最大吸收峰 ，本实
验通过紫外扫描法从 200株转化的马铃薯中检测到
有2l株的扫描图谱与正常对照组有明显差异，说明
天麻的基因在马铃薯中已经表达并且导致马铃薯发
生变异。变异的发生可能通过受、供体基因同源重
组这一整合途径或通过供体 DNA片断插入到受体
基因组中。
我们通过薄层层析法在 3株转化的植株中检测
到天麻素，而天麻素不属于蛋白质，说明天麻的基因
在马铃薯中已经表达并且通过一系列复杂的体内代
谢产生了天麻的有效药用成份天麻素。但在转基因
马铃薯中天麻素的含量很少 (样品浓缩 200倍)，如
何提高转基因马铃薯中野生天麻的有效药用成份
— — 天麻素的含量有待于进一步研究。
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