全 文 ：广 西 植 物 Guihaia 24(2)：134— 138 2004年 3月
柑桔遗传转化技术的研究进展
黄 涛，李耿光，张兰英，董高峰
(中国科学院华南植物研究所 ，广东广州 510650)
摘 要 ：柑桔是当今世界种植面积最大的果树。遗传转化技术的发展为柑桔育种提供 了一条全新的途径。
该文就柑桔遗传转化的研究进展，包括外源 DNA的直接转化与农杆菌介导的转化 ，作一简要的综述，并对当
前研究 中存在的问题及今后的研究方向作了进一步的探讨。
关键词：柑桔；遗传转化 ；农杆菌
中图分类号：Q943 文献标识码 ：A 文章编号：1000—3142(2004)02—0134—05
Advances in Citrus genetic transformation
HUANG Tao，LI Geng—guang，ZHANG Lan—ying，DONG Gao—feng
(South China Institute of Botany。Chinese Academy of Science，Guangzhou 5 10650，China)
Abstract：Citrus is the most widely grown fruit crop worldwide．A new method was provided for citrus breed—
ing with the development of genetic transformation technique．The advance in citrus genetic transformation，
including direct transformation of exogenous DNA and Agrobacterium—mediated transformation，was reviewed
briefly．The present issue and future development of citrus genetic transformation research were also dis—
cussed．
Key words~Citrus；genetic transformation；Agrobacterium
柑桔 (Citrus L．)是世界范 围内种植最广泛的
果树，我国也有大面积种植。在二十世纪，为了培育
柑桔新品种，提高柑桔的产量和品质、增强其抗病
性、抗逆性及解决生产中的其它问题，有关柑桔生物
技术的研究主要涉及到组织培养、茎尖微芽嫁接脱
毒、原生质体融合与细胞杂交、离体抗性育种和遗传
转化等方面。其中基因工程提供了从分子水平直接
进行遗传操作，定向改造植物性状的手段。通过向
柑桔细胞转入有益的外源 目的基 因可以培育 出抗
病 、抗虫 、抗逆及其它具有特殊性状的转基 因柑桔植
株。同其它作物相比，柑桔的遗传转化研究起步较
晚。本文就近年来柑桔遗传转化技术的研究进展作
一 简要综述。
1 外源 DNA 的直接转化
Kobayashi和 Uehimiya(1989)首次用聚乙二醇
法(PEG)将外源标记基因 gus转入甜橙(C．sinensis
(L．)0sb．)原生质体，获得转基因的胚性愈伤，但是
没有获得 转化植株 。Vardi等(1990)同样用 PEG
法将外源标记基因转入粗柠檬(C．jambhiri Lush．)
原生质体中，得到 9个稳定转化的胚性愈伤系，其中
2个胚性愈伤系再生出转化植株 。王峰等(1998)通
过 PEG法和脂质体介导法将不同调控序列下的
GUS基因导入柑桔原生质体中，但仅仅研究了
GUS基因在柑桔原生质体 中的瞬间表达情况。
Hidaka等(1993)通过电穿孔法将外源标记基因
收稿 日期 ：2003-02-25 修订 日期 ：2003-06—24
基金项目：国家自然科学基金(39870539)；广东省自然科学基金(980478)；广东省百项创新工程(99B05902X)。
作者简介：黄涛(1972一)，男，河南正阳县人，博士，从事细胞工程研究。E-mail：Huangtao@scib．ac．an
维普资讯 http://www.cqvip.com
2期 黄 涛等：柑桔遗传转化技术的研究进展 135
gus转入柑橘(C．reticulata Blan CO CV Ohta)愈伤
组织中，但没有再生出完整植株。Yao等(1996)用
基因枪法将外源标记基因gus转入柑桔品种 tange一
1o(C．reticulata Blanco×C．paradisi Macf．)的悬
浮细胞，并用高渗溶液预处理细胞，可以显著提高转
化效率。
在以上几种转化方法 中，PEG 法价廉 、实验结
果稳定、植板率较高，但有些植物对 PEG处理相当
敏感。电穿孔法操作简便，DNA导入效率较高，特
别适用于瞬间表达的研究，但易造成原生质体损伤，
且仪器也较昂贵。基 因枪 可对整株植 物进行转化 ，
但转化率较低，且由于多拷贝现象导致转基因的沉
默及后代遗传 规律 的紊 乱。在柑桔 中，通 过 PEG
法 、基因枪法和电穿孔法进行的外源基因转化 ，一般
多采用单细胞受体系统。该受体系统的优点是操作
简便、DNA导入效率高、获得的转化体嵌合现象少，
易于筛选 ，但是柑桔类果树 中很多品种 的原生质体
培养周期长及再生困难 ，且易发生体 细胞变异等缺
点，因此较难得到能够稳定表达目的基因的转化植
株。
2 农杆菌介导的外源 DNA转化
2．1愈伤组织的转化
Hidaka等(1990)用农杆菌介导法将标记基因
转入甜橙愈伤组织中，并得到 1株转化植株，但转化
率很低，只有 0．07 。由于许多柑桔品种很难诱导
愈伤组织 分化及再 生植 株 (Gmitter和 Moore，
1986)，因此通过转化愈伤组织途径来获得转基因植
株在柑桔中受到很大限制 。
2．2实生苗离体组织的转化
我国研究者高峰等(1990)用根瘤农杆菌感染碰
柑、红桔的子叶、叶片、胚轴，经检测证 明 Ti质粒 T—
DNA上的章鱼碱合成酶基因已转入柑桔中，用带
GUS基因的农杆菌双元载体系统转化柑桔营养器
官，在获得的抗性愈伤中检测到较强的GuS活性，
但没有得到转化植株。Moore等(1992)用枳橙(C．
sinensis(L．)Osb．×P．tri厂0liata Raf．)与来檬 (C．
aurantifolia(Christm)Swingle)实生苗茎段与农杆
菌共感染，经过 PCR和 Sourthern杂交证实外源标
记基因转入柑桔中，但转化率较低，只有 5 。Pena
等(1995a，b)用枳橙实生苗茎段为材料，通过延长选
择时间减少了假的转化体 。感染的枳橙和甜橙茎段
在筛选培养基上培养时，先放在黑暗下处理8周，再
转移到光下，则能显著提高转化率(Pena等，1995a，
b)。但是在枳 (Kaneyoshi等 ，1994)与华盛顿甜橙
(Bond和 Roose，1998)的上胚轴转化中，不需经过
黑暗处理也能获得较高的转化率，这说明对于不同
的柑桔品种需要不同的培养条件。进一步的研究表
明，农杆菌在感染来檬茎段时 ，如果与马铃薯悬浮细
胞系共培养，则能显著提高转化率及每个外植体上
的出芽数，这是因为悬浮细胞系可以提供激活农杆
菌 Vir基因的乙酰丁香酮及其它酚类物质，同时也
可以降低农杆菌引起的外植体的伤害(Pena等，
1997)，通过这种培养方式 ，Pena等(1998)成功地将
GA-C20基因转入甜橙和酸橙中。
不同的农杆菌株系对柑桔的转化效率也不同，
Kaneyoshi等(1994)用枳的上胚轴为材料，用两种
农杆菌株 系进 行感染，转化率 在 1O 以上，且
CaMV 35s启动子比 rol C启动子更能增强 GUS基
因的表达。Bond和 Roose用三种农杆菌株系感染
不同苗龄的甜橙上胚轴切段，发现 C58cl株系的转
化效率为 45 ，EHA101-5的转化率为 29 ，而
LBA4404不能转化甜橙。同时，21 d苗龄的上胚轴
切段转化率要高于 35 d与 36 d苗龄的上胚轴切段
(Bond和 Roose，1998)，这说明不同农杆菌株系对
细胞的侵染能力不同，且苗龄也影响受体细胞的敏
感性。Cervera等(1998)详细研究了共培养时间、
外植体预培养、共培养 中加入乙酰 丁香酮及马铃薯
悬浮细胞系、共培养基中加入高浓度生长素、筛选培
养时的黑暗处理、不同卡那霉素筛选压等因素对农
杆菌转化枳橙的影响，结果发现在富含生长素的共
培养基上共培养 3 d可以提高转化率。而筛选培养
时的4 d黑暗处理可以进一步提高转化率和减少假
的转化体，最终转化率可以达到 41．3 。但是与
Pena等(1997)不同的是，外植体 的预培养时加入马
铃薯悬浮细胞系并不能提高转化率。我们在研究红
江橙和沙田柚 的转化 中发现 ，红江橙在预培养 1 d
后再共培养 2 d才能得到较高的转化率，而沙田柚
需要 2 d预培养和 1 d共培养才能得到较高的转化
率。在预培养天数低于最适天数时，适当延长共培
养天数可以提高转化率，而在最适或较长预培养天
数的条件下，长时间的共培养导致农杆菌的过度生
长而使最终的转化率下降(待发表)。
目前，柑桔抗病基因的转化也通常用实生苗茎
段或上胚轴为基因转化受体。在农杆菌感染过程
维普资讯 http://www.cqvip.com
136 广 西 植 物 24卷
中，受伤害的细胞才对农杆菌的浸染敏感(Shimoda
等，1990；Bidney等，1992)。Gutierrez—E等(1997)
首次将柑桔衰退病毒外壳蛋白(CTV CP)基因转入
酸橙中，但只从 7 000个外植体得到 9株完全 GUS
活性的植株，在农杆菌感染前用基因枪轰击酸橙实
生苗茎段来造成细胞伤害却不能提高基因转化效
率。Dominguez等 (2000)通 过 农 杆 菌 介 导 法 将
CTV CP基因转入来檬中，在筛选培养基中加入高
浓度生长素可以显著提高转化效率，且进一步发现
CTV CP基因的表达与基因拷贝数或基因整合方式
无关。韩美丽等(2000)通过延迟选择也显著提高农
杆菌介导的CTV CP基因转化枳壳的效率。另外，
通过农杆菌介导法，李耿光等(1999)将几丁质酶基
因转入枳橙上胚轴切段 ，得到了表达几丁质酶基 因
的植株。陈善春等(1997)则将柞蚕抗菌肽 D基因
转入新会橙和沙田柚 中。
2．3成龄组织的转化
在柑桔基因转化的研究中，大多采用上胚轴 、子
叶、试管苗叶片、茎段等未度过童期的组织作为基因
转化受体，而由此得到的转基因植株具有童期长的
缺点，且转基因植株的园艺与商品性状的评价往往
需要很长时间。而由成龄组织转化得到的转基因植
株则可以避免一个相当长的童期，且能保持遗传上
的稳定性，但成 年树离体组织 的分化十分困难
(Durzan，1990)。Cervera等(1998)首次报道用甜
橙成年树新抽出的枝条为基因转化受体，成功地将
外源标记基因转入甜橙，但同时实生苗茎段相比，成
年树枝条的转化率降低了 7O ，这说明成龄植物组
织对农杆菌浸染 的敏感性 低于幼嫩组 织。李卫等
(1997)根据沙田柚一年四季不断抽芽的特性，用农
杆菌感染附体的腋芽，再离体扩繁鉴定的方法，成功
地将GUS基因转入沙田柚中。这种方法既不需要
无菌操作，又免去了去除农杆菌的繁琐过程。该方
法不需经过细胞或原生质体再生途径，故可以克服
柑桔漫长的童期，且母体上腋芽生长远比外殖体再
生途径容易，所以转化效率高，这种简便、快速、高效
的基因转化方法为柑桔的遗传转化提供了一条新的
途径。有关其它柑桔品种成龄组织的转化尚未见报
道，可以相信，随着成龄组织的分化与再生体系的建
立与完善，必将促进转基因柑桔的生产实用化。
3 存在的问题和展望
(1)基因转化效率低，有待于进一步优化基因转
化方法和体系。报告基因是用于检测组装的嵌合基
因在导入细胞后是否具有功能的一种指示基 因，其
测定方法应简单灵敏。在柑桔的遗传转化中，通常
用 GUS基因为报告基 因，对于所有 的假定转基因
植株都必需进行 GUS活性检测 ，这是一个非常繁
琐的过程，且 GUS活性检测对于被测试材料具有
破坏性 。因此寻找一个简便易行的选择方法对于提
高基因转化效率是很必要的。最近，Ghorbel等
(1999)首次将绿色荧光蛋白基因(gfp)作为报告基
因转入来檬、酸橙和枳橙中。GFP的基因产物绿色
荧光蛋白在蓝光下产生绿色荧光，因而可以快速而
简便地区分转化体和非转化体。转 gfp基因的柑桔
植株也可以在不含卡那霉素的筛选培养基上获得，
这为获得不具备抗生素或除草剂抗性的转基因植株
提供了一条途径，而无抗生素和除草剂抗性对于转
基因植物的安全性和商品化具有重要意义，这方面
的研究正在进行中。
(2)在过去的转化中，所转标记基因多，而 目的
基因少，因而有待于进一步开发出新的抗病、抗虫及
其它具有重要应用价值的目的基因。在柑桔抗病育
种中，枳壳是对 CTV病毒抗性很强的品种(Garn—
sey等，1987；Bar-Joseph等 ，1989；Yoshida，1996)，
通过分子标记定位的方法，发现其抗性是由基因位
点 Ctr-R控制(Gmitter等，l996；Mestre等，1997)，
进一步的研究发现枳壳对 CTV的抗性至少由另外
一 个基因 Ctm参与调控(Mestre等，1997)。Fang
和 Roose(1999)在柚中定位一个单位点主效基因
Ctv2，该基因控制着对 CTV的抗性。目前，这些已
定位基因的克隆及其抗病机制正在进一步的研究
中。
(3)提高基因转化效率的研究多，而有关所转基
因的整合及表达规律的研究少。Cervera等(2000)
首次对 7O株 4～5年株龄的转 UidA和 npt I基因
柑桔植株的整合和表达研究表明：①基因的拷贝数
与 GUS活性之间存在显著的负相关；②T—DNA的
重排并不影响基因的表达水平；③证实了在 自然环
境条件下转化基因在所有转化体中具有整合和表达
的稳定性。今后应进一步加强研究外源基因在植物
群体中的遗传规律及行为。
(4)过去的柑桔转化中所用的受体材料多是未
度过童期的幼嫩组织 ，而成龄组织的转化很少，可能
的原因是成龄组织的分化与再生较为困难。目前，
本实验室正在进行农杆菌介导的 CTV CP基因转
维普资讯 http://www.cqvip.com
2期 黄 涛等：柑桔遗传转化技术的研究进展 137
化红江橙、沙田柚成龄组织的研究，今后还有待于加
强这方面的工作，以促进转基因柑桔的生产实用化
和产业化进程。
(5)在农杆菌介导的基因转化中，有关细菌与植
物细胞相互作用的分子机制的研究主要在细菌的附
着，Ti质粒上致瘤基因的表达、加工、转移与整合等
方面进行 了大量 的研 究 (Hooykaas和 Beijersber-
gen，1994；Lessl和 Lanka，1994；Gelvin，2000)。但
是，有关植物细胞本身在整个基因转化过程中的行
为与作用却很少涉及。目前的研究对植物细胞本身
编码的蛋白质和酶是否参与 T—DNA的转移与整
合，植物细胞对农杆菌的感受态是如何控制的，在有
些转化体系中报告基因的瞬间表达效率高而最终的
转化效率却很低等问题很少涉及。故目前基因转化
的操作中很大一部分还停留在经验的水平上。相信
随着研究的进一步深入，会在这些方 面取得新的进
展 。
参考文献：
王 峰，朱 祯，李向辉．1998．不同调控序列控制下的gus
基因在柑桔原生质体 中的瞬间表达[J]．福建农业学报，
13(2)：1—5．
李耿光，Chen R，贺 红 ，等．1999．农杆菌介导几丁质酶
基因转化的柑桔植株[J]．中国学术期刊文摘(快报)，7：
940——942．
李 卫，陈 亮，蔡得田，等．1997．柑桔基因转化新方法
的研究[J]．植物学报，39(8)：782—784．
陈善春，张进仁，黄自然，等．1997．根癌农杆菌介导柞蚕
抗菌肽 D基因转化柑桔 的研究[J]．中国农业科学，3O
(3)：7一 l3．
高 峰，华学军。范云六，等．1990．用根癌农杆菌离体转
化离体柑桔[J]．中国柑桔 ，19(4)：3—4．
Bar-Joseph M ，Marcus R，Lee RG． 1989．The continuous
chalenge of citrus tristeza virus control[J]．Annu Rev
Phytopathol，27：29l一3l6．
Bidney D，Scelonge C，Martich J，et a1．1992．Microprojec—
tile bombardment of plant tissues increases transformation
frequency by Agrobacterium tumefaciens[J]．Plant Mol
Biol，18：301— 313．
Bond JE，Roose IVIL． 1998． Agrobacterium-mediated transfor-
mation of the commercially important citrus cuhivar Washing—
ton navel orange[J]．Plant Cell Rep，18：229—234．
Cervera M ，Pina JA，Juarez J，et a1．1998．Agrobacterium-me—
diated transformation of citrange：factors Mf~ting transforma—
tion and regeneration[J,]．Plant Cell Rep，18：271—278．
Cervera M ，Juarez J，Navarro A，et a1．1998．Genetic trans—
formation and regeneraton of mature tissues of woody fruit
plants by passing the juvenile stage[J]．Transgenic Re—
search，7：5l一 59．
Cervera M ，Pina JA，Juarez J，eta1．2000．A broad explora—
tion of a transgenic population of citrus：stability of gene
expression and phenotype[,J]．TheorAppl Genet，100(5)：
67O一 677．
Dominguez A，Guerri J，Cambra M ，et a1．2000．Efficient
production of transgenic citrus plant expressing the coat
protein gene of citrus tristeza virus[J]．Plant Cell Rep，
19：427— 433．
Durzan D．1990．Adult vs．Juvenile explants：directed totip—
otency[,A,]．In：Rodriguez R，Sanchez-Tames R，Durzan
DJ(eds)．Plant Aging Basic and Applied Approaches[,C,]．
NAT0 ASI Series．Series A：Life Sciences。186：19—25．
Fang DQ，Roose M L．1999．A novel gene confering citrus
tristeza virus resistance in Citrus Maxima(Burm．)Merrill
[J]．Hortsci，34(2)：334—335．
Gao F， Hua Ⅺ 。Gan YL． 1991．Agrobacterium—mediated
gene transfer in Citrus reticulate Blanco[A]．In：Huang
BY，Yang Q．Proc of Inter Citrus Sym Inter Aca Pub[,C-]．
2l9— 220．
Gamsey SM，Barrett HC，Hutchison DJ．1987．Identification of
citrus tfisteza virus resistan ce in citrus relatives and its poten：
tial application[,J,]．Phytophylactica，19：187—19 1．
Gelvin SB．2000．Agrobacterium and plant genes involved in
T—DNA transfer and intergration．Annul Rev．Plant Physi—
ol[J]．Plant Mol Biol，51：223—256．
Ghorbel R，Juarez J，Navarro L，eta1．1999．Green fluores—
cent protein as a screenable marker to increase the eficien—
cy of generating transgenic woody fruit plants[J]．Theor
Appl Genet，99：350— 358．
Gmitter GG，Xiao SY，Huang S，et a1． 1996．A localized
linkage map of the citrus tristeza virus—resistance gene re—
gion[J]．Theor Appl Genet，92：688—695．
Gmiter FG，Moore GA．1 9 86．Plant regeneration from un-
developed ovules and embryogenic calli of citrus：Embryo
production，germination and plant survival[,J,]．Plant Cell，
nssOrg Cult，6：139— 147．
Gutierrez-E MA，Luth D，Moore GA．1997．Factors affect—
ing agrobacterium-mediated transformation in citrus and
production of sour orange(Citrus aurantium L．)plants ex—
pressing the coat protein gene of citrus tristeza virus[J]．
Plant Cell Rep，16：745— 753．
Han ML(韩美丽)，Li GG(李耿光)，He H(贺 红)，et a1．
2000．Preliminary study on establishment of transforma—
tion system in Poncirus trifoliate Raf．(农杆菌介导的枳壳
维普资讯 http://www.cqvip.com
138 广 西 植 物 24卷
转化系统建立研究初报)[J]．Guihaia(广西植物)，2o(1)：
47— 51．
Hooykaas PJJ，Beijersbergen AGM． 1994．The virulence
system of Agrobacterium trmefaciens[J]．Annu Rev PAy—
topathol。32：157—179．
Hidaka T，Omura M．1993．Transformation of citrus proto—
plasts by electroporation[J]．J Ja pan Soc Hort Sci，62：
371— 376．
Hidaka T，Omlra M，Ugaki M ，et a1．1990．Agrobacterium-
mediated transformation and regeneration of Citrus spp．from
suspension cells[J]．Japan J Breed，4O：199-207．
Kaneyoshi J，Kobayashi S，Nakamura Y，et a1． 1994．A
simple and efficient gene transfer system of trifoliate orange
(Poncirus trifoliate Raf．)[J]．Plant Cell Rep，13：541—
545．
Kobayashi S，Uchimiya H．1989．ExpressiGn and integration
of a foreign gene in orange(Citrus sinensis Osb．)proto—
plasts by direct DNA transfer[J]．Jpn J Genet，64：91—
97．
Lessl M ，Lanka E．1994．Common mechanisms in bacterial
conjugation and Ti-mediated T-DNA transfer to plant cells
[J]．Cell，77：321—324．
Mestre PF，Asins MJ，Pina JA，et a1． 1997a． Molecular
markers flanking a citrus tristeza virus resistance gene from
Poncirustrifoliate(L．)Raf．[J]．Theor Appl Genet，94：
458— 464．
Mestre PF，Asins MJ，Carbonel EA，et a1． 1997b． New
gene(s)involved in the resistance of Poncirus trifoliate
(L．)Raf．To citrus trlsteza virus[J]．Theor Appl Genet，
95：691— 695．
Moore GA，Jacono CC，Neidigh JL，et a1．1992．Agrobacte—
rium-mediated transformation of citrus stem segments and
regeneration of transgenic plants[J]．Plant Cell Rep，11：
238— 243．
Pena L，Cervera M ，Juarez J，et a1．1995a．High efficiency
agrobacterium-mediated transformation and regeneration of
citrus[J]．Plant Sci，104：183—191．
Pena L，Cervera M ，Juarez J，et a1．1995b．Agrobacterium-
mediated transformation of sweet orange and regeneration
of transgenic plants[J]．Plant Cell Rep，14：616—619．
Pena L，Cervera M ，Juarez J，et a1．1997．Genetic transfor—
mation of lime(Citrus aurantifolia Swing．)：factors af—
fecting transformation and regeneration[J]．Plant Cell
Rep，16：731—737．
Pena L，Cervera M，Juarez J， a1．1998．Genetic transfor—
mation as a tool for the introduction of agronomicaly im—
portant genes into citrus plants[J]．Acta Horticult，463：
61— 68．
Shimoda N。Toyoda-Yamamoto A，Nagamine J，eta1．1990．
Control of expression of Agrobacterium vir genes by syner—
gistic action of phenolic signal molecules and monosaccha—
rides[J]．Pr0c Natl Acad Sci USA，87：6 684—6 688．
Vardi A。Bleichman S，Aviv D．1 9 90．Genetic transforma~
tion of citrus protoplasts and trgeneration of transgenic
plants[J]．Plant Sci，69：199-206．
Yao JL，Wu JH，Gleave AP，eta1．1996．Transformation of
citrus embryogenic cells using particle bombardment and
production of transgenic embryos[J]．Plant Sci，113：175
— 183．
Yoshida Y．1996．Graft compatibility of citrus with plants in
the Aurantioideae and their susceptibility to cityrus tristeza
virus[J]．Plant Disease，80：414—417．
(上接第 127页 Continue from page 127)
娄远来，邓渊钰，沈纪冬，等．2002．我国空心莲子草的
研究现状[J]．江苏农业科学，(4)：46—48．
茹科夫斯基．王道济译．1953．普通植物学(上册)[M]．
北京：高等教育出版社，181—188．
谭万忠．1994．空心莲子草在我国的水平和垂直分布[J]．
杂草学报 ，8(2)：3O一33．
王 韧，王 远．1988．我国南方水花生发生危害及生物
防治调查口]．杂草学报，2(1)：384．
姚东瑞．1997．农达对水花生的防效试验报告[J]．杂草
科学 ，(4)：27—28．
张 彪．2001．两种生境条件下空心莲子草 叶片解剖结
构比较[J]．杂草科学，(4)：6—7．
张格成．1993．空心莲子草主要生物学特性研究[J]．杂
草科学 ，(2)：10—12．
张 泓．1988．药用植物牛膝根 中异常次生结构的发育
解剖学研究[J]．西北植物学报，(2)：85-89．
K．伊稍．李正理译．1982．种子 植物解剖学 (第二版)
[M]．上海：上海科学技术出版社，177—185．
Wei Y(卫 云)，Guo QM(郭庆梅)，Ma ST(马书太)，et
a1．1997．怀牛膝 根 内部 结构 的研 究 (An anatomical
study of the achyanthus biodentata)[J]．Journal of
Shandong University of TCM(山东中医药大学学报)，
21(6)：452—455．
维普资讯 http://www.cqvip.com