全 文 ：广 西 植 物 Guihaia 24(4)：345—349 2004年 7月
中华结缕草遗传分化的RAPD分析
李 亚，佟海英
( 国 学 植物研究所南京中山植物园，江苏南京 210014)
摘 要：中华结缕草(Zoysia sinica Hance．)在我国是分布于东部沿海地区的一个受威胁禾草，形态上还有一
个分布在海边的变种，长花中华结缕草(Z．sinica var．nipponica Ohwri)。采用 1O条随机引物对采自我国不
同地区 7个居群的 105个个体进行了RAPD扩增，对结果的 AMOVA分析表明，中华结缕草组问遗传分化不
显著，遗传变异只占总变异的4．84 ，居群间遗传变异占总遗传变异的 24．71 ，出现了显著的遗传分化，大
部分变异存在于居群内部，占总变异的7O．44 。不同数据处理方法得到了类似的结果，都支持哈迪一温伯格
平衡的假设。其中宁国汪溪居群和射阳海边居群变异最大，歙县新安江居群遗传变异最小。考虑到中华结缕草
遗传结构和变异的这些特性，在取样策略、保护和育种方法上，都应该以群居为主，同时兼顾主要的异地居群。
关键词：中华结缕草；RAPD；遗传多样性；遗传分化
中图分类号：Q943 文献标识码：A 文章编号：1000-3142(2004)04—0345—05
Genetic differentiation in Zoysia sinica
populations revealed by RAPD markers
LI Ya，TONG Hai—ying
(Institute of Botany，Jiangsu Province and the Chinese Academy of Science，Nanjing 210014，China)
Abstract：Zoysia sinica Hance．is an endangered grass distributed in east foreland of China，a variety，named Z．
sinica var．nipponica Ohwri．grow on the coastland．RAPDs with 1
．
0 screened primers were conducted to ac—
cess the genetic diversity of 105 plants of 7 populations collected in different region of China．About 4．84 ，
3O and 70 genetic variation was detected among groups，among populations and within populations respec—
tively．Similar results that all agree with Hardy-Weiberg equilibrium were acquired by different analysis meth—
ods．The highest genetic diversity exists among populations from Ningguo of Anhui Province and Sheyang of
Jiangsu Province，the lowest genetic diversity exists among populations from Shexian of Anhui．Regard of such
genetic structure and variation，population should be put important attention on sample policy，conservation and
breeding method，at the same time，attention should be given to other populations．
Key words：Zoysia sinica；RAPD；genetic diversity；genetic differentiati0n
植物种群的遗传结构反映了种的长期进化历史
(迁移、生境片段化和种群隔离)、基因突变、遗传漂
变、交配系统、基因流以及选择等不同过程之间的相
互作用，是遗传多样性保护、植物遗传改良等的重要
基础。随机扩增多态性 (Random amplified poly—
morphic DNA，RAPD)技术通过聚合酶链式反应
(Polymerase chain reaction，PCR)而迅速发展成为
居群内和居群问遗传多样性研究的主流技术(钱韦
等，2001；张富民等，2002)，在包括 Zoysia(Choi等，
1997)在内的许多植物上得到了广泛的应用，为我们
收稿日期：2003—08—22 修订日期：2003—11-20
作者简介：李亚(1968-)。男，安徽阜阳市人，博士，副研究员，主要从事资源植物学研究。
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理解居群遗传结构的这种复杂性提供了方便。
中华结缕草(Zoysia sinica Hance．)在我国主
要分布于山东、安徽、江苏和浙江等省区，主要生长
于滨海地区的沙质土壤和山区，具有较强的抗盐、抗
干旱、耐瘠薄和耐践踏能力，是近年来比较受推崇的
国产优异草坪草种质资源，也是结缕草属(Zoysia
wild．)中形态 性状 变异最 大 的种 类 (李 亚等，
2002)。由于大范围的围滩和开山种地，该种目前已
经处于濒危状态而出现在国家二级保护植物的名单
上。本研究的目的在于，通过对中华结缕草居群遗
传结构和遗传分化的研究，为科学和有效地确定种
质资源取样策略、核心种质筛选以及确定资源保护
和利用策略奠定基础，同时探讨 RAPDs技术用于
结缕草属遗传分化研究的可行性。
1 材料与方法
1．1材料
根据中华结缕草的地理分布，分别在山东、安
徽、江苏、浙江的不同地区采集 7个居群，每个居群
取样 15株(表 1)。取样时，居群内个体间距离都在
20 m以上，以避免取自同一克隆的材料。单株取回
后于玻璃温室中盆栽培养。经过鉴定，其中射阳、大
丰两 个 居群 为 长花 中华结 缕 草 (Zoysia sinica
Hance var．nipponica Ohwri)，其余 5个居群为中
华结缕草。居群取样地点及相关数据参见表 l。
表 1 中华结缕草居群取样地点
Table 1 Sampled populations of Zoysia sinica Hance in China with accession and location
1．2方法
选取幼嫩叶片0．5 g，带回实验室，采用 CTAB
法提取总 DNA。RAPD扩增反应在 PE9600 PCR
仪上进行，经过筛选，选用 10条随机引物。反应条
件经过比较和优化，确定为25 L的PCR反应液内
含：模板约 50 ng，1 UTaq酶，10×Buffer缓冲液
2．5 L，2．0 mmolL MgC12，四种 dNTP各 0．20
mmolL ，0．5~molL 引物。PCR扩增条件：94℃
预变性 4 min，然后进行 45个循环：94℃变性 15 S，
36℃复性30 S，72℃延伸90 S，循环结束后72℃5
min。PCR产物在含有 EB的 1．4 琼脂糖凝胶中
电泳，以 100 bp Marker(GeneRuler 100 ladder，
Fermentas UAB，Inc．)作为标准分子量对照，EP—
SON紫外自动成像仪照相。引物及扩增条带见表2。
1．3数据分析
RAPD是显性标记，同一引物迁移率一致的条
带假设是同源的，根据扩增阳性(1)和扩增阴性(O)
记录电泳谱带，形成原始数据矩阵(数据未列出)，三
种方法进行数据处理：(1)将条带的有无视为表征性
状，用 AMOVAPRE(ver．1．01，Mark Mulier，
1998)构建组文件以及居群文件，由于 AMOVA—
PRE可供选择的距离系数有限，采用 RAPDistance
(ver．1．31，John Armstrong etc．)计算Jaccard遗传
距离，构建距离矩阵文件，以此数据为基础，最后采
用 WINAMOVA(ver．1．04，Laurent Excofier，
1992)进行分子方差分析。(2)假定群体处于哈迪一
温伯格平衡(Hardy—Weinberg equilibrium)条件下，
通过隐性基因型频率的估算来计算各基因及基因型
的频率，用 POPGENE32(ver．1．31，Francis C．
Yeh)计算观测等位基因数(A)、有效等位基因数
(Ae)和基因多样性指数(He)来反映居群内不同结构
层次的遗传多样性和变异水平，同时计算居群总基因
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多样度(Ht)、各居群基因多样度(Hs)和基因分化系
数(Gst)，计算居群间的Nei无偏遗传一致度和遗传
距离，来反映居群间遗传分化。(3)以表型数据为基
础，计算 Shannon信息多样性指数：H一一ZP{。logPi。
表 2 引物和在 105个个体中得到的PAPD标记
Table 2 Primers employed and RAPD markers obtained
for the 105 individuals studied
表 3 中华结缕草居群 RAPD分析的遗传多态性
Table 3 RAPD polymorphism of population of
Zoysia sinica Hance．in China
居群 Population Nb Npb PPB Nb／p I
Nb：条带总数I Npb：多态性条带总数I PPB：多态性条带比率I
Nb／p：单位引物多态性比率；l：香农信息多样性指数
Nb：No．of RAPD bandst NpblNo．of poplymorphie bandst PPBI
Percentage of polymorphie bands；Nb／p：No．of polymorphic bands
per primer,I：Shannons Information index[Lewontin(1972)]
H：信息多样性指数，P 为扩增产物存在的频
率。
计算居群内遗传多样性 Hpop和种内多样性
(Hsp)。并辅以 SPSS 9．0在 RAPD表型基础上的
个体间聚类分析。
2 结果与分析
2．1居群内遗传多样性
10条 RAPD随机引物对中华结缕草样品的扩
增结果见表 2、表 3。7个居群的 105个个体，共扩
增出 79条 RAPD条带，大小在 250～1 400 bp之
间，其 中 64条带 为多态性 条带，占条带 总数 的
81．O1 。从多态位点百分率(PPB)、单位引物多态
性比率(Nb／p)、香农信息多样性指数(I)三个多样
性参数来看，各居群内的遗传变异都比较大，但各参
数在居群间的差异比较小。按照各居群遗传变异由
高向低的顺序，PPB值表现为居群 ZS05>ZSO1一
ZS07>ZS03>ZS02一ZS06>ZS04；Nb／p值表现为
居群 ZS05>ZS01一ZS07>ZS03>ZSO2一ZSO6>
ZSO4；I值表现为居群ZSO5>ZSO1>ZSO3>ZS07>
ZS06>ZS02>ZS04。可见不同参数得到的遗传变
异的大小也不完全相同，但反映的趋势大体是一致
的。来自宁国汪溪的居群和来自射阳海边的居群变
异最大，而来自歙县新安江的居群遗传变异最小。
基于基因频率矩阵，用 Popgen 32对中华结缕
草居群内平均观察等位基因数(A)、平均有效等位
基因数(Ae)和 Nei基因多样性指数(He)等基因多
样性评价的结果见表4。比较表3和表 4，以基因多
样性参数对中华结缕草居群的评价结果与作为表型
性状所得到结果比较类似，各遗传多样性参数仍以
宁国汪溪和射阳海边居群变异最大，大丰海边和歙
县新安江居群变异最小。
2．2居群间遗传分化
由于来 自海边盐生生境的种源和来自内陆甜土
地区的种源不仅在生境上而且在形态上都有一定的
差异，因此把它们分成两组，其中来自射阳和大丰的
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两个居群为一组，是长花中华结缕草，其余为一组，
是中华结缕草。在Jaccard距离系数矩阵的基础上，
表 4 中华结缕草居群的基因多样性
Table 4 Gene diversity of populations of
Zoysia sinica Hance in China
A：等位基因平均数lAe；有效等位基因数}He；基因多样度指数。
Al mean alele number}Ae：effective alele number~Hel Nei s
gene diversity．
用 AMOVA进行的遗传变异分子方差分析见表 5。
组间的遗传变异只占总变异的 4．84 ，遗传变异主
要存在于居群 内，占 7O．44 ，居群间变异 占 24．
71 ，出现了显著的遗传分化。基于表型分析的香
农多样性指数进行的居群间遗传分化的统计结果与
AMOVA分析的结果类似，居群内遗传变异占总变
异的 69．39 ，居群 间的遗传变异只 占总变异的
3O．61 ，而根据 Nei基因多样性指数估算的居群间
遗传分化(表 8)，相对较高，达 34．37 。居群间分
化的另一个现象，就是居群特有带。在本实验所得
到的 79条扩增带中，没有一个带型表现为居群特有
带，却有 15条带表现为居群共有带。Nei(1978)无
偏遗传一致度和遗传距离(表 6)分析也可以看出，
遗传一致度值都大于 0．8，而大部分居群间Nei遗
传距离都在0．2以下。遗传分化最大的出现在射阳
表 5 中华结缕草居群的AMOVA分析
Table 5 Analysis of molecular variance of 105 individuals of Zoysia sinica Hance using RAPD
SSD：方差总和 Sum of squared deviationI VCl变异组分 Variant component~1000次 permutation显著性检测 Signifcance tests after 1000
permutations．
表 6 Nei无偏遗传一致度(右上角)和遗传距离(左下角)
Table 6 Neis Unbiased Measures of Genetic Identity(above diagona1)and genetic distance(below diagona1)．
海边居群和歙县新安江边的居群、射阳海边居群和
宁国汪溪河边的居群、大丰海边居群和宁国汪溪的
居群以及普陀岛海边居群和歙县新安江居群之间，
Nei无偏遗传一致度值都小于 0．82，而 Nei遗传距
离都大于0．2；遗传分化最小的存在于射县海边居
群和大丰海边居群、普陀岛海边居群和宁国汪溪的
居群、大丰海边居群和句容居群以及句容居群和胶
洲湾海边居群之间，无偏遗传一致度值都在 0．9以
上，Nei遗传距离值则基本都在 0．1以下(句容农田
的居群和胶 洲湾海边居群的 Nei遗传距离值为
0．105 0)。
利用 SPSS 9．0进行中华结缕草居群个体间表
型聚类分析的结果(数据和树状图未列出)，虽然每
个居群都有部分来自同一居群的个体聚在一个组，
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但没有一个居群的个体全部聚在一起，而是分散在
不同的组中。
表7 由Shannon多样性指数估算的居群问遗传分化
Table 7 Partitioning of the genetic diversity among and
within 7 populations of Zoysia sinica Hance in China
estimated by Shannon’S diversity index
Hpop l居 群内遗传多样性 within-population genetic diversity~
Hsp1种遗传多样性 Total genetic diversity；Hpop／Hspl居群内遗传
多样性比例 Proportion of genetic within-population；(Hsp-Hpop)／
Hsp：居群阃遗传多样性比例 Proportion of genetic diversity among
populations．
HT：总基因多样性 Total gene diversity；Hsl居群内基因多样性
Within-population gene diversity；Gstl居群问遗传分化 Genetic dif-
ferentiation among pol~ulations．
3 结论与讨论
(1)中华结缕草遗传变异比较丰富，主要存在于
居群内，不同方法所得结果都在 7O 左右(65．63 9，5
～ 71．94 9，6)，居群之间遗传变异占3O (28．06 ～
34．37％)左右，已经出现显著的遗传分化。这与中
华结缕草异花受粉，同时又与无性繁殖的繁育系统
有关。来自海边的长花中华结缕草和内陆的中华结
缕草居群(句容居群除外)的 RAPD数据与形态特
点的关系基本一致的，但遗传分化不显著。不同方
法所得到的结果都显示，来 自宁国汪溪的居群和来
自射阳海边的居群变异最大，歙县新安江边的居群
遗传变异最小。其中来自江苏大丰的长花中华结缕
草居群和来自句容的中华结缕草居群之间的遗传距
离小于大多数中华结缕草之间的遗传距离，还有待
于进一步的研究、核实。
(2)考虑到中华结缕草遗传结构和变异的这些
特性，在取样策略、保护以及遗传育种方法，都应该
以居群内部的遗传变异为主，同时兼顾不同居群。
也就是说，在收集育种材料以及其它目的的取样时，
应在同一个居群内设置更多的取样个体，尽量将所
有变异单株都收集在内，在考虑就地保护措施的时
候，应该少设置保护区的个数而尽量扩大单个居群
保护区的面积。
(3)本研究没有对相同迁移率谱带的同源性假
设进行验证。Thormann等(1994)将 RAPD产物标
记作探针的杂交结果表明，与探针片断迁移率一致
的带有时并不同源，但这种情况仅发生在种间。同
时比较了 RFLP和 RAPD标记在种内和种间得出
的结果，发现虽然在种以上等级的结果相差甚远，说
明在迁移率一致的带中，可能存在序列不同但分子
量相同的几条带，RAPD无法区分，但在种内水平上
的结果是完全吻合的，Castagna等(1997)用 RFLP
和 RAPD比较研究也得出了相同的结论，说明在种
内水平上这种同源性假设是有依据的。
(4)利用显性标记(包括 RAPD)对 自然居群的
遗传结构进行分析，一般有两类方法：第一类是把条
带看作两个复等位基因的位点系统，在假定居群处
于 Hardy-Weinberg平衡的的条件下估计出基因频
率；另一类是不进行哈迪一温伯格平衡的假设，利用
条带的表型来估计遗传多样性，包括 AMOVA巢式
方差分析和香农多样性指数的阶层分析。本研究利
用这几种分析方法所得到的结果基本一致，都支持
哈迪一温伯格平衡状态的假设。表明这几种方法都
适合于中华结缕草居群遗传分化的分析。
参考文献：
Castagna R，Gnocchi S。et口Z．1997．Genetic variability of
(下转第366页 Continue on page 366)
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类与含量，确定合理的施肥方式，使所施肥料可缓解
重金属离子对作物的危害，真正的促进作物的生长。
本实验研究了 N、P、K共同施用时，Cu对小麦
种子萌发和幼苗生长的影响，至于 N、P、K分别施
表 1 施用N、P、K肥后．不同质量浓度的Cu对小麦叶绿素含量的影响
Table 1 Effects of fertilizer on the contents of chlorophyl of wheat with Cu
用时如何影响Cu对小麦种子的萌发和幼苗的生
长，我们将在下一步进行更为详尽的研究。
本文得到了孙存华教授和张健副教授的热情指
导，在此表示衷心的感谢。
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