全 文 ：广 西 植 物 Guihaia 21(2)：177— 182 2001年 月
豇豆几丁质酶 N端序列测定及
与其它植物的比较
陈崇顺 。，朱雪峰。，郁志芳
(1 南京师范大学生命科学学院分子医学生物技术实验室，江苏南京 210097；2．南京农业大学园艺系
江苏南京 810095；8．南京农业大学食品科技学院，江苏南京 210095)
摘 要：通过自动 Edman庠解程序，测定了经诱导、纯化的豇豆几丁质酶N端1o个氨基酸的序列，并将该序列
与其它植物几丁质酶 N端相应部分的氨基酸序列进行了比较分析 。结果表明，该豇豆(Vigna sesquipedatis)几丁
质酶N端 1o个氨基酸的序列为EQCGSQAGGA，与 I类几丁质酶同一部分同感序列同源性高达 100 ；而与
I、Ⅱ及Ⅳ类几丁质酶的相应序列均无同源性 结台考虑此酶的等电点(8．3)及分子量(33 kD)．可推测该豇豆几
丁质酶属于 I类几丁质酶。其 N端序列的高度保守性提示，该段序列可作为 I类凡丁质酶的一段主要特征序
列，并可据其台成棱酸探针，以分离、克隆其它 I类几丁质酶编码基因
美键词：豇豆；几丁质酶；N端氨基酸序列 ；测定；比较
中圈分类号 ：Q946．91 5 文献标识码：A 文章编号：1000—3142(2001)02 0177 06
Determination of the N—terminal amino acid
sequence of a chitinase from Vigna sesq uipedalis
and its comparison with those of the same
regions from other pl ant chitinases
CHEN Chong—shun ～，ZHU Xue—feng。，YU Zhi—fang。
(1-盯 c Ⅱr b-Medical Bu~echnology Laboratf ，Colege of ^ Sciences，Nanjiag N~rmat Univ~,s[ty，
Nanjing 210097，China；2·Dept．ofHomicuture，Nanj,ng Agric．Uaiv．，Nanjing 210095，China；3 Cellege ofFax4 ScletIce
and Technology．Nanjlng Agric Univ ，Nanjing 210095 China)
Abstract：The sequence of ten N—terminal art~irm acids was de~ermirmd by automatic Edman degxadation，for an in
duced and purified chitinase fr0m 墉n口sesquipedahs，and compared with those of the same regions of other plant
chifnases．The results indicated that the first ten N—terminal amino acids for the chkinase from V
． se sqm b缸 s
were sequenced in EQCGSQAGGA The sequene shared a 10C homology with the consensus se口ueIlce of the oth—
er sequenced chitinases class I，however presented no homology to the sequences of ten N terminal amino acids
from the chitinases of class 1，class Ⅱ and class Ⅳ，respectively with its isoelectric point(8 3)and moleeu]ar
weight(33kD) it was deducible that the chitinase from V
．wsquipcdalL*％vas one of the chitinases class I The
收稿 日期 ：2000 07 1 9
作者简介 ：阵崇顺(1958)，男 生物学博士，主要从事生物工程及分子 物学等方面的研究与教学
基叠项目：国家自然科学基金资助项日(39670515)
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facc chat the flrst cen N—cerminal amino acids were very high conservative within the ehitinases class I suggested
that the sequence could serve as a main characteristic~quence for class I．And some oligo—nucleotide probes，syn—
thetized on the basis of it．could be used to isolate and clone the genes encoding the chitinases of c]ass I．
Key words：Vigna sesquipedalis；chitlnase；N—terminal amino acid sequence~determination；comparison
几丁质酶(EC 3．2．1．1 4)是一种能降解几丁质
(N一乙酰氨基葡萄糖线性同聚物)的糖苷酶。由于具
有抗真菌活性等多重作用，所 植物几丁质酶的酶学
及分子生物学研究受到了越来越多的关注。近年来，
植物几丁质酶及其基因更成为抗真菌病基因工程研
究的焦点 ：。为了充分发挥作为目的基因的几丁质酶
基因的抗真菌作用，在分离、克隆、制备该 目的基因
前，首先必须了解其表达产物的抗真菌活性及其它相
关特性。这是因为同一植物可能含有不止一种几丁质
酶，并非所有几丁质酶都有抗真菌活性 。同时，同一
几丁质酶对不同真菌的抑制作用不尽相同。 ；另一方
面，同一真菌对不同几丁质酶的敏感程度也有差
异“ 。上述这些不同之处至少涉及到几丁质酶的不同
类型、不同来源等。如Fusarium solanl在烟草 1类几
丁质酶的作用下菌丝尖端解体，生长受抑；而对烟草
Ⅱ类几丁质酶的作用则不敏感“ 鹰嘴豆碱性几丁质
酶能使Rhi~x-tonia solani等供试真菌菌丝生长受抑；
而其酸性几丁质酶则对前述相同供试菌无抑制作
用“ 。因此，为了开展豇豆几丁质酶抗枯萎病基因工
程的研究，笔者首先从豇豆幼苗中诱导、纯化出了一
种对 Fusarium oxysporum等批示真菌具强抑制作用
的几丁质酶 、 本论文则报告以前未见研究的、具强
抗真菌活性的该豇豆几丁质酶 N端氨基酸序列的测
定结果，同时将其与其它植物几丁质酶N端相应片
段的氨基酸序列进行比较，力图在为进行豇豆几丁质
酶基因工程研究奠定重要基础的同时，通过对该段测
定序列可能意义的探讨，为开展其它抗真菌的几丁质
酶基因的分子生物学研究等创造良好的条件。
1 材料和方法
1．1材料
1．1．1供试植物材料 早熟二 号豇豆(Vigna sesqui
pedalis)购于南京市蔬菜种子公司(赣州地区群力种
籽公司产品)。
1．1．2主要 化学试 荆用品 3一环 已胺一1一丙磺 酸
(CAPS)为 Sigma公 司产品 ；聚乙烯二氟 (PVDF)膜
为ABI公司产品。其它试剂为国产分析纯。
1．2方法
1．2．1几丁质酶的请导与纯化 用 0．25 mg／mL西
瓜尖镰孢菌(Fusarmm oxysporum f．旃 )胞壁碎
片及孢子混合液以浸根法诱导处理 ‘早熟二号’豇豆
幼苗 4 d后取其全株提取几丁质酶。经热变性 (60
。c，30 min)、硫酸铵沉淀(6O 饱和度，4 oC)，亲和层
析(以再生脱乙酰几丁质为层析介质)纯化程序，将经
诱导的豇豆几丁质酶提纯“ 。
1．2．2 SDS~PAGE电泳及电转移 参考夏其昌的方
法 。制备好经诱导特异表达的豇豆几丁质酶纯化样
品，采用 5 的浓缩胶和 l2 的分离胶，室温下恒压
电泳到溴酚蓝前沿跑至凝胶末端(浓缩胶 60 v，分离
胶 160 V) 电泳结束后，将凝胶用 1O 甲醇和 lO
mmol／I 的 CAPS(pH为 11．O)缓冲液浸泡 5 min；另
将经甲醇和 CAPS缓冲液预处理过的一张 PVDF膜
置于两张定量滤纸上，再将浸泡过的凝胶置于膜上，
盖两张经CAPS缓冲液预处理过的定量滤纸。将其置
半干式电转移仪，用 i00 mA恒流转移l h。待转移结
束后，取下PVDF膜，用考马斯亮蓝 R一250染色 5O s。
待脱色后即可见蛋白质条带。
1．2．3 端氨基酸序列的测定 用刀片切取蛋白质
条带，上ABI 491A蛋白质测序仪测定 N端氨基酸残
基序列。
2 结果与讨论
2．1豇豆几丁质酶 N端氨基酸序列的测定
豇豆几丁质酶纯化样品经 SDS~PAGE电泳处理
后，能很好地被半干式电转移仪从凝胶中转移至
PVDF膜上。经 ABI 491A蛋白质测序仪测定，该豇
豆 几丁质 酶 N 端前 10个 氨基 酸 的序 列 为 E—
QCGSQAGGA(图 1)
2．2豇豆与其它植物几丁质酶 N端氨基酸序列的比
较分析
将本研 究所测得的豇豆几丁质酶 N端前 1O个
氨基酸残基序列与从 GenBank及相关文献中检索到
的其它有代表性、分类确定的植物几丁质酶的相应序
列(纯化蛋白质测序的直接资料或据其编码基因推得
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2期 陈崇顺等：豇豆几丁质酶N端序列测定及与其它植物的比较 179
的氨基酸序列)分列于表 1。由表 1可得，I类几丁质
酶N端前 1O个氨基酸的同感序列为 EQCGSQAG—
GA(该类绝大多数几丁质酶与此同感序列的同源性
高达 90 ～1∞％；与此同感序列同源性最低也有
60 ，且只有 1个)；Ⅱ类几丁质酶 N端前 10个氨基
酸的同感序列为GGIAIYWGQN(该类各个几丁质酶
与此同感序列的同源性也高达 6O ～10O )。然而，
未能找到 I类及1V类几丁质酶相应片段各自的同感
序列，这两类下属的不同几丁质酶N端 10个氨基酸
残基序列彼此之间有些相差不大，而有些则完全不
另外，除个别位置残基相同外，上述4大类几丁质
酶该段序列相互之间亦不相同。笔者得到的该豇豆几
丁质酶 N端前 10个氨基酸序列与 I类几丁质酶上
述同感序列同源性高达 1。0％；而与其它各类几丁质
表 1 豇豆几丁质酶 N端氨基酸序列(第 l～10个残基)与其它植物几丁质酶相应序列的比较
Table 1 Comparison of the N—terminal amino acid 5equence(resldues 1～10)of a chitinase
from V培nd sesquipedalis with those of chitinases from other plants
酶的相应序列几乎没有同源性。
2 3豇豆几丁质酶的分类及其 N端测定序列的意义
根据酶蛋白一级结构的不同，高等植物几丁质酶
目前公认可分为 4类，参考单丽波等。”．见图 2。 I
类：N端信号肽(长约 24个残基，富含疏水氨基酸)+
几丁质结合 区(长约 4O个残基 ，富舍半胱氨酸 )+铰
台区(长约 20个残基，富含脯氨酸)-_催化功能区(长
约240个残基) I类几丁质酶又依其是否具有c端
扩展区(长约 6个氨基酸)而被分为 I类a型(I a)和
I类 h型(I b)。 I a几丁质酶之c端扩展区使其定
位于液泡中；1类催化功能区与 I类相应区段高度同
源，这两类几丁质酶之间存在血清学交叉反应，具有
共同的抗体反应簇；Ⅱ类多为兼具几丁质酶和溶菌酶
活性的双功能酶。其催化功能区与上述两类相应区段
同源性很低，在血清学上无交叉反应；Iv类的几丁质
结合区和催化功能区结构类似于 I类的相同区域，但
其中缺失了一些片段，使其上述区域减小。因此，该类
的氨基酸残基数大大低于一般 I类几丁质酶成熟蛋
白所含 300个左右氨基酸的水准。另外，其几丁质结
合区虽与 I类几丁质酶的几丁质结合区相类似，也富
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含半胱氨酸(约为 7个)，但该区的氨基酸残基序列却
与 I类几丁质酶的相应区域大不一样。一般几丁质酶
基因首先被翻译成含有信号肽的前体蛋白；蛋白质正
确定位后，其信号肽被切除而被加工为成熟形式。
I类几丁质酶多为 I a类型，碱性，位于细胞内
液泡中。在病原真菌侵染植物细胞时，积累在液泡中
的几丁质酶会非常迅速地大量释放出来以降解真菌
侵染结构，具有强抗真菌的作用；Ⅱ类几丁质酶位于
细胞间隙。在植物防卫反应中，其主要作用不是直接
杀灭侵染真菌，而是释放诱导因子，从而诱导周围细
胞的抗真菌活性；Ⅱ类几丁质酶亦位于细胞间琼。其
抑菌能力的研究少于其对植物生长发育作用的研究；
Ⅳ类几丁质酶也位于细胞间隙，具有一定的抗真菌能
力 。迄今无论是纯几丁质酶离体抑菌效果，还是转
几丁质酶基因植物对病害的反应多以 I类几丁质酶
抗真菌活性为最强。因此，I类几丁质酶在植物对病
图 1 豇豆几丁质酶N端序列袒5定的 PTH一氨基酸色谱囤
Fig．L PTH—amino acid chromatogram of N terminal amino acid sequencing of a ch[tinase from VfKna sesquipedahs
原真菌侵染的防卫反应中作用最大
笔者首先诱导、纯化了文献中未见报道的豇豆
(Vigna sesquipedalis)几丁质酶，并测定了该纯酶的等
电点、分子量等特性 本文报告的该纯豇豆几丁质酶
N端前 lO个氨基酸的序列也即为其几丁质结合区N
端最先 10个残基之序列 其与I类几丁质酶相应片
段同感序列同源性高达 i00 ；因 Ⅱ、Ⅲ两类几丁质
酶均无几丁质结合区，故其与它们均无同源性；其与
Iv类几丁质酶几丁质结合区的相应片段也无同源性。
另一方面，结合考虑笔者测定的其等电点(8．3)和分
子量(33 kD)等研究结果 ，可推测该豇豆几丁质酶
可能属 I类几丁质酶。进一步的研究也表明其对枯萎
病菌等供试真菌具强抑制作用 、。该酶成熟形式N端
前 lO个氨基酸序列的测定为其基因克隆及基因工程
研究打下了良好的基础；同时，笔者报告的该段序列
在 I类 几 丁质 酶 中的 高度 保 守 性亦 提 示，E．
QCGSQAGGA可作为 I类几丁质酶分类的一段主要
特征序列。据此，可初步了解某一待研几丁质酶及其
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2期 陈崇顺等：豇豆几丁质酶 N端序列测定及与其它植物的比较 181
Class Ia
Class lb N
Class i1 N
Clas 1I N
Class iV N
CooH
CooH
— CooH
— CooH
CooH
日 N端信号肽 N—terminal si peptide
Ⅱ 铰台区 Hinge region
口 催化功能区 Catalyiic domain
口 几丁质结合区 Chitin—binding domain
口 催化功能区 Catalytic donmin
口 C端扩展区 C～terminal extension
图 2 四类几 ]质酶一级培 构特点 比较
Fig 2 Comparison of characteristics of the primary structure among the four classes o f chitinases
基因在抗真菌病基因工程中的应用价值；可合成核酸 出版社，1997．250．
探针，分离、克隆出其它 I类几丁质酶基因，以便对其 [83 SamacDA，Hironaka CM，Yalaly P E，et al·Isolation
作分子生物学的进一步研究。 and characterization of th genes encodi“g hasic and
N端氨基酸序列的测定得 到北京大学蛋 白质工 idjc chitinasein Arabid印sis h li na[n Pla P^
程及植物基因工程国季重点开放实验室沈一萍老师 ， 。。o，93：。。 一。 ·
的帮助，特此致谢。 [93 KHgh KM,He drlksTde J咖g A J， ch 啪 i
zatlon of chitinases able to rescue somatic embryos of the
参考文献： 忙mpe re ns“ 。m an d丌 u_J J‘
M olecular Biology，1996，31：631- 645．
[1]高必达-转几丁质酶基 因防植物病害研究：进展、问题 [1。]DanhashN，w makersCAM ，vanKanI A I ．
与展望[J]．生物工程进展，1999，19(2)：2l一28
[2]Kim Y J，Hwang B K Purification—N—terminal amino
acid sequencing and antifungal activity of chitlnases
from pepper stems treated with mercuric chloride-j]
Physiological and M olecular Plant Pathology，1996—48
4l7— 432．
(33陈崇顺，朱雪峰 ，郁志芳．豇豆几丁质酶纯酶液对不同
真菌的作用 J]．植物保护学报，2000，27(4)：375-一
376．
[43 Sela—buurIage M B，Ponstein A S，Bres Vloemans S A，et
a1．Only specific tobacco(Nicotiana tabacum)chifinases
and 0一l，3-glucanases exldbt ar~tifurtgal activity[J]．
Plant Physiol，1993，101：857 863
[5]Vogelsang R，Barz W Purification，characterization and
differential hormonal regulation of a 1，3一glucanase
and two chi．tinases fr~rit chlckpe,a(Cicer arietlnum l_．)
[J]Planta．1993，189(1)：60—69
：6]陈崇顺 一朱雪峰 ，郁志芳．豇豆几丁质酶的诱导与纯化
_J] 园艺学报．2000．27(5)：351 355
[7]夏其昌．蛋白质化学研究技术与进展[M]．北京：科学
Molecular characterization of four chitinase cDNAs ob—
tained from Cledosporlum fulvum infected toInato[J]．
Plant M olecular Biology，1993，22：lOl7— 1029．
[11]Shlnshi H ，Mohnea D，Meins F．Regulation of a Dlant
pathogenesis related enzyme：Inhibition of chitinase and
chitinase mRlX『A accumulation in cultured tobacco tis—
sues by auxin and cytokinln[J]．Prw Natl Acad Sci
USA，1987，84：89— 93．
[123 Zhu Q，Lamb C J．Isolation and characterization of a
rice gene encoding a basic chitinase[J]_Mo／Gen
G ，l99l，226：289— 296
13：Broglie K E，Gaynor J j，Broglie R M．Ethylene—regu一
]ated gene expression：Molecular cloning of the genes
encoding an endochltinase from Phaseohs vulgaris[J]．
PM Natl Acad Sci USA．1986．83：682O一一6824．
[ d]Gaynor j J．Primary structure of an endochifnase mR—
NA from Solanum tuberosum[J ．Ntacleh-,4cid Re
search，1988，16：5210．
[1 5]Meins F—Neuhaus J M ，Spe risen C，et a1．The primary
structure ot plant pathogenesis related glucanohy
维普资讯 http://www.cqvip.com
1 82 广 西 植 物 2l卷
drolases and their genes[A]．In：Boiler T，Meins F．
Genes Involved in Plant Defense C] Vienna：
Springer，1998，245——282．
063 Snyder—I eiby E T-Furtek D B．A genomic clone from
Theobroma cacao I．．with high similarity to plant class
I endochitinase sequences[J] Plant Physiol，1995．
1o9：338．
[17]Molano J，Polasheck T，Duran A．et at An endochiti
nose from wheat germ[J：．Journal of Biological
Chemistry，1979，254：4901一一4907．
[18]I eah R，Tommerup H，Svendsen I．et a1．Biochemica1
and molecular characterization of three barley seed pr【卜
teins with antifungal properties iJ]．J B Chem，
1991．266：1 564 1 73．
[193 Payne G，Ahl P，Moyer M ，et al Isolation of comple—
mentary DNA clones encoding pathogenesis related
proteins P and Q ，two acidic chitinases from tobacco
[J] Proc Nazi Acad Sci USA，1990．87：98 l02
[203 Metraux J P，Burkhart W ，Mayer M． al Isolation of
a complementary DNA encoding a chitinase with struc
tural homology to a bifunctional lysozyme／chitinase
[J]．Proc Natl Acad Sci USd，1989．86：896 900．
[21]Lawton K，Ward E，Payne G， f al Acidic and haslc
class Ⅱ chitinase mRNA accumulation jn response t0
TMV infection of tobacco_J]． 删 “fdr 。-
gy，1992，19：73j 743．
[223 Bernasconi P，Locher R，Pilet P E．Ff at．Purificati0n
and N—termina1 amino—acid sequencc of a bas】c
lysozyme from Parthenocissus quinquifolia cultured in
vitro[J] Biochim Biophys Acta，1987，915：245
260．
E2,3]Ohta M，Yamagami T．Funatsu G． Purification and
characterization of two chitinases from the leaves of
pokeweed(Phytolacca americana)口]．Biosci Bineech
B he ，1995，59(4)：656 661．
[24]lshige F，Yamazaki K，Marl H，et o2 The effects of
ethylene on the ccerdinatod synthesis of multiple pro-
teins：accumulation of an acidic chitinase and a basic
glycoprotein induced by ethylene in leaves of azuki
bean．Vigna anguhrislJ] Plato Cell Physiol，1991，32
(5)：68l 690
[257 Rasmussen U，Bojsen K-Collinge D B．Cloning and
characterization of a pathogen induced chitinase in
Brassica napus~J]．Plane肘o c“ 口r Biology．1992．20：
277— 287．
(263 Margis Pinheiro M ，Metz—Boutigue M H，Awade A ．et
at． Isolation of a complementary DNA encod ing the
bean PR4 chitinase：an acidic enzyme with an amino—
terminus cysteine rich domain[J] Plant c 口r
Biology，1991，17：243 2j3．
：27]单丽波，贾 旭．几丁质酶及其在抗真菌病基因工程
中的应用口]．生物工程进展，i998，18(3)：37 40．
[283 Graham L S-Stlcklen M B Plant chitinases[J]Can J
Rot-1994，72：lO57 1083．
E297朱雪峰-陈崇顺．郁志芳．豇豆几丁质酶部分酶学特性
的研究lJ]．生物技术，1999，9(6) 15 l9．
维普资讯 http://www.cqvip.com