全 文 ：广 西 植 物 Guihaia 25(3)：233— 235 2005年 5月
在培养基中加入抗生素防止万年
茎段培养污染 的研究
周俊辉，杨妙贤，李春霞，宋苑芬
(仲恺农业技术学院园艺系．广东广州 510225)
摘 要：以玛丽安万年青茎段为试验材料，将浓度为 50 mg·L- 的青霉素、氯霉素、利福平、庆大霉素、先锋霉
素 6号、链霉素和卡拉霉素 7种抗生素分别经过过滤灭菌后加入到 MS基本培养基，从中筛选出防止污染效
果较好的两种抗生素，分别按 50、100、I50 mg·L0的浓度加入到 MS培养基中培养，以筛选出最适合浓度；然
后再筛选出利福平和氯霉素的最佳浓度组合。结果表明：7种抗生素中以利福平和氯霉素防止污染效果较
好，未污染率分别为68．42 和58．33 ，成活率分别为 65．79 和 52．78 ，利福平和氯霉素的浓度均为 I50
mg·L一 时防止污染的效果最佳；25 mg·L0利福平+50 mg·L 氯霉素和 50 mg·L0利福平+50 mg·L0
氯霉素组合，未污染率分别达到78．46 、85．I8 ，极显著高于50 mg·L 利福平单独处理的效果。
关键词：玛丽安万年青；抗生素；茎段培养；防止污染
中图分类号：Q943．1 文献标识码：A 文章编号：1000—3142(2005)03—0233—03
Studies on contamination control by adding
antibiotics into medium in stem culture of
Dieffen bachia am oena CV．Camilla
Z HOU J un-hui，YANG Miao-xian，LI Chun—xia，SONG Yuan—fen
(Horticultural Department．Zhongkai University of Agriculture and Technology．Guangzhou 510225．China)
Abstract：There was serious contamination in the stem culture of Dieffenbachia amoena CV．Camilla，belonging to
Araceae．Al of antibiotics tested was added into MS medium by using 0．2 m supor membrane acrodisc syringe filter
produced by Gelman Laboratory，respectively．First，ampicillin，chloramphenicol，rifampin，gentamycin，streptomycin，
kanamycin and cefradine，was t~ted with 50 mg·L- ，respectively．The inhibiting bacteria contamination efect of ri-
fampin and chloramphenicola，of which the uncontaminated rate was 68．42 and 58．32 respectively，and the survi—
ving rate was 65．79 and 52．78 respectively，was better than others．Second，chloramphenicol and rifampin was
tested with 50 mg·L l，100 mg·L- ，150 mg·Ll concentration。respectively。both two kinds of antibiotic with 150
mg·L—I concentration had the best effect．Third，the two antibiotics combined with different concentrations were
tested，25 mg·L- rifampin combined with 50 mg·L～chloramphenicola。and 50 mg·L一1 rifampin combined with 50
mg·L 1 chloramphenicola had the higher effect with 78．46 and 85．1 8％ uncontaminated rate。respectively。both
had very significant difference comparing with the contro1．
Key words：Dieffenbachia amoena CV．Camilla；antibiotic；stem culture；contamination control
在植物组织培养过程中，存在两种类型的污染，一
是通常讲的污染，即因外植体消毒不彻底、无菌操作和
培养过程中如培养基、接种工具、接种室消毒不严格或
操作不规范而导致的污染。另一类是内源菌污染。生
收稿日期：2004一Ol一08 修订日期：2004-05—18
基金项目：国家星火计划资助项目(2001EA780018)
作者简介：周俊辉(1963一)．男．江西临JI1人，博士，副教授．从事园艺植物的组织培养和栽培生理的教学和科研工作。
主罔
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234 广 西 植 物 25卷
长在高温多雨的热带、亚热带植物和多年生木本植物
容易表现内源细菌污染(周俊辉，1999，2003)。
对防止内源细菌污染的方法主要有：对母树喷布
杀菌剂或抗生素(Reuveni等，1990)，用抗生素对外植
体进行预培养(朱广廉，1996；傅婉华等，1991)，改进
灭菌方法(傅婉华等，199i)，还有多次消毒(灭菌)、使
用混合的消毒液、酸化培养基和在培养基中加入其他
抑菌剂等方法(周俊辉等，2003)。
在培养基中加入抗生素能较有效地抑制内生细
菌污染，但效果不一(周俊辉等，2003)。天南星科黛
粉叶属的玛丽安万年青在茎段培养中特别容易污染，
我们以其作为试材，通过在培养基加入不同种类的抗
生素、不同浓度及不同浓度的组合处理，进行筛选研
究，以期找到防止外植体内源细菌污染的有效方法。
1 材料和方法
1．1材料
天南星科 (Araceae)黛粉 叶属玛丽 安万年青
(Dieffenbachia(21qO~l(．1 CV．Camila)，取自于仲恺农
业技术学院花圃。
1．2方法
用手术刀将万年青的叶片剥去，露出腋芽，用自
来水冲洗干净后用肥皂水冲洗 1次，再用自来水浸
泡2～3 h后冲洗干净，沥干。
1．3培养基的制备
以MS培养基为基本培养基，不加任何植物生
长调节剂，蔗糖 2 9／6，琼脂 6 9／5，pH5．8。
1．4消毒灭菌
1．4．1外植体常规 消毒 用 75 的酒精浸泡 1
rain，无菌水冲洗 1～2次，再用 l g／L的 HgC12浸
泡 15 rain，无菌水冲洗 3～5次。
1．4．2抗生素减压过滤灭菌 由于抗生素在高温高
压下易分解，应采取减压过滤灭菌。将配制浓度为
50 mg·L- 的氨苄青霉素(ampicilin)、氯霉素(chlor—
amphenico1)、利福平(rifampin)、庆大霉素(gentamy—
tin)、链霉素(streptomycin)、先锋霉素6号(cefradine)
和卡拉霉素(kanamycin)7种抗生素在超净工作台用
已灭菌的注射器和一次性滤器进行过滤灭菌，然后加
入尚未凝固的培养基 中。一次性滤器采用 Gelman
Laboratory生产，孑L径为 0．2 m，滤器不能加热。
1．4．3抗生素浓度的筛选 选出第一阶段培养中表
现最好的两种抗生素利福平和氯霉素，设定不同的浓
度0、50、i00、150 mg·L ，进行最佳浓度的筛选。
1．4．4不同利福平和氯霉素浓度组合的筛选 以50
mg·L 利福平作对照，设计 25 mg·L 利福平+
25 mg·L 氯霉素、25 mg·L 利福平+50 mg·I
氯霉素、50 mg·L 利福平+25 mg·L。氯霉素和
50 mg·L 利福平+50 mg·L 氯霉素 4种组合，
进行最佳浓度组合筛选。
1．5培养条件与统计
培养室温度 25～28℃，光照度 2 000～4 000
lx，每天光照12～14 h，20 d后观察统计。数据采用
SPSS 10．0软件分析处理。
2 结果与分析
2．1不同抗生素种类对万年青茎段培养防止污染的
影响
结果表明，氯霉素和利福平处理材料后的未污
染率和成活率都比较高，与 CK、庆大霉素、卡拉霉
素、链霉素、青霉素、先锋霉素等处理比较均达到了
极显著水平。其中，利福平 的未污染率从对照的
l9．45 上升到 68．42 ，成活率从 l6．67 上升到
65．79 ，说明利福平和氯霉素均能较有效地抑制内
源细菌的污染，而其他抗生素的效果较差，特别是庆
大霉素的处理与对照相似(表 1)。
2．2不同浓度的氯霉素、利福平对万年青茎段培养
防止污染的效果
从表2可以看出，随氯霉素(缩写为Ch1．)和利福
平(缩写为 Rif．)浓度的增加，未污染率和成活率均有
增加的趋势，当利福平的浓度为 150 mg·I 时的未
污染率和成活率都达到 76．92 ，而氯霉素浓度为
150 mg·L‘时对防止污染的效果达 64．10 。
2．3不同浓度的氯霉素、利福平组合对万年青茎段
培养污染防止的效果
从表 3看出，当氯霉素浓度达到 50 mg·L 时，
不论利福平浓度是 25 mg·L 还是 50 mg·L ，防止
污染的效果与成活情况均极显著地高于利福平单独
处理；而当氯霉素浓度为25 mg·L 时，不管利福平
浓度是 25 mg·L- 还是 50 mg·L- ，防止污染的效果
与成活情况都与对照没有显著性差异。因此，加入培
养基的氯霉素浓度不能低于50 mg·I 。
3 讨论
内源细菌污染在植物组织培养中较难解决，无
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3期 周俊辉等：在培养基中加入抗生素防止万年青茎段培养污染的研究 235
论用何种表面消毒方法都无法彻底消除外植体的内
生细菌，在培养基加入抗生素是防止内源细菌污染
的有效措施之一。
我们的实验结果表明，在 7种抗生素中以利福
平和氯霉素防止污染效果较好，未污染率分别为
68．42 和 58．33 ，成活率分别为 65．79 和
52．78 ；利福平和氯霉素的浓度均为 150 mg·I
时污染防止的效果最佳。
表 I 不同抗生素种类对万年青茎段培养防止污染的影响(浓度为 50 mg·L。)
Table 1 Contamination control effect of different antibiotic in
medium on stem culture of Dieffenbachia amoena CV．Camilla
注： ’方差分析中小写字母表示0．O5(显著)水平；大写字母表示0．01(极显著)水平．下同 In systematic analysis，little letters indicate prom—
nent difference among different treatments．while the capital letters mean very significant difference．The same is as below．
表 2 不同浓度的氯霉素、利福平对万年青茎段培养防止污染的效果
Table 2 Contamination control effect of ch1．and rifampin with different concentration
in medium on stem culture of Dieffenbachia amoena CV．Camilla
Rif．50(CK)
RIfJ 25+Ch1．25
RIfJ 25+Ch1．50
R|f_5O+Ch1．25
R-fJ 5O+ChI．5O
66．67
66．67
75．00
63．64
81．25
使用哪种抗生素为好、使用浓度多少为适宜?
可能因植物的种类不同、植物所含内生菌种类的不
同以及抗生素使用的种类和浓度不同，导致抗生素
使用的效果变化很大(周俊辉等，2003)。如500 mg
· L。头孢噻肟(cefoxitin)(Barrett等，1994)、10 mg
· I 。阿霉素(amycacin)(Bistrichanov等，1997)、30
nag·L 利福平(Leven等，1996)、5O mg·L’卡拉
霉素(Blackman等，1996)、先锋霉素(韩美丽等，
1999)、链霉素(翟建中，1999)、庆大霉素(傅婉华等，
1991)、林可霉素(傅婉华等，1991)，分别有效地抑制
各培养中的细菌污染。
我们发现，25 mg·L。利福平+5O mg·L 氯
霉素和5O mg·L 利福平+5O nag·L 氯霉素组
合，防止污染的效果比利福平单独处理有很大的提
高，与翟建中(1999)、Reed等(1998)的结果相似。
(下转第268页 Continue on page 268)
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268 广 西 植 物 25卷
蒜多糖相似、中国石蒜和换锦花多糖相似度更大。
4．4多糖的组成
也就是多糖一级结构对其生物活性有一定的影
响，而多糖的高级结构更有赖于一级结构的排步(黄
芳，1998)。与基因的遗传密码类似，可能存在多糖
密码，即所谓的糖码，生物多糖可能按照一定的规则
排列组合并相互识别。石蒜属中不同植物的多糖结
构组成不同，会导致不同的生物活性和药用价值(廖
代伟等，1997)。另外，多糖结构组成的差异可为探
讨石蒜属种间亲缘关系提供实验证据。
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表明在培养基中使用两种或两种以上抗生素，可以
防止细菌的抗药性，有时效果比单独使用更好。
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