全 文 ：广 西 植 物 Guihaia 23(6)：549— 552 2003年 11月
几种生理因子对印楝细胞悬浮培养生长的影响
张娟芳 ，戚树源，何梦玲 ．胡兰娟
(中国科学 院华南植物研究所 ，广东广州 510650)
摘 要 ：通过研究不 同生理 因子对 印楝 悬浮细胞 生长 的影 响 ，建 立 了一 种快速 生长 的印楝 细胞 悬浮培养 体
系。结果表 明，在添加 了 6-BA 0．8 mg／I 、NAA 0．8 mg／L、蔗糖 30 g／ L且初始 pH 值为 5．8的 MS培养液 中，
以 60 g／L的接种量进行 印楝细胞 的悬浮 培养 ，细胞生长速率 可达 t．49 g,／I ·d。
关键词 ：印楝 ；细胞悬浮培养
中图分 类号 ：Q945．5 文献标识码 ：A 文章编号 ：1000—3142(2003)06—0549—04
Effects 0f several physiological factors 0n the growth
Ot Ce儿 SUSpen l0n CUltUI．e Ot AZ JP． Chta tnd C ■● ■■ ● ■』 n ▲ T● - ● -●
ZHANG Juan—fang，QI Shu—yuan，HE Meng—ling，HU Lan-j uan
(SouthChina lnstitute ofBotany，ChineseAcademy 0，Sciences，Guangzhou 510650，China)
Abstract；Effects of several physiological factors Oil the growth of cell suspension culture of Azadirachta indi一
( n was studied and a fast growing cell suspension culture system of Azadirachta indica was established．The
result showed that the cell growth rate of Azadirachta indica could reach 4．49 g／L ·d under the following
physiological conditions：the cell cultured on a M urashige and Skoog (M S)medium supplemented with 6-BA
0．8 mg／L，NAA 0．8 mg／L and sucrose 30 g／L，with tlle initial pH 5．8 in the medium and the cell amount of
inoculation 60 g／L of fresh cells．
Key words：Azadirachta indica；eel1 suspension culture
印楝 (Azadirachta indica A．Juss)是楝 科楝属
的热带乔木 ，原产 于 缅甸 和 印度 ，在 亚 洲南部 、非 洲
和南美洲的许多地区都有分布和栽培，但以印度等
亚洲国家产 量最大 ，我 国没有 印楝 的 自然分布 (徐汉
虹，2001)。印楝叶、树皮和种子的提取物一直是印
度等 南 亚 国家农 业 上 的 抗 虫材 料 ，1968年 Butter—
worth和 Morgan成功地分离出印楝素(azadiracht—
in)后 ，印楝作为杀虫剂 的研究 在世界 范 围内广泛开
展起来 (Saleem 和 Michael，1986)。研究 表 明，印楝
素对 200多种农业害虫有其他植物性杀虫剂无法比
拟的高生物活性，且因其不影响胆碱脂酶活性并能
生物降解，从 而对人 畜及环境无任何毒性 (Saleem
和 Michael，1986；李 晓 东 等 ，1995；Shirish等 ，
1995)
印楝 是近 代制备 无公 害农 药 的重 要植物 资源 ，
但印楝 中的杀虫有 效 成分 结构 复杂 ，难 以人工 合成
(赵善欢 等 ，1989)，采 用天然产物生产印楝杀虫剂又
受到印楝分布及印楝素含量的不稳定性等因素的影
响(Shirish等 ．1995)，不能满 足生产 的需求 ，所 以早
在二十世 纪 70年 代各 国学 者就 开始 进行 印楝组织
培 养的研究 (Rangaswamy和 Promila，1972)。到 目
前 为止 ，国内外学 者在 印楝 器 官培 养 、组 织分化 、植
株再 生和培 养物 中次生代谢 物质形成等方面做 了许
多工作 (Manisha等 ，1981，1988；Virenda等 ，1993；
Murthy 等，1998；Wawetzer，1998；戚 树 源 等，
1998)，但 有关 印楝 细胞 悬浮培养 的专 门研究 尚未见
报道 。采用植物细胞悬 浮培养技术生产天然产物 已
在许多植物上 获得成功 ，如采 用紫草 (Lithosper一
收稿 日期 ：2002—04—04 修订 日期 ：2002—10—28
基金项 目：广东省科委农村科技处星火计划储备项 目
作者简介：张娟芳(1977一)，女 ，湖北荆州人 ，硕士生．植物学专业 ，主要从事印楝组织培养与次生物质代谢生理等研究。
维普资讯 http://www.cqvip.com
55O 广 西 植 物 23卷
mUlTI erythrorhizon)细胞培养生产紫草素(戚树源
等，1997)，采用红豆杉(Taxus chinensis)细胞 培养
生产紫杉醇等(余龙江等 ，2002)。本文研究几种不
同生理因子对 印楝 悬 浮细胞 生 长 的影 响 ，旨在建 立
一 种快速生长的印楝细胞悬浮培养体系，为采用细
胞悬浮培养技术生产印楝次生代谢产物奠定基础。
1 材料 与方法
1．1实验材料与培养条 件
印楝叶片诱导的愈伤组织(戚树源等，1998)，已
在本实验室继代培养 2～3年 。本实验采用该愈伤
组织作为实验材料，建立 印楝细胞悬 浮培养体系。
所有实验如无特殊说明 ，均采用 150 mL三角瓶 ，装
液量 50 mL，摇 床转速 120 rpm，培 养温度 25±2
℃ ，光 照 培养 (以 日光 灯 为 光 源 ，每 天 连续 光 照 12
h，光照强度为 15～25 fmol m s )。
1．2细胞 生长测定
在 添加 了 6一BA 0．4 mg／L、NAA 0．8 mg／L、蔗
糖 30 g／L且初始 pH值为 5．8～6．0的 MS培养液
= 一
}兰
丘
_兰
1．
暮
2 1 6 H l【l 1： l 1 l“
J 猝 灭 数 ult u t⋯ d
中，分别接人 不 同接种 量 的印楝 细胞 。每两 天收集
1次 ，每一接种量每 次 3瓶 ，4O～5O℃干燥 至恒重 ，
取 3瓶细胞干重 的平 均 值 ，绘成 细胞 生长 曲线 。每
一 接种量下的细胞生长速率 一(该接种量下第 12 d
收获的细胞干重一接种时的细胞干重)／(每瓶培养
液体积×12)，单位 g／L·d。
1．3不同生理因子对 印楝 悬浮细胞生长的影响
分别调节 MS基本 培养液 中添加 的植物激 素的
种类和浓度、碳源的种类和浓度以及培养液的初始
pH值，印楝细胞的接种量均为 60 g／L，培养 12 d
后 收集 ，4O～ 5O℃ 干燥 称重 。实验 重 复 3次 ，结果
取平均 值。pH值用 Corning pH meter 12O测定 。
2 实验结果 与讨论
2．1不同接种量对 印楝 悬浮细胞 生长的影响
分别将 2O、4O、6O、80 g／L的新鲜印楝细胞接人
添加 了 6-BA 0．1 mg／L、NAA 0．8 mg／L、蔗糖 3O
g／L的 MS培养液中，印楝悬浮细胞的生长曲线如
图 l(A、B)所 示 。
^
{
=
3
一
=
一
；
2 4 n 8 l(1 l? l 4 1-
培 养人 数 Cu1 Lu r L itilt d
图 1 (A、B)不同接种量对 印楝悬浮细胞生 长的影 响
Fig．1 (A、B)Effects of cel amount of inoculation on the cell growth in
the cell suspension culture of Azadirachta indica
C20、C40、C60和 C80分别是接种量为 2O、4O、6O、8O g／L时的细胞培养 C20，C40，C60 and C80 are the cel suspension
cultures of Azadirachta indica with the cell amounts of inoculation of 20，40，60 and 8O g／L
由图 1(A)可 以看 出 ，当接种 量为 2O g／L和 4O
g／L时 ，印楝细胞 的生 长 曲线呈 “双 S”型 ，而 由图 1
(B)可 以看 出，当接 种量 为 60 g／L和 80 g／L时 ，印
楝细胞的生长曲线则呈双 峰型 ，这一 结果 说明 ，不 同
接种量对印楝细胞 的生长具 有明显 的影 响。在 四种
接种量下，印楝细胞均在接种后第 4天进入第一对
数生长期，第 1O天进入第二对数生长期；不同之处
在于：接种量为 2O～40 g／L时，印楝细胞的第一对
数期为 4天 ，且第一对数期结束后细胞生长不下降，
而接种量为 60~80 g／L时，第一对数期仅为 2 d，且
第一对数期结束后细胞生长下降，第二个生长峰值
低于第一个生长峰。在植物细胞悬浮培养中，采用
高密度培养的方法来增加培养物中次生代谢产物的
形成 ，已经有许多成功的例子 (Zhong和 Yoshida，
1995)，印楝细胞在高密度培养与低密度培养时表现
出不同的生长状态 ，可以考虑采用高密度培养的方
法来促进 印楝 悬浮细胞 中次生代谢产物 的形成 。
戚树源等(1998)在进行印楝愈伤组织培养和植
株再生的研究 中发现，印楝愈伤组织在添加了不同
6一BA和 NAA 组合 的 MS培养基中继代培养时均
维普资讯 http://www.cqvip.com
6期 张娟芳等 ：几种生理因子对印楝细胞悬浮培养生长的影响 551
出现两个生长峰 ，接种的愈伤组织所处的生长期和
培养基中的激素组成影响双峰出现的时间，但并不
改变印楝愈伤组织生长的双峰性质 。而在本实验
中，印楝悬 浮细胞 在接种量 为 60～80 g／L时生长曲
线也有双峰现象。印楝细胞生长出现两个生长峰的
特征是否与印楝细胞 的代谢分化有关 ，有待于进一
步研究 。
一
∞
量
蚤．蓍
20 40 6O 8O
接种 Cel1 alno[int of inoculation(g／fl ask)
图 2 不同接种量下印楝细胞生长速率
Fig． 2 The cell growth rate of Azadirachta indica
from different cel amounts of inoculation
O．0 0．1 0．4 0．8 1．0
6 BA浓度 Concenti，at ion of 6-BA(mg／L)
图 3 6-BA 与 NAA 的不 同浓度组 合
对印楝 悬浮细胞生长 的影响
Fig．3 The effects of different concentrations of
6-BA and NAA on the cell growth
of Azadirachta indica
不同接种量下印楝悬浮细胞的生长速率如图 2
所示。在接种量为 6O g／L时，印楝细胞的生长速率
大于其他接种量 ，可考虑采用 6O g／L作为印楝细胞
悬浮培养生长的最适接种量。
2．2激素对 印楝 细胞生长的影 响
在添加 了 6一BA 0～l mg／L和 NAA 0～ l mg／
L不同浓度组合的 MS基本培养基中，以 6O g／L的
接种量接人印楝细胞 ，光 照培养 12 d后收集 ，干燥
称重。当培养基中不含 6一BA或 6一BA浓度一定时，
随着 NAA浓度 的增 大，收获的细胞干重的变化趋
势如 图 3所示 。
当培养基 中不含 6-BA 或 6-BA与 NAA的浓
度均小于或等 于 0．4 mg／L时 ，印楝细胞褐 化严重 ，
颗粒不均，长势略快者则粘度大 ，不易抽滤；当 6一BA
与 NAA浓度 均大于 0．4 mg／L时 ，印楝 细胞颜色浅
黄或浅绿 ，颗 粒细 小均匀 ，抽 滤容易 。由图 3可以看
出，当 6一BA浓度一定时，随着 NAA浓度的增大，收
获的细胞干重增加 ；当 NAA 浓度大于 0．8 mg／L
时，收获的细胞干重开始下降；而当 6一BA与 NAA
浓度均为 0．8 mg／L时，收获的细胞干重达到本实
验条件下的最大值 ，可考虑选用此种浓度组合进行
印楝细胞的悬浮培 养 ，以获得理想 的细胞生 长速度 。
2．3不同碳源对印楝细胞生长的影响
在分别添加了 15、30、45 g／L的蔗糖或葡萄糖，
且 6一BA与 NAA 浓度 均 为 0．8 mg／L的 MS基本培
养基中，以 6O g／L的接种量接人印楝悬浮细胞，光照
培养，12 d后收集，干燥称重。培养基中添加的蔗糖
或葡萄糖 的浓度 与收获 的细胞干重 的关 系如 图 4所
示。由图 4可以看出，添加浓度相同时，以蔗糖作为
碳源的培养基中收获的细胞干重均大于以葡萄糖作
为碳源的培养基 ，且蔗糖浓度为 30 g／L的培养基中
收获的细胞干重达到本实验条件下的最大值。由此
可知，蔗糖比葡萄糖更适合作为印楝细胞悬浮培养生
长的碳源 ，且 以 30 L为最适 添加浓度 。这一结果
与 Wewetzer(1998)在研究不 同碳源对 印楝愈 伤组织
中印楝素生成的影响时所得到的结论一致。
有文献(Panda等 ，1992)表明，培养基中蔗糖浓
度的增 大可能会 导致 细 胞渗 透压 休克 (Osmotic
shock)或影响生物合成途径 ，从而抑制细胞的生长，
促进次生代谢物的积累。在本实验中，蔗糖浓度大
于 30 g／L时 ，随着 蔗糖 浓度 的增 大 ，细胞 的生长下
降，蔗糖浓度对印楝细胞生长的影响是否也具有文
献所 述机制 ，且是 否会 促进 印楝 细胞 中次 生代谢产
物 的积 累，还需要进 一步的研究 。
2．4 pH值对细胞 生长的影响
以 MS为基本培养基，添加 6一BA 0．8 mg／L、
NAA 0．8 mg／L、蔗糖 30 g／L，并分别调节培养液的
初始 pH 值 为 4．5、5．0、5．5、5．8、6．0、6．5，以 60 g／
L的接种量接人印楝细胞，光照培养 12 d后收集 ，
干燥称重。培养液的起始 pH值对印楝悬浮细胞生
长的影响如图 5所示。在 pH 值位于 4．5～5．8之
间时 ，随着 pH 值 的增 加 ，收 获 的细胞 干重增 大 ；至
O 8 6 4 2 O
O O O O O
一 一∽_【_【。u
-J(] ∞_【a乩≥ 一^ 犁 导
维普资讯 http://www.cqvip.com
552 广 西 植 物 23卷
pH值为 5．8时达到最 大值 ；在 pH 值位于 5．8～
6．5之间时 ，随着 pH 值 的增加 ，收获 的细胞 干重 下
降。pH值为 5．8时 ，印楝悬浮细胞 的生长速率可
达4．49 g／L·d。 罩荨
； 三
4 蔗糖和葡萄糖对 印楝细胞生长的影响
4 The effects of sucrose and glucose on the
cel J growth of Azadirackta indica
图 5 培养基不 同初 始 pH 对印楝细胞生长的影响
Fig．5 The effect of different initial pH values in the
medium on the cel growth of Azadirachta indica
印楝细胞 在 悬 浮 培养 过 程 中 ，培 养液 中的 pH
值随细胞生长而有规律 的变化 。图 6反 映了接种量
为 5O g／L、初 始 pH 值 为 5．8时印楝 细胞 生长与培
养液中 pH值变化的关系。接种量为 5O g／L时细
胞生长曲线 呈不太明显 的双峰 型 。从 悬浮培养开始
到第 8天 ，细胞生 长曲线位 于第 一峰 ，培养液 中 pH
值的变化与印楝细胞的生长同步 ；从第 8天到第 16
天，细胞生长曲线位于第二峰，培养液中的 pH值与
印楝细胞的生长呈负相关。
在植物细胞培养过程中，培养液中 pH 值的变
化通常是由于培养液中氮源的消耗产生的。当植物
细胞在以 NO 一为主要氮源的培养液中培养时，培
养液的 pH值随植物细胞 的生长而上升 (Treat和
图 6 印楝细胞生长过程 中培养基 pH 值的变化
Fig．6 The variation of medium pH values during
the cel l growth of Azadirachta indica
Engter，1989)。印楝细 胞悬 浮培养 采用 以 O 一为
主要氮源的 MS培养液 ，在培养过 程的前 8天 ，培养
液 中 pH 值与细胞生 长同步 ，与该 报道结论 一致 。
戚 树源等 (1997)在 采用两步法进行紫草细胞培
养时发现，细胞生长培养液的 pH值与紫草细胞生
长呈正相关 ，而紫草色素生产培养液的 pH 值却与
紫草细胞 色素增长 呈负 相关 ，这 一 结果 可能是 由于
紫 草色素生成过 程伴随有 酸性副产物生成 以及紫草
包素 的萘醌环显酸 性所致 。印楝 细胞 悬浮培养过程
中，印楝细胞生长与培养液 pH 值在第一峰范围内
具有紫草细胞生长与其培养液 pH值类似的正相关
性 ，而在第二 峰范 围内 ，具有紫草 色素生产与其培养
液 pH值类 似的负相关性 ，这是 否表 明 ，印楝悬 浮细
胞生长曲线 的第一 峰 反映 了 印楝细 胞 的增 长规 律 ，
而第二峰反映 了印楝 细胞 的代谢规律 ?实际情况如
何 ，还有待于进 一步的研究 。
综上 所 述 ，在 添 加 了 6一BA 0．8 mg／L、NAA
0．8 mg／L、蔗糖 3O g／I 且初始 pH值为 ．8的 MS
培养液 中 ，以 6O g／L的接种 量进行 印楝细胞 的悬 浮
培养 ，细胞生长 速 率 可达 4．49 g／I ·d。印楝 细胞
悬 浮培养快 速生长体 系 的建 立 ，为进 一步研究 印楝
次生代谢产物 的形 成 和调 控 奠定 了基础 ，具 有一定
的实际价 值和理论 意义 。
参考文献 ：
李晓东．赵善欢．1 995．印楝素对昆虫的毒理作用机制：J ．
华南 农业 大学 学报 ，17(1)：¨ 8—122．
徐汉 虹．2001．杀 虫植 物 与植物 性 杀 虫 剂 (第一 版 )[M ．北
京 ：中国农 业 出版社 ，175— 186．
Antje Wewetzer．1 998．Calus cutures of Azadirachta indi(“
(下转第 567页 Continue on page 567)
0 O O O O O O 0
【、 6 5 4 3 ^ l】 l O
5 O b O b O 0 O
3 3 2 2 O O
O O 0 O O 0
5 吐 0 l O
一 三 l，／ 兰 【【)l 图 一乏 三 ≥ 【【【】 乞 I(-_【一 一掣 H = II】I{1； ； 一
e
6 ●
n
O
6 ㈨
s
0 e
一； 岌
训培川
5
¨
O
维普资讯 http://www.cqvip.com
6期 陈月圆等：黄柏中总生物碱的提取及测定方法研究 567
表 4 加样 回收率实验结果
Table 4 Results of added recovery
2．2．5方法重现性考察 对 同一样 品分别按样 品处
理方法 和测定方法 测定 (表 5)。
3 小结
(1)以小檗碱为指标，对黄柏 3种提取溶剂、3
种分离纯化方法的提取物中总生物碱含量的工艺路
线的产品得率、含量及方法总提取率进行了综合评
价 ，总的来说，醇提取 、大孔树脂吸附方法明显优于
其他 方法。
(2)本测定方法相比以前经典方法操作更简便
迅速 ，方法准确度好 ，稳定性 、重现性好 。适用于黄
柏 中总生物碱工业 化生产 中的含量控制 。
表 5 重现性实验结果
Table 5 Results of reproduc ility tests
参考文 献 ：
中华人民共和国药典．2000．一部．化学工业出版社 ，548．
孑L少仪．2000．黄柏胶囊 中小檗碱的含量测定EJ]．中医药研
究 ，16(3)：48—49．
吕 琳 ，王永奇 ．1 990．TLC和 HPLC法测定 小檗碱 在黄柏
中的分布[J]．中草药，21(5)：1l—l3．
彭艳梅．1997．两种方法对黄柏各部位小檗碱含量测定[J]．
中草药 ，10(28)：599—6O1．
十H ·H ·H ·H ·H ·H ·H ·H ·H ·H ·H ·H ·H ·H ·H ·H ·H ·H ·H ·H ·H ·H ·H ·H ·H ·H ·H ·H ·H ·H ·H ·H ·H ·H ·H ·H ·H ·H ·H ·H ·H ‘卜{·H -H ‘H ’H 。H ’H ．}
(上接第 552页 Continue from page 552)
and their potential for the production of Azadirachtin[J]．
Phytoparasitica，26(1)：47— 52．
Chen F，Zhang Y．1 997． High cell density mixotrophic cul—
ture of Spirulina platensis on gulcose for phycocyanin pro—
duction using a fed—batch system [J]．Enzyme Microb
Technol，20：221— 224．
Manisha Sanyal，Asish Das，Mili Banerjee，et a1．1981．In vitro
hormone induced chemical and histological diferentiation in
stem callus of Neem (Azadirachta indica A．Juss)[刀．Indian
Journal of Experimental Biology，19：1 067—1 068．
Manisha Sanyal(Sarkar)，Anuradha Mukherji，P．C．Datta．
1 988．Glycine on in vitro biosynthesis of nimbin and si—
tosterol in tissues of Azadirachta indica EJ]．Current Sci—
ence，57(1)：40—41．
Murthy BNS．Praveen K．Saxena． 1998． Somatic embryo—
genesis and plant regeneration of neem(Azadirachta indica
A．Juss)EJ]．PlantCell Reports，17：469～475．
Panda AK，Mishira S，Bisaria VS． 1992．Alkaloid produc—
tion by plant cell suspension of Holarrhena antidysenteri—
fⅡ：I．Effect of major nutrients[J]．Biotechnlo Bioeng，
39：627— 630．
Qi SY(戚树源)，Lin LD(林立东)，Liang SZ(梁世中)，et a1．
1997．Cel suspension culture of Lithospermum erythrorhizon
in a 10一litre airlift loop bioreactor(10升气升环流式生物反应
器培养紫草细胞)EJ]．Journal of Tropical and Suptropical
Botany(热带亚热带植物学报)，5(2)：8O一84．
Qi SY(戚树源)，Ye QF(叶勤法)，Lin LD(林立东)．1998．
Plant regeneration of callus tissue derived from Azadirachta
indica(印楝愈伤组织培养和植株再生)l-J]．Chinese Journal
of Tropical Crops(热带作物学报)，19(1)：77—81．
Rangaswamy NS．Promila． 1972． Morphogenesis of the a—
duh embryo of Azadirachta indica A．Juss[J]． Z．
尸flanzenphysiol，67：377—379．
Saleem Ahmed． Michael Grainge． 1 986． Potential of the
Neem Tree(Azadirachta indica)l-J]．Economic Botany，
40(2)：201— 209．
Shirish R Yakkundi，R Thejavathi，B Ravindranath．et a1．
1 995．Variation of azadirachtin content during growth and
storage of Neem Azadirachta indica seeds E J]．J Agric
Food Chem ，43：2 517— 2 519．
Treat WJ．Engier CR．1989．Culture of photomi xotrophic soy—
bean and pineina modified fermentor using a novel impeller[J]．
Biotechnologyand Bioengineering，34：1 191— 1 202．
Virenda K ，Gautam，Kanan Nanda，shrish C．Gupta． 1993．
Development of shoots and roots in anther—derived callus of
Azadirachta indica A．Juss—a medicinal tree[J]．Plant
Cel1．Tissue and Organ Culture，34：13— 18．
Yu LJ(余 龙 江)，Cai YJ(蔡永 君 )，Lan WZ(兰 文智)．2002．
Research on the stability of taxol yield of Taxus chinensis
suspension cultures(红豆杉细胞培养生产紫杉醇产量稳定
性的探讨)l-J]．Guihaia(广西植物)，22(1)：85—88．
Zhao SH(赵 善欢 )，Zhang YG(张 业 光 )，Cai DZ(蔡 德 智)，
et a1． 1989． Preliminary report of neem tree introduction
and cultivation in China(印楝引种试验初报)l-J]．Journal
0f South China Agricultural Unirersity(华 南农 业 大学 学
报)，10(2)：34—39．
Zhong JJ．Yoshida T．1995． High-density cultivation of Pe—
rilla frutescens cell suspensions for anthocyanin produc—
tion：Effects of sucrose concentration and inoculum size~J]．
Enzyme M icrob Technol，17：1 073— 1 079．
维普资讯 http://www.cqvip.com