全 文 ：广 西 植 物 Guihaia 23(6)：561— 564 2003年 l1月
影响沙 田柚 叶片离体培养的 因素研究
黄 涛，董高峰，张兰英，李耿光
(中国科学院华 南植物研究所 ，广东广州 510650)
摘 要 ：研究 了离体培养条件下影响沙 田柚叶片愈伤 组织诱导和分 化的一些 因素 。结 果表明 ，2，4-D可 以诱
导愈伤组织的形成 ，高浓 度的蔗糖 (6 )显著提高叶片愈伤诱导率与 愈伤组织重量 ，且在 2，4-D和蔗糖之间存
在着相互作 用。外 源 GA3处理抑制愈伤组织 的诱 导和生 长 ，而 CCC与 ABA处理 显著 提高叶 片的愈伤诱导
率和愈伤组织生长量 。愈伤组织 转移到 附加 3．0 mg／I BA 的 MS分化培 养基 上可 以分化 出芽 ，0．25 mg／L
GA3的加入可以进 一步提高愈伤组织的分化率 和每块愈伤组织的再生 芽数 。
关键词 ：沙田柚；愈伤组织诱 导 ；分化
中图分类号 ：Q945 文献标识码 ：A 文章编号 ：1000—3142(2003)06—056l_O4
Factors affecting in vi tro shoot regeneration
from leaf explants of Citrus grandis
(L．)Osbeck CV．Shatian-YU
HUANG Tao，DONG Gao—feng，ZHANG Lan—ying，LI Geng—guang
(South China Institute of Botany，Chinese Academy of Science，Guangzhou 5 10650，China)
Abstract：Some factors were investigated in the shoot regeneration from the leaf explants of Citrus grandis
(L．)0sbeck CV．Shatian—YU．The results showed that 2，4-D COUld induce the caIlus formation from leaf ex—
plants．The addition of the sucrose at 6 significantly increase the callusing frequency and the calus growth．
The interaction existed between 2，4-D and the sucrose． Exogenous GA3 inhibited the callus formation and
their growth． Chlorocholine chloride(CCC)and abscisic acid (ABA)treatments，however，significantly in—
creased callusing frequency and the callus growth． Adventitious shoots were differentiated when calli were
transferred to MS medium supplemented with 3．0mg／ I BA．The addition of GA3 at 0．25 mg．L‘ greatly in—
creased regeneration frequency and the regenerated shoots number per callus．
Key words：C． grandis；callus induction；differentiation
沙 田柚是我 国南方重要 的经济果树 。由于沙田
柚是多年生木本果树 ，传统 的育 种 手段 在改 良沙 田
柚品质、培育新种质上显得效率低且不易操作。生
物技术的应 用为快速改 良沙田柚 提供 了一个新 的手
段。一个高效离体再生体系的建立对于沙田柚的遗
传转化非常重要 。由柑桔 叶片再 生完整植株 比较 困
难 (Yelenosky，l987)，迄今 为止 ，有关柚类 叶片诱导
的愈 伤组织 再 生植 株 仅 有 少数 的报 道 (Chaturvedi
和 Mitra，l974；Goh等 ，l995)，且 再 生 频率 较 低 。
本文通 过研究 一些影 响沙 田柚 叶 片再生 的因素而建
立一个高效的培养体系 ，为进一步的遗传转化奠定
良好 的基础 。
收稿 日期 ：2002-03-08 修 订 日期 ：2002-07-22
基金项 目：国家 自然科 学基 金 (39870539)；广 东 省 自然 科学基 金 (989l 78 ；广东省 百项 创新 工程 (99B05902X)资助 。
作者简 介 ：黄 涛(1972-)，男 ，河 南正 阳县 人 ．博 士 ，从 事细 胞工程 研究 。
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562 广 西 植 物 23卷
1 材料与方 法
1．1材料培养
沙 田柚 种子去皮后在 75 乙醇中浸 30 S，然后
用 0．1 HgC1。消毒 l0 rain，在无菌工作 台上剥去
内种皮 ，播种于内含 2O mL 1／2MS培养基的大试管
中。在 40 mo1．m-。．s 的光照条件下培养 ，每天光
照 16 h，温度 25±2℃。培养 30 d后取叶片用于愈
伤组织诱导。
1．2愈伤 组织诱导
以无糖 MS为基本培养基 ，分别 附加不同浓度
蔗糖(0 、3 、6 、9 )与不同浓度 2，4一D的组合
处理(表 1)，以研究 2，4一D与蔗糖对叶片愈伤组织
诱导的影响。为研究 GA3、ABA与 CCC对叶片愈
伤组织诱 导的影响 ，在附加 1．0 mg．L。2，4一D与
6％蔗糖 的 MS培 养基 上 ，分 别加 入不 同浓 度 的
GA3，ABA和 CCC(表 2)。GA3在培养基灭菌后过
滤加入。培养的光照条件同上。
1．3愈伤 组织分化
以 3．0 mg．L。BA的 MS为分化培养基 ，由不
同条件下诱导的愈伤组织转移到分化培养基上，培
养条件同上，培养 40 d后统计分化率和单位外植体
再生芽数。为了研究 GA3处理对愈伤组织分化的
影响，在分化培养基上另外再加入不同浓度的 GA3
(表 3)，所用的愈伤组织是在附加 1．0 mg．L 2，4一D
与 6 蔗糖的 MS培养基上诱导的愈伤组织。
2 结 果
2．1 2。4-D与蔗糖 配合处 理对 叶片 愈伤 组织诱 导 的
影响
从表 1可知，在最初培养的 14 d内，1．0 mg．
L 2，4一D与 6％蔗糖处理的叶片愈伤组织诱导率最
高 ，而 当 2，4一D浓 度为 3．0 mg．L。时 ，6 的蔗糖 完
全抑制愈伤组织 的发生。在培养 的第 40 d时，1．0
mg．L 2，4一D与 6 蔗糖处理的叶片愈伤组织生长
量最大，而对于 3．0 mg．L 2，4一D来说 ，3 的蔗糖
可以产生最大的愈伤诱导率和愈伤组织生长量。因
此，2，4一D与蔗糖在诱导叶片愈伤组织上具有浓度
效应，同时二者间存在一定 的相互作用。1．0 mg．
L 2，4一D诱导淡绿色致密的愈伤组织，这种愈伤组
织可 以在 附加 BA 的 MS培养基 上分化，但 3．0
mg．L‘。2，4-D诱导黄褐色疏松的愈伤组织，这种愈
伤组织在附加 BA 的 MS培养基上不能分化不定
芽。
表 1蔗糖浓度对 2。4-D诱导 沙 田柚 叶片愈伤组织的影响
Table 1 Influence of sucrose concentration on callus
formation induced by 2，4一D from leaf explants of
C．grandis(L．)Osbeck CV．Shatian～Yu
2，4一D 蔗糖
(mg．I．1) su
(
c％ro
)
s。
愈伤组织诱导率 伤组织重量
Callusing frequency(％) Ca11us fresh
14 ——— weight(mg)
每处理的外殖体数量为 45，重复 3次 通过 LSD(0．05)分析，同
一 栏中字母相同的表示无显著性差异。
Values are means of three replications with each treatment using
45 explants．The same letter in the column denotes no significant
difference by LSD test at 0．05 signficant leve1．
2．2 GA3。ABA与 CCC对 叶片愈伤 组织诱导 的影 响
由表 2可知，GA3处理显著降低叶片愈伤诱导
率与愈伤组织的生长量，随着 GA3浓度的增加，抑
制作用增强。GA3诱导的愈伤组织在外观上呈黄
褐色 ，当转移到 附加 3．0 mg／L BA 的 MS培养基
后，这种愈伤组织不能分化。而 ABA与 CCC处理
可以显著提高愈伤组织诱导率和愈伤组织生长量。
ABA与 CCC的作用具有浓度效应 ，其中 0．1 mg．
L ABA与 1．Omg．L CCC诱导愈伤组织的作用最
强。ABA与 CCC均诱导淡绿色的愈伤组织，这种
愈伤组织在附加 3．0 mg．L BA的 MS分化培养基
上可 以分化 不定 芽 。
2．3 GA3对愈伤组 织分化的影响
由叶片诱导的淡绿色愈伤组织可以在附加 3．0
mg．L。BA的 MS培养基上分化。分化培养基 中加
入 GA3可以进一步提高愈伤组织分化率和每块愈
伤组织的再生芽数，培养 6周后的统计结果表明 0
25 mg．L GA3诱导的愈伤组织分化频率最高(表
3)。GA3诱导愈伤组织分化的芽在形态上变得细
长，叶片变得狭窄(图 1)。这种不定芽转移到附加
0．2 mg．L- BA的 MS培养基上增殖培养时，可平均
增殖 4～6个芽(图 2)。不定芽转移到附加 1．0 mg．
L IBA的 1／2MS生根培养基上培养 20 d后可以再
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6期 黄 涛等：影响沙田柚叶片离体培养的因素研究 563
生 l～2条根 (图 3)。生根 苗 在 室 内锻 炼 2周后 移
栽到大田，成活率达 89 左右。
图 1 愈伤组织在 附加 GA3的培养基上分化不定芽
Fig． 1 Adventitious shoots regeneration from callus
cultured on M S medium supplemented with GA3
图 2 再生芽在 附加 0．2 mg．L BA 的
MS培养基上增殖 培养
Fig．2 M ultiplication of adventitious shoots cultured
Oil M S medium supplemented with 0．2 mg．I BA
图 3 再生芽在附加 1．0 mg．L0IBA的
MS培养基上诱导生根
Fig．3 Rooting of regenerated shoots on M S
medium supplemented with 1．0 mg．L一 IBA
表 2 GA3，BA与 CCC对沙 田柚叶片愈伤组织诱导的影响
Table 2 Effects of GA3，ABA and CCC on the caIIus
induction from leaf explant of C．grandis
0sbeck CV．Shatian—YU
表 3 GA3处理对沙 田柚叶 片诱导的愈伤
组织分化 不定芽的影响
Table 3 Effects of GA3 at different concentrations On
adventitious shoot regeneration from leaf—derived
callus of C．grandis(L．)Osbeck CV．Shatian—Yu
3 讨 论
在植物组织培养中，蔗糖不仅为培养物提供能
量，而且是培养物渗透环境的主要调节者。培养基
中糖的种类和浓度不仅影响培养物生长速度和生长
量 ，而且影响其代谢水平及细胞的形态和发生。吕
芝香等 (1981)研究 了不 同碳源对 甘薯块根愈伤组织
诱导和生长的影响，结果发现 2 蔗糖最有利于愈
伤组织的生长 ，高浓度蔗糖(8％)完全抑制愈伤组织
生长。本文的研究表明 6 的蔗糖较适合叶片愈伤
组织的诱导和生长 ，高浓度蔗糖(9 )同样抑制愈伤
组织的生长。这种对蔗糖需求的差异也许与植物种
类及外植体的差异有关 。蔗糖浓度过高抑制愈伤组
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564 广 西 植 物 23卷
织生长可能与渗透压增高 ，从而影响水分的吸收有
关(吕香芝 等 ，1981)。Giladi等 (1977)报 道 甜橙 的
芽在无糖 的培养基 上 能产 生最 多 的愈 伤组织 ，高浓
度的糖抑 制愈伤 组织 发生 ，但 高 浓度 蔗糖 抑制愈 伤
组 织发生同渗透 压无关 ，因 为高 浓度 甘露 醇并 不抑
制愈伤 组织 的发生 。本文的结 果表 明 ，在蔗糖 和 2，
4 D浓度间存在着一定的相互作用 ，对于 1．0 mg．
L。2，4一D而言 ，6 的蔗糖最 适合 愈 伤组织诱 导 ，而
当 2，4一D浓度为 3．0 mg．L 时 ，3 的蔗糖 最适 合愈
伤组织诱导 (表 1)，这 说 明 蔗糖 是直 接影 响愈伤 组
织 的诱导和生长 。
在植物组织培养中，通常使用生长素类物质诱
导愈伤组织，除此之外，其它生长调节物质也显著影
响愈伤组织 的诱导 和 生长 。本 文 的结 果表 明 ，GA3
处理抑制 愈伤 组 织 的诱 导 和 生长 ，而如 果 用 ABA
处理则 显 著促 进 愈 伤组 织 的生 长 (表 2)。Altman
与 Goren(1971，1974)报 道 ABA 可促进 甜橙 嫩芽诱
导的愈伤组织，并进一步证明 ABA诱 导愈伤组织
包括 2个 阶段 ，即先 由 ABA诱 导特 定 的细胞 活化 ，
随后愈伤组织的增 殖 可 由 GA促 进 ，因此甜 橙愈 伤
组织的诱导取决于外植体 中 ABA与 GA 的平衡。
Goren等 (1979)进 一步报 道 了 ABA 对甜橙 愈 伤组
织诱导的促进作用与 ETI_I有关。本文的结果证实
GA3抑制 愈伤组织 的诱 导 和增殖 ，这 一点 可 由 GA
合成抑制剂 CCC处理 能显 著 提高愈 伤组 织诱 导 率
和愈伤组织生长 而得 到进 一步证 实(表 2)。但 GA3
却有利于愈伤组织在分化培养基上分化不定芽 (表
3)，因此 ，GA3在愈 伤组 织 诱 导和 愈 伤组 织 分化 阶
段具有相反的作用 。在不同的培养阶段可以通过在
培养基 中加 入 GA3或其 拮 抗剂 ABA、合成抑 制 剂
CCC而调节外植 体 的分化 ，从而 建立一 个高效 的离
体培养体系 。
～ 一 一一兰薹 一一 ～一～ 一～ ～ 一～ ～～～ 一一
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