全 文 ：广 西 植 物 Guihaia 22(3)：252— 255 2002 年 5月
高产 SOD大蒜悬浮细胞系的选育
李志勇 ，罗焕亮 ，郭 勇
(1．广州出入境检验检疫局．广东广州 510623；2．华南理工大学食f 与生物工程学院 ，广东广州 510640)
摘 要 ：筛选获得 了高产 SOD大蒜悬 浮细胞系 ．培养 18 d后达到最 大生物量及最大 SOD总酶活分别为
22．12 g．DW／I 及 10．81×10 u／I ．最大单位细胞酶活为 679．67 U／g．Fw，SOD最大比活力可达 85．98 U／
mg Pro．具有较强的 SOD合成能力 。
关键词 ：大蒜 ；高产细胞系 ；悬浮培养；SOD
中图分类号 ：Q945．51 文献标识码 ：A 文章编号 ：1000—3142(2002)03—0252—04
Sel ection 0f high—yiel d SOD garl ic
suspension cel 1 1 ine
LI Zhi—yong ，LUO Huan—liang!，GU()Yong
t 1．Ins1 cctio；l and(Quaral zlilw BH， “m f，Guangzhrtu，Guangzhou 510623．Chinal 2．Colege oJ Food and
Bioenginee~‘ing．South Chi,za Untverst3 _，Tecknolog3，．Guangzhou 510640，China)
Abstract：High—yield SOD garlic suspension cel line was obtained after selection．The maximum biomass was
22．12 g．DW／I while the maximum total SOD actix，it5，was 10．81×10 u／I by selecting garlic cell line after 18
days’suspension culture．The maximum SOD unit actixrity and the maximum specific SOD activity of selected
garlic cell line were 679．67 U／g．FW and 85．98 U／mg Protein respectively．
Key words：Alhum sativum I ；high—yield cell line；suspension C ulture；superoxide dismutase
大蒜是百合科葱属植物蒜 (Alium sativaurn I一)
的鳞茎 ，在我 国南北广 泛栽培 。该植物不仅可作为
蔬 菜鲜食或加工 ，还 可作为香辛调 料，并且具 有很
高的药用价值。在植物界中，大蒜是含超氧化物歧
化酶(SOD)量最高的植物之一，完全可作为SOD的
天然植物来源 。现 已明确知道，SOD在抗辐射损
伤、抗炎症、预防衰老和治疗癌症肿瘤等方面具有
积极作用。运用大蒜细胞大量培养生产代谢药物超
氧化物歧化酶，应用前景广阔。本试验在以往研究
的基础上，进行了高产 SOD大蒜细胞系的筛选工
作 ，以期 为大蒜细胞 悬浮培养生产 SOD打下基础 ，
最终实现大蒜细胞大规模培养生产 SOD。
1 材料与方法
1．1材料及培养条件
采用筛选得到的继代稳定的大蒜愈伤组织 ，
以 40 g．Fw／I 的接种量 转入 含 3 蔗糖 的 MS+
3．0 mg／I 2，4一D+1．2 mg／I 6-BA 液体培养基 中。
固体培养基为添加 0．8 琼脂 的液体培养基 。悬浮
培养条件为：温度 2 。C，全天光照 ，光强 1 200 lx，摇
床转速 1lb r／min。继代培养条件为温度 25。C，600
lx 12 h循环光照。
收稿 日期 ：2001—03—26
作者简介：李志勇(1 972一)，男 ，江西黎川人 ，博士，工程师，发酵工程专业 ，现在广州检验检疫局食品实验室工作 。
基金项目：国家 自然科学基金资助项 目(29676017)
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3期 李志勇等：高产 SOD大蒜悬浮细胞系的选育 253
1．2预选悬浮细胞 系的获得
选择有代表性 的黄色和绿色愈伤组织各 5个夹
碎 为小 细胞 团，在 液体 培养基 中加玻璃 珠培 养 18
d，然后将分散的小细胞团在 MS固体培养基上进行
连续继代培养 ，去杂后转 入液体培 养基悬 浮培养 ，
得到 1O个稳定性能较好 的细胞 系作 为预选悬 浮细
胞系。
1．3高产大蒜悬浮细胞系的筛选
将生长对数期的预选悬浮细胞系接种在 MS液
体培养基 ，悬浮培养 3O d。在培养 12 d后每隔 3 d取
样测定其胞 内 SOD总酶活 ，取培养过程中的最大总
酶活作为筛选依据。
1．4细胞生长的测定
斗真空抽滤后得 到的细胞 用多倍体 积的蒸馏水充
分洗涤 ，抽干后称取细胞湿重，然后 于 6O℃ 烘箱中
烘干至恒重 ，干燥器中冷却后称取细胞 干重 。生长
指数为培 养过程 中的最大生物 量 (湿重 )除 以接种
生物量(湿重)之比值 。
1．5大蒜细胞 内 SOD的测定
大蒜 细胞 SOD为较 稳定 的胞 内酶，其类 型 以
Cu，Zn一 SOD为主 。称取鲜重为 100 mg的大蒜细
胞 ，用预冷 的抽提缓 冲液(200 mM 磷 酸二氢钠／磷
酸氢二 钠，pH7．8，4 [w／v]PVP，0．5Yo[V／V]
Triton X 100)洗涤 3次 。加入上述抽 提缓 冲液，用
4O w 超声波处理 10 rain，4 000 r／rain离心 10 rain，
得到的含酶上清液转入透析袋中 ，黑 暗条件下 ，对
培养过程 中，定期取下 2～3瓶培养物 。布氏漏 1 I 磷酸缓冲液(200 mM 磷酸二氢钠／磷酸氢二钠 ，
表 1 10个预选悬浮细胞系的生长和状态特征
Table 1 Cell growth and tissue characters of 1 0 pre—select cell lines
pH7．8)透析 24 h，期间更换缓 冲液 4次。取透析后
酶液采用微量连苯 三酚 自氧化法。 测定其 SOD酶
活力 。
1．6酶液蛋白质含量的测定
采用 Bradford的 CBBG一250法“ 。
2 结果与分析
2．1预选悬浮细胞 系的生长和形态特征
预选悬 浮细胞系为 1O个稳定性能较好的细胞
系，它们的生长和状态特征如表 1。
从上表可知 ，凡是从黄色或浅黄色愈伤组织得
到的悬浮细胞系其生长指数均较高，而且颗粒的粒
径均小于 1 mm，而从绿色或淡 绿色愈伤组织获得
的悬浮细胞系生长指数偏低，而且颗粒偏大，有些
颗粒易结 团，不易分散 ，难于适应 大规模细胞悬浮
培养 。因此 ，考虑到悬浮细胞 系的生 长速率及松散
程度 ，应采用黄 色或浅黄色大蒜悬 浮细胞 系以获得
较大的生物量 。
2．2高产大蒜悬浮细胞系的筛选
为 了进一步 比较 10个预选细胞系合成代谢产
物 SOD的能力 ，将生长对数期培养的悬浮细胞系接
种在 MS培养基悬 浮培养 。各个大蒜悬浮细胞系最
大总酶活出现时间及合成 SOD的能力见表 2。
从表 中结果 可 知，不 同大蒜 悬浮 细 胞 系合成
SOD的能力各有差异 ，黄色或浅黄色大蒜悬浮细胞
系合成 SOD的能力 } 色或淡绿 色大蒜悬 浮细胞
系高。而且，细胞系生长指数的大小与其合成 SOD
的能力呈正相关，表明大蒜细胞生长与 SOD合成是
相偶联的。另外，不同悬浮细胞系达到 SOD最大总
酶活 的时间也有一定差异 ，从培养开始后 18～24 d
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254 广 西 植 物 22卷
不等。
综合 比较预选的 10个大蒜细胞系 ，从细胞生长
速度 、细胞 系状态 和合成 SOD能力等方面考虑 ，选
择细胞 系 6，其生长指数为 5．49(219．6 g．FW／I )，
达到最大 SOD总酶活为培养后 18 d，合成 SOD最
大能力 为 10．81×10 U／I ，作 为高产 SOD大 蒜悬
浮细胞系。
表 2 不同细胞系合成 SOD能力比较
Table 2 Synthesis ability of SOD
among 1 0 garlic cell lines
细胞系最奄总酶活出现时间(
c e
n1
A n
s
c
0
e
D
time o f
ax1 u acti itv m m m 3 U U v
SO1)合成能力
f× l 0 U／t )
Svnthesis ablIitv Of SOD
7．69
3．1 6
5． 5
6 1 7
l0．54
10．81
： 37
8．96
3．05
8 59
2．3高产 SoD悬浮细胞 系细胞生长 和合成 SoD的
特性
为 了进一步弄清高产 SOD悬浮细胞系的特性 ，
我们 采用 40 g．Fw／I 接种 量，接 种到悬 浮培 养基
中，定期观察高产悬浮细胞系的特性 ，结果如图 1所
示 。
从 图 A可见 ，在培养初期 ，大蒜细胞生长缓慢 ，
总 SOD酶活变化不大 。随着培养的进行 ，大蒜细胞
新 陈代 谢过程 加快 ，胞 内合成 SOD的能力 随之加
强。当细胞对数生长期结束时，SOD的合成还会持
续一段时间才会趋 于稳定 。随后 ，细胞进入平衡期
和衰老期 ，细胞活力下降 ，也削弱 了合成 SOD 的能
力 ，导致培养后期 SOD总酶活呈下降趋势 。大蒜细
胞生长 和 SOD积 累呈现密切 的偶 联关 系，在 培养
18 d时细胞生物量和SOD总酶活都达到最大值，分
别为 22．12 g．DW／I 及 10．81×10 U／I 。因此 ，为
了获得 最大 SOD总酶活 ，选取 18 d龄的细胞进行
收获是适宜的。
图 B显示 了大蒜 细胞培养生产 SOD的单位 细
胞酶活和 SOD 比活力变化过程。由图可见 ，我们筛
选得 到的大蒜悬浮培养细胞具有较 强的合成 SOD
的能力 ，其单位 细胞 酶活力变 化趋势是 先升后 降，
在悬浮培养 12 d可达最高为 679．67 U／g．Fw，约
为蒜瓣 (152 U／g．FW) 的4．5倍。SOD最大比活
力在悬浮培养后 15 d可达最高为 85．98 U／mg Pro，
表明此时大蒜细胞 内 SOD含量较高。
0 3 6 9 l2 l 5 l 8 2l
Culture time(day)
— -．卜 SOD unit activity
0 3 6 9 l2 l 5 l 8 2l
Culture time(day)
O 3 6 9 l2 l5 l8 2l
Culture time(day)
图 1 高产悬浮细胞系细胞生长和合成 S0I)特性
Fig．1 Character of cell growth and SOD production
of high—yield SOD garlic suspension cel line
A一生物量和 SOD总酶活；B一单位细胞酶活和
SOD 比活力 ；C一细胞含水量 。
图C为大蒜细胞悬浮培养过程中细胞含水量
的变化 曲线 ，大蒜细胞含水量在培养过程 中显示 出
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3期 李志勇等：高产SOD大蒜悬浮细胞系的选育 255
先升后降然后又再升高的趋势。总的来看，培养过
程 中细胞含水量保持在 90 左右。
3 讨 论
植物在繁殖过程 中雌雄配子之间的随机组合 ，
形成 了众多的基 因型 ，这为进行高产细胞 系的选育
提供 了巨大的物质基础 。同一种类不同个体、不同
部位 的外植 体诱导 的愈伤组织其生 长特性 和 目的
物含量也显著不 同 ，因此 有可能通过 自然选择法
选出生长速率快，目的产物含量高的细胞系。如
Srinivasan等从 Ta．TUS baccata中选出的细胞系倍增
时间 为 4～5 d，培养周期 结束 时紫 杉醇 的产 量为
8．2 mg／I ，而普通细胞系的产量为 1．5 mg／I ” 。杜
金华等 用小细胞 团法筛选产花青素的玫瑰茄细胞
系，结果 获 得花青 素 含量达到 2．33 的稳定 细胞
系，比筛选前提高了 14．5倍 。
我们 以前也筛选得到了产 SOD的大蒜悬浮 细
胞 系 ，悬浮培养 15～18 d，细胞 生物 量最 大约 为
12．08 g．DW／I ，SOD总酶活为 3．78×10 U／I ，单
位细胞酶活为 312．9 U／g．Fw，胞 内 SOD的比活力
为 33．7 U／mg Pro。同以前筛选的大蒜细胞悬 浮细
胞系相 比，我们重新筛选获得的高产 SOD大蒜悬浮
细胞 系的最 大生物量及 SOD总酶活均 有较大幅度
的提高 ，同比分别提高了 83．11 和 185．97Y0，这为
利用 大蒜 细胞大规模培养生产 SOD打下了较好 的
基 础 。
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Expl anation of Pl ates
Pl ate I An anatomical structure in the fl oral nectar of Xin—Li No．7
E—Epidermis；F—Filament；N—Nectar；NT—Nectar tissue；P—Parenchyma；S-Starch grains：SI—Style；St—Stoma；V—Vascular
bundle．
1．Scanning of a blooming flower，showing the place of the mature nectar，× 52；2．I．ongitudinal section of nectar at emer
gence budding stage，× 528；3．Longitudinal section of nectar at swel budding stage，×528；4．I．ongitudinal section of nee—
tar at corola appearance stage，showing surface—bulges of nectar，×528；5．Longitudinal section of nectar at initial blooming
stage，showing more dense cytoplasm ，×528；6．Longitudinal section of nectar at ful blooming stage，× 528；7．I．ongitudi—
hal section of nectar at senescence stage of flower．showing the central big vacuole in nectar—cells，× 528；8．I．ongitudinal
section of nectar at ful blooming stage ，showing starch grains decreasing in nectar—cells．×528；9．Longitudinal section of
nectar at initial blooming stage，showing many starch grains in nectar—cels，× 528；10．I．ongitudinal section of nectar at
senescence stage of flower，showing no starch grains in nectar—ceils，×528．
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