全 文 ：广 西 植 物 Guihaia 28(1)：l5— 19 2008年 1月
水稻双受精过程 的址 I-t J，、聚焦显微镜观察
代西梅，黄群策，秦广雍
(郑州大学 离子束生物工程省重点实验室，郑州 450052)
摘 要：首次利用核特异荧光染色与整体透明技术并利用激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)对水稻双受精过程
进行了观察。激光扫描共聚焦显微镜具有“组织与细胞 CT”的功能，可以对整体组织进行扫描并构建三维结
构。经荧光染色及透明处理后，在激光扫描共聚焦显微镜下经 488 nm激光激发，胚囊内各细胞的细胞核以及
核仁发出明亮荧光，细胞核轮廓 比较清晰，层次感强，并能清晰观察到胚囊 内各细胞的结构特点和空间位置关
系。不论是对开花前较小的成熟胚囊材料还是开花后较大的胚囊材料都取得了较好的观察效果。同传统的
光学显微镜和荧光显微镜相比，其观察到的图像更清晰、更直观、更具立体感。
关键词：水稻；胚囊 ；双受精 ；激光扫描共聚焦显微镜 。
中图分类号 ：Q944．44 文献标识码 ：A 文章编号：1000—3142(2008)01—0015-05
Observation on the double fertilization in rice
by using confocal microscopy
DAI Xi—Mei，HUANG Qun-Ce，QIN Guang-Yong
(Henan Provincial Key Laboratory of Ion Beam B 0 P g aPr g，Zhengzhou University，Zhengzhou 450052，China)
Abstract：Nucleus fluorescent staining and whole clearing technique was first used in this study to observe the process
of the double fertilization in rice by using Laser Scanning Confocal Microscopy(LSCM)．LSCM is a powerful tool in
studying the structure of tissues and cels because of the function of“CT Scanning”．W hen the sample，which was
stained with nucleus fluorescent and cleared with whole clearing technique，was excited by 488 nm laser，the nucleus
and nucleolus Of the cells in it excited bright fluorescent color and the profile of the nucleus was very clear．And the
LSCM image showed perfectly the structure and special position of the cells in the embryo sac．Not only the images
of smal embryo sacs before fertilization，but also the images of big embryo sacs during and after fertilization were
perfect．The results suggested that the LSCM was an ideal tool tO study the process of double fertilization compared
to traditional photics microscope．
Key words：rice；embryo sac；double fertilization；Laser Scanning Confocal Microscope(LSCM)
受精作用是生殖生物学的中心问题之一，自
1898年俄国植物学家 Nawaschin首次在欧洲百合
和细弱贝母中发现双受精作用以来，人们对各种植
物的双受精作用进行了广泛研究 ，积累了较为丰富
的资料。水稻是主要的农作物之一，国内外对其雌
配子体及雄配子体的发育过程作了大量形态学及细
胞学研究。有关其双受精过程的研究，虽然也有过
一 些报道(吴素萱等，l965；黄群策等，2000；Akemi—
nev，1914；Cho，l956；Terada，l928)，但由于受制片
技术及观察手段的限制，对其雌、雄核融合过程及受
精时间都有待于进一步的认识。
激光扫描共聚焦显微镜 (LSCM)是 2O世纪 8O
年代发展起来的当今世界最先进的分子细胞生物学
分析仪器，在观察水稻双受精过程中具有重要作用。
它在荧光显微镜的成像基础上加装激光扫描装置，
利用紫外或可见光激发荧光探针 ，可得到细胞或组
收稿 日期：2006—07—03 修回日期 ：2007—01—23
基金项目 国家“863”项目(sz-01—01—03) 国家“十五”科技攻关项 目(20OlBA3O2B)[Suppomd by National“863”Program(sz-01一O1—03)；Key Technolo—
gies Research and I)evelopment Program of State Tenth Five-Year Pr oject(2OO1BA3O2B)]
作者简介 代西梅(1974一)，女，河南郑卅1人，讲师，博士，主要研究方向为植物遗传育种。
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织内部较清晰的荧光图像。利用 LSCM 可以对活
的或固定的细胞及组织进行无损伤的系列“光学切
片”，得到其各层面的信息，这种功能也被形象地称
为“显微 CT”(李楠等，l997)。此外 ，还可以对样 品
材料进行连续扫描，通过电脑处理获得其三维立体
结构，对其样品内各细胞的空间分布有更清晰的认
识。利用 LSCM观察水稻胚囊结构、形成及发育过
程等研究已有一些报道(任宏等，l998；张华华等，
2003)。Christensen等(1997)利用激光扫描共聚焦
显微镜检术对拟南芥菜 (Arabidopsis thaliana)胚
珠进行观察，取得理想效果。从而证明了 LSCM在
水稻生殖发育研究中有巨大的应用前景。本文首次
利用核荧光染色和子房整体透明技术并利用 LSCM
对水稻双受精过程及胚和胚乳的早期发育进行了详
细的观察 ，得到了大量清晰的图片 ，为正确认识水稻
的双受精过程提供了一些有力的证据。LSCM在被
子植物双受精研究中的应用，将会大大推动双受精
在细胞水平及分子水平上的研究。
1 材料与方法
1．1实验材料
紫粳和 IR36。2004～2005年将实验材料种植
于河南新乡市农业科学研究院水稻研究所的实验田
内，采用常规管理 。
1．2实验方法
分别于开花前 l d，开花后 0．5、l、2、3、4、5、6、
l2、24 h取颖花用 FAA固定液固定，并保存于固定
液中。每个时期约取颖花 5O个。观察前用 7O 的
酒精冲洗一下，接着在解剖镜下分离出子房，保存于
7O 酒精中备用。染色前，各个时期的水稻子房经
5O 、3O 、l5 乙醇至蒸馏水 ，每次 20 min。然后
用 pH8．2磷酸盐缓 冲液预处理 2 h，再用 0．005
水溶性苯胺蓝溶液染色 2 h。蒸馏水冲洗 2～3次 ，
然后再用 l／~g／mL的 DAPI溶液染色 12 h。用蒸
馏水 冲洗 2～ 3次 ，乙醇 梯度 (15 9／6、30 、5O 9／6、
7O 、85 、95 9／6)脱水，每级 20 min，随后将子房放
人无水乙醇中脱水两次，每次的脱水时间为 2 h，接
着，再转入无水乙醇中过夜。第 2天将已经脱水的
材料放人由无水乙醇和水杨酸甲酯(1：1)组成的混
合液中过渡 l h，再用水杨酸 甲酯透明处理 3次。在
前两次透明时 ，每次 2 h，最后一次透明的时间为 15
h。所有的试验材料经过水杨酸甲酯透明处理后可
以在水杨酸甲酯中保存备用。观察前，用镊子轻轻
将处理好的子房夹 出，置于凹玻片上，用丁香油封片
(注意加盖玻 片时 ，不要挤压 ，防止 子房变形 或破
裂)。将制备好的载玻片倒置于 Leica SP2激光共
聚焦扫描显微镜上 ，用 488 nm波长的激光激发 ，扫
描获得双受精各个时期的清晰图片，并用 Leica相
关软件对系列扫描图片进行 3 D重建。
2 结果与分析
2．1受精前雌、雄配子体在 LSCM 下的结构状态
水稻子房或花粉粒经荧光染色及透明处理后，
通过 LscM 可清晰的观察到胚囊内各细胞结构及
花粉粒内部结构。细胞核及核仁经激光激发后可以
显示较强的荧光，通过 LSCM 的激光扫描系统可以
清晰的观察到胚囊内各细胞的结构及空间分布情
况。由于水稻胚囊在成熟期较大，在观察时发现胚
囊内各细胞不一定在同一个光学切面上，此时可利
用 LSCM 系列 扫描 功能进 行逐 层扫描 ，即“细胞
CT”功能。如图版 I：la，lb即为同一成熟胚囊的
两个不同光学切片。LSCM 的这种功能可以使我们
更准确地观察组织内不同层面的结构，并免去石蜡
切片、超薄切片等繁琐的制片工作。系列扫描图像
经计算机三维重建后，可得到样品的三维重建结构
(图版I：2)，三维重建后的图像可沿x、Y、Z轴进行
任意角度的旋转，可从不同的角度观察样品内的结
构及空间关系。利用 LSCM 的这种连续扫描及重
建功能同样也可以清晰的观察到水稻成熟花粉内各
细胞结构及其空间分布关系(图版 I：3)。
2．2双受精过程
水稻开花后不同时期的子房经整体染色后，在
LSCM 下可清晰地显示水稻双受精的整个过程及合
子和初生胚乳核有丝分裂的情况。
开花后 0．5 h，可清晰地观察到花粉粒在柱头
上萌发，形成花粉管。花粉管形成后，进入柱头组
织，并在柱头组织中伸长(图版 I：4)。在开花后 1
～ 2 h，可见花粉管经珠孔进入胚囊，但此时未观察
到花粉管内精子的释放。在开花后 2～3 h，花粉管
在退化助细胞的位置释放出两个精子以及其它一些
内含物(图版 I：5)。杨弘远(2005)认为水稻花粉管
在退化助细胞中释放精子及其它内含物的细节，尚
缺乏足够翔实的证据。作者在利用激光共聚焦显微
镜对水稻双受精的观察过程中，确实观
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1期 代西梅等：水稻双受精过程的共聚焦显微镜观察 17
图 版I la．1b．同一成熟胚囊2个不同切面：2．1a，lb重构形成的图片；3．成熟花粉粒，示营养细胞与两个精细胞；4．开花0．5 h后，花粉粒
在柱头上萌发形成花粉管，花粉管在柱头中伸长；5．开花后 2～3 h，花粉管在退化助细胞的位置释放出两个精细胞，精细胞呈卵圆形；6．精核
内容物分别进入卵细胞与极核；7．在一个极核内出现一个小的雄性核仁；8．开花后3～4 h左右，精核的染色质在卵核内扩散，与此同时，极
核内的雄性核仁逐渐变大，最后差不多与极核核仁一样大。
Plate T 1a．1b．Tw。different sections of 1 mature embryo sac；2．Reconstruction picture of 1a and 1b；3．Mature polen grain，showing one vegeta一
【1、i，e cell and t、v。sDerm cells；4．0．5 h after flowering，pollen tube generates and elongates in the stamen；5．2～ 3 h after flowering，the oval sperm
ce11s are released the site of the degenerated synergid；6．The inclusion of sperm cells migrates toward the point of fusion．7．A small male nucleolus
appears m the polar nucleus．8．About 3～4 h after flowering，the cbromatin of the sperm nucleus diffuses in the egg nucleus，and at the same time，
the male nucleolus becomes larger，perhaps no smaller than the female one．
察到了花粉管在退化助细胞的位置释放出两个精子
的过程，如图版I：5。随后，精核分别进入极核与卵
细胞，精核的染色质向极核内分散(图版 I：6)。之
后在极核内出现一个小的雄性核仁(图版Ⅱ：7)。雄
卵核内出现一个雄性核仁(图版 Ⅱ：1，2)，而此时，极
性核仁会慢慢变大，最后增大至与极核的核仁差不
多大小(图版 I：8)。进入卵细胞的精核也慢慢移动
到卵核 的位置(图版 I：7)。开花后 4～5 h，可见精
核的内容物慢慢进入卵细胞核(图版I：8)，随后在
核已完成受精作用形成初生胚乳核，并很快进行有
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广 西 植 物 28卷
图版 I 1．开花后4 h左右，在卵核内出现1个雄性核仁；极核核模与雄性核模融合，形成具3个核仁的初生胚乳核；2．1个极核的核仁与雄
性核仁完成融合，形成具有2个核仁的初生胚乳核；3．初生胚乳核处在第一次分裂中期；4．初生胚乳核处于第一次分裂后期；5．开花后 6 h，
卵核内雌性核仁与雄性核仁尚未融合，初生胚乳核已分裂 1～2次；6．开花后 12 h左右，卵核内的雌性核仁与雄性核仁完成融合，形成一个较
大的核仁，卵细胞完成受精作用；7-8．开花后24 h左右，合子完成第一次分裂(4示横裂；5示纵裂)；9．开花后 24 h，合子完成第一次有丝分裂
时 ，已经形成 8个或更多的游离核 ，形成的游离核绕胚囊周缘分布。
Plate儿 1．4 h after flowering，a small male nucleolus appears in the egg nucleus，while nuclear membrane of polar nuclei and that of sperm has com—
pleted fusion and forms primary endosperm nucleus，which contains three nucleolus．2．The male nucleolus is fusing with one of the female nucleolus，
forming primary endosperm nucleus，which contains tWO nucleolus．3．The primary endosperm nucleus is in division(showing mitosis metaphase)；4．
The primary endosperm nucleus is in division(showing mitosis anaphase)；5．6 h after flowering，the male and female nudeolUS do not complete fu—
sion．At the same time，the primary endosperm nucleus has completed 1～2 mitoses；6．12 h after flowering，the male and female nucleolus complete
fusion and form a large nucleolus，then the fertilization of the egg cell completed~7-8．24 h after flowering，zygote completes one nfitosis(4 showing
transverse segmentation，5 showing longitudinal segmentation)；9．24 h after flowering，zygote completes one mitosis，and forms twc~ccll proembryo．
At the same time，the primary endosperm nucleus has divided into 8 or more free nuclei，distributing around the circumferenece of embryo SaC．
丝分裂(图版Ⅱ：3，4)。初生胚乳核分裂前，核仁一
直保持不融合状态，这与申家恒等在玉米中观察到
的情况相同(申家恒等，1987)(图版 Ⅱ：1)。有时雄
性核仁与 1个雌性核仁融合，即将分裂的初生胚乳
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l期 代西梅等：水稻双受精过程的共聚焦显微镜观察 l 9
核呈现出2个核仁的情况(图版Ⅱ：2)。这种情况类
似于卫星等(2004)在羊草双受精过程中观察到的现
象。开花后 6 h，卵细胞 核内的雌性核仁与雄性 核
仁仍未融合，而初生胚乳核已分裂 1～2次，形成 2～4
个游离核(图版Ⅱ：5)。在开花后 12 h，雌性核仁与雄
性核仁才完成融合。至此，卯细胞与精子的融合完成
而形成一个合子。在合子内只有一个较大的核仁(图
版Ⅱ：6)。此时，在卵细胞核周围有浓厚的细胞质围
绕。雄性核仁与卵核仁的融合一般发生在合子分裂
之前，合子以一个大核仁的形式进人分裂期。
合子一般在开花后 16～18 h进行第一次有丝
分裂，至开花后 24 h，合子完成第一次分裂，形成 2
细胞原胚。水稻大多数合子的第一次分裂为横分裂
(图版 Ⅱ：7)，但也有进行纵分裂的 (图版 Ⅱ：8)。通
常情况下，第一次分裂形成的两个细胞在形态上大
小较均等。到合子完成第一次有丝分裂时，已形成
8个或更多的游离核 ，形成 的游离核绕胚囊周缘分
布(图 丌：9)。水稻胚乳的发育类型为核型胚乳(胡
适宜，1 982)。
水稻受精作用属有丝分裂前的配子融合类型。
精核与卯核的融合过程和精核与极核的融合过程相
似，但精核与极核的融合速度比其与卵核的融合速
度快。精核与极核融合形成的初生胚乳核不经静止
期直接进人分裂 ，而精核与卯核融合形成合子后一
般有 6～8 h的静止期，然后才启动第一次有丝分裂
过程 。
3 讨论
关于花粉管进人胚囊及发生受精作用的时问。
Akimine(1 914)和 Ferada(1 928)曾报道过水稻的受
精时间是在开花后 12 h进行 的。Noguchi也对水
稻花粉粒的萌发和花粉管 的生长过程进行 了观察 ，
认为开花后 9 h花粉管才能到达珠孑L，因而受精时
间与作者上述的观察结果一致，即在开花后 12 h进
行。Cho(1 956)对不同温度条件下水稻花粉粒萌发
及花粉管生长速度进行了观察 ，认 为温度对花粉粒
的萌发及花粉管生长的速度影响很大，一般在 30。C
的田间条件下，花粉粒萌发和花粉管生长的速度是
相当快的，水稻开花后 30 rain，花粉管已达到珠孔，
有一些已经进入胚囊 ，并释放 出其 中的内含物于卵
细胞的上部。吴素萱等(1965)对水稻双受精过程也
进行了较为详细的观察，观察结果与Cho所观察到
的结果相一致。本研究用激光共聚焦扫描显微镜对
水稻花粉粒的萌发、花粉管的生长及受精时间进行了
系统的观察 ，在开花后 0．5 h，花粉粒在柱头上萌发，
并长出一定长度的花粉管延伸到在花柱及子房中，但
未见到花粉管到达珠孑L端及进人胚囊。开花后 1～2
h，花粉管进人胚囊。在开花后 4～5 h，极核完成受精
作用；开花后 12 h，卯细胞完成受精作用。
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