全 文 ：广 西 植 物 Guihaia 26(5)：474— 478 2006年 9月
杜氏盐藻叶绿体 atpA基因片段的克隆及序列分析
侯桂琴1．2，刘红涛1，潘卫东1，薛乐勋1，2 ，姜东亚3
(1．郑州大学 细胞生物学研究室，河南 郑州 450052；2．郑州大学 第一附属医院，河南
郑州 450052；3．洛阳市新安县第一高级中学 ，河南 洛阳 471000)
摘 要 ：根据莱因衣藻、卵形肾藻 、普通小球藻等 1o种藻类的 atpA全基因氨基酸高度保守序列，设计简并引
物，利用 PCR方法从盐藻叶绿体 DNA中扩增出约 400bp的片段，将该片段连接到 T—vector上进行序列测定。
结果表明，核苷酸长度为 405bp，编码 135个氨基酸。推导的氨基酸序列与莱因衣藻的同源性为 92 ，普通小
球藻 88 ，Mesostigma viride87 ，卵形 肾藻 86 ，Cyanidioschyzon merolae85 。以所克隆的 DNA片段为
探针，与盐藻叶绿体基因组进行 Southern Blot杂交结果有明显的杂交信号。据此可推断本实验中所克隆的
序列为杜氏盐藻叶绿体 atpA基因片段 。该基因序列已被 GenBank收录，接受号为 AY435096。
关键词 ：杜氏盐藻 ；叶绿体 ；atpA；简并引物
中图分类号：Q943．2 文献标识码：A 文章编号：1000—3142(2006)05—0474—05
Cloning and characterization of atpA gene frag—·
ment from the chloroplast of Dunaliella salina
HOU Gui—qin 一，LIU Hong—tao ，PAN W ei—dong ，
XUE Le—xun ， ．JIANG Dong—ya0
(1．Laboratory for Cell Biology，Zhengzhou University，Zhengzhou 450052，China；2．The First Affiliated Hospital，
Zhengzhou University，Zhengzhou 450052，China；3．The First High School of Xin’an County，Luoyang 471000，China)
Abstract：According to conserved motif of the homologous amino acid sequence of ten kinds of algae，a pair of
degenerate primers were designed and about 400bp fragment was amplified from the chloroplast of Dunaliella
salina by PCR technique．The resulting PCR products were inserted into pMD-18 T—vector and sequenced
．
The results showed that the nucleotide sequence was 405bp which encodes 135 amino acid，and the sequence
shared high homology with atpA，with identity being 92 ，88 ，87％，86％ and 85 to C^ 7 d0m0ns rein—
hardtii，Chlorella vulgaris，M esostigma viride，Nephroselmis olivacea and Cyanidioschyzon merolae，respec—
tively．The cloned fragment was used as a probe，which would be hybridized with chloroplast DNA of D．salina
by Southern Blotting．Southern Blotting result revealed that there were obvious hybridization signals on cpD—
NA of D．salina．It can be concluded that the cloned sequence is atpA gene fragment from the chloroplast of
D．salina．The atpA gene was accepted by GenBank(Accession number：AY435096)．
Key words：Dunaliella salina；chloroplast；atpA ；degenerate primer
杜氏盐藻 (Dunaliela salina)是一种无细胞壁
的单细胞绿藻，在分类学上和莱因衣藻十分相似，其
最突出的一个生理特征就是其惊人的耐盐能力。它
可以在 0．5～5 mol／L的盐浓度下生长。对于其他
恶劣环境条件，如强酸、强碱、高温、强光照及重金属
离子等 ，盐藻也有很强的耐受力。另一方面盐藻还
收稿 日期：2005—04-18 修回日期 ：2006—02—20
基金项 目：国家 自然科学基金(30300208)；河南省医学科技创新人才工程项目(20020021)[-Supported by the National Natural
Science Foundation of china(303OO2O8)；Medical Technology Innovation Project of Henan Province(20020021)]
作者简介：侯桂琴(1977一)，女 ，河南浚县人，在读博士，研究方向为生物工程 ，(E—mail)hougqluo@126．com。
。通讯作者 ，研究员 ，博士生导师，专业方向为生物工程(Author for correspondence，E-mal：lxxue@public2．zz．ha．cn)
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5期 侯桂琴等：杜氏盐藻叶绿体atpA基因片段的克隆及序列分析 475
能大量合成并积累 口一胡萝 b素和甘油。正是盐藻的
这些特点，使其在基础理论和实际应用方面都有很
高的研究价值 。近二十年来 ，在 国内外植物遗传工
程研究中，取得 了许多核转化的可喜成果 ，培育出了
许多高产、优质和抗逆性强 的转基 因新 品种(Bro—
wet等，1999)。但是由于核转化的转基因植物涉及
到对环境的安全性问题，因此叶绿体转化引起了人
们的重视 (Staub等 ，2000；侯 丙凯等 ，2002)。叶绿
体转化具有众多优点 ：可同时进行多基 因转化、表达
的原核性 、后代遗传稳定 、定点整合、不易产生基因
沉默及母性遗传和安全性好 等 (范 国昌等 ，I998)。
但是面I临一个共同的问题，就是所用载体必须含适
于在叶绿体基因组中高效表达的启动子，因此选择
理想的启动子是至关重要的。只有选用的启动子在
宿主细胞中有转录起始 活性 ，外源基 因才有可能顺
利地得到转录和表达。采用宿主细胞 自身的启动子
等调控元件无疑是保证转录起始活性的最直接而有
效的方法。研究表明，在莱因衣藻中 atpA基因(编
码叶绿体 ATP合成酶 a亚基)簇(包括 atpA，psbI，
cemA和 atpH 四个基 因)共用一个启动子，这个强
启动子位于 atpA基 因的上游 (Drapier等 ，1998)，
它可以作为叶绿体载体表达系统的必要元件 。本室
曾采用莱因衣藻叶绿体 atpA基因启动子作为盐藻
叶绿体转化系统的启动子 ，虽然也有转录起始活性 ，
但表达效率不高。若能把盐藻叶绿体 自身的 atpA
强启动子克隆出来并用于其叶绿体表达载体无疑是
最理想的。盐藻与衣藻具有很高的亲缘性，并且除
具有衣藻的众多优点外，用盐藻叶绿体作为表达系
统还有一个更 大的优 点：无毒 ，可直接食用不需纯
化，从而降低转基因工程下游纯化的成本。故本研
究根据近缘藻类 atpA基因的氨基酸高度保守序
列，设计简并引物，用 PCR方法扩增得到了盐藻叶
绿体 atpA 部分 核 苷酸 序列 (GenBank Accession
AY435096)，旨在为下一步启动子的克隆和盐藻高
效叶绿体表达载体的构建提供理论依据。同时本研
究通过设计简并引物，采用 PCR的方法直接从叶绿
体基因组中克隆了 atpA基因片段，这为从叶绿体
中克隆某些基因提供了一种快速而简便的途径。
1 材料与方法
1．1材料
杜氏盐藻(Dunaliella salina D．S．UTEX 1644
Teod)购 自美 国(The University of Texas)，TaqD—
NA 聚合酶、连接酶 和 T一载体 购 自大 连宝生物公
司；BamH工、EcoR工、HindⅢ、IPTG和 X—gal购 自
上海 生物 工程公 司；大 肠杆 菌 JM109本室保 存；
North0 South虐Direct HRP Labeling and Detection
kit购 自PIERCE生物公司。
1．2方法
1．2．1盐藻细胞的培养 按照 5×10。细胞／mL的
接种量接种于Johnson’S液体培养基，于26℃光照
培养 ，光照强度为 4 500 lx，明暗周期为 12 h：12 h。
1．2．2盐 藻叶绿体 DNA(ctDNA)的提取 取 10
mL处于对数生长后期的盐藻培养液，4Z：5 000 rpm
离心 5 min，取 350 L NET(0．1 mol／L NaC1，50
mmol／L EDTA，20 mmol／L Tris—HC1，pH8．0)重
悬盐藻细胞沉 淀。加 25 L ProteinaseK(10 mg／
mL)，25 L 20 SDS混匀 ，55℃水 浴 2 h，置冰上
冷却后，加入 200 L 5 mol／L KAc，冰上静置 30
rain，4℃ 12 000 rpm离心 10 min；上清液加入等体
积酚／氯仿／异戊醇(25：24：1)抽提两次，再用等体
积氯仿抽提一次；水相加入 2倍体积的无水乙醇，混
匀后置于-?0℃放置 15 rain，4℃ 12 000 rpm离心 10
rain，用 70 乙醇洗涤沉淀 ，真空干燥后溶于 30 L
TE缓冲液中(图 1)。
1．2．3简并 引物的设计 从 GenBank上搜索近十
种藻类的 atpA全基因所编码的氨基酸序列进行 比
对 ，找出两段比较保守的序列 ，每段包含 6个氨基酸
残基，分别设计简并引物，涉及密码子简并性的分别
用 N、R、Y代替，由此设计的简并引物为：上游引物
(primer1)：5‘GCN GAR TAY TTY ATG TA 3’；
下游引物(primer2)：5‘CCN GCN ACY TGY TTC
AT3’。其中：Y=嘧啶(C，T)，R一嘌呤(G，A)，N
= 任一碱基(A，T，C，G)。上述引物由大 连宝生物
公司合成。
1．2．4 PCR扩增盐藻叶绿体 atpA基 因片段 以提
取的 ctDNA为模板 ，利用合成的简并引物 ，用 PCR
方法扩增 atpA基 因片段。扩增反应体系由以下成
分组成 ：10×PCR Buffer 5 L、上 游 引物 5 L(1
mmol／L)、下 游 引 物 5 L(1 mmol／L)、Taq酶
2．5U、dNTP 4 L(10 mmol／L)、模板 DNA1 L、补
双蒸水 至50 L。反应程序为 95℃预变性 1 rain，然
后按下列循环参数进行 扩增反应 ：94℃ 30 S，40℃
50 S。72℃ 50 S，经 30个循环后 ，72℃ 8 rain，以确
保链延长完全。反应结束后，1 的琼脂糖凝胶电泳
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476 26卷
检测扩增 产物
I．2．5盐藻叶绿体 pA基 圆片段 的测序 经 PCR
扩增反应获得 的产物 ，利用 pM 1St-vector(全 长
2，69 kb)为裁 悼进行体 外重组 和转化 ．用含 Amp、
X gal和 IPTG的 LB平板筛选 ．挑取 阳性 苗落 提质
粒 +后用 EcoR I和 』llnd【I进行双酶切鉴定 ．将含有
插入片段的重组质粒送上海基康公司测序．测序结
果与 GenBank上其他藻类 的 atpA基 因片段进行分
析 比较
1．2．6盐藻 绿体 A 基 因片段 的 Southern Blot
分析 为了确定此基因确实来自盐藻的叶绿体基因
组 DNA，将叶绿体基因组分别用 BamH I、晟oRV
和 Hind丌1酶切后电泳 ，然后把 克隆出的 atpA 基因
片段作为探针，进行 Southern Blot分析，
度 与 理 -仑值 相 符 ((；enBank
AY435O9~)
1 2 M 3 4
童曩一 霍 二30b P25
400 bp
图 2 重组 质粒积酶 四结果
Fig．2 The results of plasmid digestion
by EcoRI and Hindm
I 2 3．4：质 拉 雕 啪结 c1 ” reiNI【s of plasmgl
2 结果与结论 gestiDn)_M：DNA 一m血
2．1 PCR扩增产物
经 PCR扩增后 ，电泳 检测在 约 400 bp处 有
明显亮带 ．与预期扩增 的片段大小一致(图 1)。
M 1 2 M
重 10bP 5p43O
圈 1 盐藻1r绿体DNA和 PCR产物
Fig．1 ctDNA uf D．satina and the resu[t of PCR
M DNA 1。0bp ladcle r marker；1：盐 藻叶绿棒 DNAtctDNA of
D s,z／ina)；2：PCR ：物 (the product of PCR)
2．2盐藻叶绿体 atpA基因的壳隆殛重组质粒的鉴定
将 PCR扩增后获得的片段经琼脂糖凝胶回收
后与pMD】8 T VeCI。r相连进行体外重组和转化，
用含 Amp、X gal和 1PTG 的 LB平扳筛选 ．挑取 l 4
个li日性菡落进行快速 DNA 鉴定，用 EcoR I和
HindⅢ双酶 切，电泳结 果表 明 1，2．3，4具有与预测
大小一致 的插入片段(图 2)
2．3克隆 atpA基因片段序列测定结果
样 品测序得到 一个 4(巧 个核苷酸 的序 列，由其
推导的氮基酸序 列有 135个氨 基酸残基 ，所得 片段
2．4 atpA基 因片段的序列同源性分析
将测序结果与 5种近缘藻类的叶绿体 pA基
因进行 13LAS r分析 结 果屉示 ，本研 究克隆到的
基 因序 列 片段 与莱 因 衣 藻 ( r u rein—
hardti)、普 通小球藻 (Chlorela vulgaHs)，]Vie stig
H ide、卵形 肾藻(NephruseImis olivacea)和 Cya—
nidioschyzor~7~rero[ae叶绿体 utpA基 因氨基酸序列的
同源-陛分别为 92 、88 、87 86 和 85
图3显示．杜氏盐藻叶绿体 “tpA基因序列测
序结果转换成氡基酸后与近源藻类atpA基因片段
氨基酸序列的同源 比较。
氨基酸 序列同掉性 分析表 明．本实验克 隆的基
因序列为盐藻叶绿体 atpA基因
2．5 Southern Blot分析结果
用克隆 出的 “tpA 基 因 片段作 为搛针 与盐藻
ctDNA 的杂交 ，结果见 图 4
从图4可以看出，加 marker的泳道设有杂交信
号+而加ctDNA的其他三个泳道均有明显的杂交信
号，这说明本实验所克隆的 c tpA基因片段来自盐
藻 CtDNA。
3 讨论
简并引物实际上是一类 由多种寡檀苷酸组成的
混合物，彼此 之问仅有 一 个或敬 个核苷 酸的差 异
它可以用来检测一 个已知基 圈家族 的新成员 ．或用
来检测种间的同源基因 (萨母 布鲁 克等 ，l 992)，由
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5蝴 供桂琴等 ：杜氏盐藻U-r绿件 “tpA基固片段的克隆及序列分 析 477
于 目前对盐藻研究很少 ，其很 多有用基 因还不被人
知．至今尚未克隆 出盐藻 atpA 基因 ．救没有现成 的
序列 可供参考 另一方面 ，盐藻尽管与其他藻类 (如
衣藻 )有较近的亲缘 关系 ，但即使编码 的氨基酸一样
时，它们对密码 干的偏好性 也有～定 的差异 而设
计成简并引物就 可克服这些 问题 ．使 实验成功的机
会大大增加 。而简 并 引物 的成功应 用取决 于确定
PC．R 效率 与 特 异 性 的最 佳 平衡 条件 (Fietto等，
2002) 我们根据 GenBank上几种与杜 氏盐藻 亲缘
关系较近 的藻类 的叶绿体 atpA基因序列，比较筛
DLJ rta I i e 1【a AEYFMYTGRPTLVVYDDLSKQATAYREMSLLLRRPPGREAYPGDVFY I HSRLLER^ AKLN
Ch Iamyd0 0nas AEYFMYTGRPTLT I YDDLSKOAQAYREMSLLLRRPPBREAYPGDVFYLHSRLLERAAKLN
Ch l 0re I I a AEYFMY1GRHTLV l YDDLTKQAQAYREMSLLLRRPPGREAYPG。vFYLHSRLLERM KLN
Mesost i E『_a AEFFMYSGRHTLV I YDDLSKQAQAYREMSLLLRRPPGREAYPGDVFYLHSRLLERAAKLS
NeDh rose im i s AEYFMYSGRHTLV1 YDDLSK0A0^ YREMSLLLRRPPGREAYPGDVFYLHSRLLERAAKLS
乱嘧n Jd ∞c 0n ^EHF 0GKATLV1 Y0DLTK0ADAYR0MSLLLRRPPGREAYPBDVFVLHsRLL∈RM KLN
Dun日¨ e1 j a
Ch l anlydomonas
Chl o re1l a
legOst igrlfa
NephrDseI[1i s
Cyan i di oschyzon
OunaIi eIl a
Oh I amydomonas
Oh10 rel l a
Mesosli Ema
NeDh rcseIfli s
Cyan 1 d ioschyzon
SELGEGSMTALPIVETQEGDVSAYl PTNVt Sl TDGQI FLSSGLF SGLRPAI NVGI SVSR
NALGEGSMTALP l VET0EGDvS州 l PTNV l S lTDGQ I FLAAGLFNSGLRPA I NVG l SVSR
DKLGSGSMTALPW ET0EGDVS^ Yl PTNVl SI TDGQl FLSADI FNAGI RPAI NVGI SVSR
N L^GEGSf T L^P}JETOAGDVAAY}PTNV JSI TDOQ JFLSADLFNS~JRPA JNVG JSVSR
DALGEGSMTALPV l ETQGGDVSAY I PTNVI S I T口G。I FLSAD l FNAG l RPA I NVG I SVSR
KELGGGSMTALPI VETQAGDVSAY1 PTNVj Sl TDGOI FLSSDLFNAGI RPAI NVGI SVSR
VGSSA0YKAMK口VAG
VGSAAQPKAMKQVAG
VGS^^ 0pK^ 眦K0VA6
VGSAAQ：KAMKOVAG
V6SAA0VKAMK0V^ G
VGSAA0 I QSMKKVAG
图 3 杜氏盐藻叶绿体 atpA基因片段氨基酸序列及其同源性比较 (阴彰：保守鲺基酸一下划线： l锄序列)
Fig 3 Comlmri~m of deduced antin0 acid sequence of D “¨ _whh Chlamydomena rei~tAardti，C~iord hl! ⋯ r^ lJ l ”
_，f ．、 I，／,h ，， ．，m ⋯ f J( ch ^ c f ．respeczh,ely (The shaded洲 indicated homolaRie~(1 O0 ))
M 1 2 3
■
圈 ‘ Somhern Blot分忻结果
Fig 4 TIle result c){-~Jrnhem Blot
M DNA 1 0cbl。[adder market}I：Ba， H l酣 切后的 cIDNAI
2：bh,~d11阱 bJ 的 ctDNA：3 求酶 切的 ctEINt＼
选出氨基酸高度保守，并且核苷酸简井程度低的序
列 MKQVAG I AEYFMY，设计简并 引物 此 外，
在扩增体系中，我们将引 物浓 度提高 到 5 bm~ol／IJ，
高于常规 PCR要求引物浓度(0．1～l,umo／L)的j
倍 并且降低遇火温度，取得了比较理想的效果 我
们将 PCR产物克隆到 -r载体上，随机挑取 】l{个阳
性菌落提质粒，双酶切初步筛选后测序
研 究表 明，菜 因衣藻叶绿 体 ATP合成酶是 一
种多亚基酶复台物 。它包括一个具有五个亚基( 、口
、6和￡)的亲水复台物(CF )和一个具有三个亚基
(cI、C U、CⅢ)的疏 水复合物(CF-,)。并 且在列菠
菜的CF ／CF ATP音成酶研究中发现 a、口、￡ c T
和cII亚基是在叶绿体中编码并合成，而 、a和 c
Ⅱ亚基是在胞浆中台成并转运(Jefreyr等，l 986)
本实验通过 Southern Blot分析又一次证实了atpA
基周来自于叶绿体，由叶绿律编码井台成 这为下
一 步 pA 基因在 盐藻 c-[DNA 中的定位及 全基固
序列测定具有 十分重要 的指 导意 义。根据 BLAST
分析结果．本实验所得的核苷酸序列转化氡基酸后，
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其氨基酸序列与莱因衣藻、普通小球藻、Mesostig—
ma viride、卵形肾藻和 C 彻 0 z0，z rnerolae叶
绿体 atpA基因氨基酸序 列的同源性分别为 92 、
88 、87 、86 和 85％，从而推断该片段为盐藻叶
绿体 atpA 基 因片段 ，并且 序 列 高度 保 守。利 用
DNAtools分析表明，此序列全部为编码区，不存在
内含子。同时通过上述 比较发现，盐藻与衣藻 atpA
基因的同源性最高，近一步说明二者有亲密的亲缘
关系，提示衣藻的研究对转基 因盐藻有着重要 的参
考价值。
atpA基因在植物叶绿体中表达ATP合成酶的
a亚单位，其在进化过程中有高度的保守性，并且
atpA基因簇(包括 atpA、psbI、cemA和atpH 四个
基因)共用一个强启 动子 。如果把盐藻本身 的这个
启动子克隆出来并用于其叶绿体表达载体中，无疑
是保证转录起始活性的最直接而有效的方法 。本实
验所获得的盐藻叶绿体 atpA基因片段，因为太小
(405 bp，全基因约为 1．5 kb左右)，因此不能解 释
该基因所有信息，但是通过本实验可进一步获得
atpA全基因，为近一步克隆并分析该基因的启动子
序列及构建盐藻高效叶绿体表达载体提供理论依据。
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