全 文 ：广 西 植 物 Guihaia 27(2)：236～ 239 2007年 3月
杜仲细胞悬浮培养生产桃叶珊瑚甙的研究
王亚琴，朱 媛
(华南理工大学 生物科学与工程学院，广州 510640)
摘 要：对杜仲细胞悬浮培养及其次生代谢产物桃叶珊瑚甙的产生进行了研究，考察了各种理化因子对细胞
生长及桃叶珊瑚甙产生的影响。结果表明，在悬浮培养生产桃叶珊瑚甙中，第 18天桃叶珊瑚甙的含量达到最
大值，培养基为MS、pH为 5．8时有利于桃叶珊瑚甙的合成，此时含量高达4O．56 mg／L。2．0 mg／L的2，4-D、
NAA及浓度低于 1．0 mg／L的6-BA均能促使桃叶珊瑚甙的合成，但 KT却抑制桃叶珊瑚甙的合成。
关键词：杜仲；桃叶珊瑚甙；细胞培养
中图分类号：Q943．1 文献标识码：A 文章编号 ：1000—3142(2007)02—0236—04
Studies 0n the cell suspension culture 0f E cI口I，
● T ● l 、 l ● l ● ■ 1 l ● 1 ●
Z ￡7 oza S UIlV．and its metabOllte-auCUDln
Ⅵ NG Ya—Qin．ZHU Yuan
(College of Bioscience and Bioengineering，South China University of Technology，Guangzhou 510640，China)
Abstract：The production of aucubin in cel suspension culture of Eucommia ulmoides 0liv．was reported．Some
physical and chemical factors affected the cel growth and the production of aucubin were investigated．The results
showed that the concentration of aucubin was the highest on 18th day．The optimal conditions such as MS medium
and the proper pH was 5．8 could produce 40．56 mg／L aucubin．2．0 mg／L 2，4-D，NAA and 6-BA below 1．0
mg／L could promote the production of aucubin，but KT restrained the production of aucubin．
Key words：Eucommia ulmoides 0liv．；aucubin；cell culture
利用植物细胞培养生产药用成分是近年来发展
起来的新领域，已经成为开发药用植物资源的重要
途径(梁文裕等，2003)。杜仲(Eucornrnia ulmoides
Oliv．)是重要的药用资源，其药用成分包括桃叶珊
瑚甙、绿原酸、总黄酮等。其中，桃叶珊瑚甙(Aueu—
bin，简称 Au)是一种重要的生物活性物质，具有清
湿热、利小便、镇痛、降压、保肝护肝、抗肿瘤等作用，
广泛应用于医药、日用化工和饲料等行业。它能促
进干细胞再生，明显抑制乙型肝炎病毒 DNA的复
制，其甙元及有效多聚体是一种抗菌素(李长恭等，
2002；管淑玉等，2003)。桃叶珊瑚甙主要存在于杜
仲的树皮、叶中，含量较低，提取量有限，而且通过剥
皮、采叶来提取桃叶珊瑚甙对杜仲的生长有一定影
响。因此，为了更有效地保护杜仲种质资源，目前多
采用组织培养技术，在组织和细胞水平上促成杜仲
次生代访 物的生物合成，达到在不受田间条件制约
的情况下大规模生产杜仲次生代谢物的目的。本文
通过对影响仲细胞悬浮培养及其次生代谢物桃叶珊
瑚甙产生的各项因子进行了研究，得出了生产桃叶
珊瑚甙的优化条件，为通过细胞培养大规模生产次
生代谢物奠定了基础。
1 材料和方法
1．1材料
供试材料为采自广州乐昌县杜仲基地的种子。
收稿日期：2006—05-08 修回日期：2006—10—30
基金项目：广州市科技计划项 目(2004J1一C0231)；广东省国际合作项 目(20041350201021)[Supported by Municipal Funds of Science and
Technology Project of Guangzhou(20O4J1一C0231)；Funds of International Cooperation Projact of Guangdong Province(2004B50201021)]
作者简介：王亚琴(1972一)，女 ，山西忻州人，讲师，博士 ，从事植物基因工程与生物制药方面的研究，(E-mail)yqwang@ scut．edu．cn。
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2期 王亚琴等：杜仲细胞悬浮培养生产桃叶珊瑚甙的研究 237
1．2愈伤组织的诱导
杜仲愈伤组织系由杜仲种子萌发的无菌苗真叶
诱导。诱导的愈伤组织接种于含有 20 mL B5(附加
0．5 mg／L 2，4一D、0．5 mg／L 6一BA及 20 g／L蔗糖)
固体培养基的50 mL三角瓶中。置于 GXZ型智能
光照培养箱中(25q-2℃)培养，10 h／d光照、14 h／d
黑暗，光照强度 4 000 p．mo1．in～．s～。愈伤组织 15～
20 d继代一次，经过半年的驯化培养得到无性细胞
系。
1．3细胞悬浮培养体系的建立
将生长旺盛、结构疏松、易于分散的愈伤组织转
移到液体培养基中，置于摇床中进行悬浮培养，摇床
转速为 110 r／min，培养温度 25±2℃，全天光照，光
照强度 4 O00p．mo1．m～．S一。培养 2～3周后，培养液
中即有悬浮单细胞或小细胞团出现。继代培养时，
加入等量的新鲜培养液，摇匀，稍静置，待大细胞团
沉降后分瓶，不需过滤，即可得到不含大细胞团块的
培养物。这样通过 3～4次继代培养，即可得到只含
单细胞或小细胞团的培养物。
1．4细胞生长的测定
悬浮培养细胞经尼龙网过滤，蒸馏水洗涤 3次，
抽滤去表面水分，称量鲜样质量 Fw(g／L)，50℃烘
干后称量干样质量 DW(g／L)。细胞增长率一(收
获细胞量一接种细胞量)／接种细胞量 ×i00 。
I．5悬浮细胞培养物中桃叶珊瑚甙含量的 HPLC法
测定 (杨小梅等，2003)
将收集的杜仲干细胞置于 50 mL容量瓶中，加
30 甲醇溶液 40 mL，振摇 5 min，置冰箱 中过夜。
取出，放至室温 ，再振摇 10 min，加 30 甲醇溶液至
刻度，摇匀，过滤，弃去初滤液，取续滤液用滤膜滤过
后进样检测。仪器为 Agilent 1i00 LC高效液相色
谱仪，色谱柱为 XDB—C18(5 m，4．6 x 250 mm)，流
动相为乙腈 ：水一3：97，进样量 20 L流速 1．0
mL·rain ，柱温 25℃，检测波长 206 nm。
2 结果与分析
2．1接种量对悬浮细胞生长的影响
在以生产次生代谢物为目的的植物细胞悬浮培
养中，要求细胞均有较高的生长速率，获得了高生长
速率的细胞系后，再通过各种影响因子的调控来提
高细胞系中次生代谢产物含量。本试验考察了 30、
40、50、60、70 g／L接种密度，结果显示：当接种量为
50 g／L时，细胞倍增量最大。
35
30
—
25
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20
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1 5
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5
0
图 1 接种量对悬浮细胞生长的影响
Fig．1 Effect of different inoculating quantity
on the growth of suspension cell
2．2细胞生长曲线与桃叶珊瑚甙含量的变化
在培养条件相同的情况下，分别于培养后的第
3～21天每 3天随机抽取 6瓶培养物，测定培养细
胞的干重和其 中桃叶珊瑚甙的含量，结果见图 2。
杜仲悬浮培养细胞生长曲线基本为 S型，经历了4
个阶段：迟滞期、对数生长期、生长平衡期和衰亡期。
在培养前期，桃叶珊瑚甙的含量随细胞增长而逐渐
增加，第 18天时达到最大含量，因此，以选取生长到
第 18天时收获细胞为宜 。
图 2 杜仲悬浮培养细胞生长曲线
和桃叶珊瑚甙含量变化曲线
Fig．2 Growth curve of suspension cell of Eucommia
ulmoides Oliv．and aucubin content curve
2．3碳源对悬浮细胞生长及桃叶珊瑚甙含量的影响
2．3．1不 同碳源对悬浮细胞生长及桃 叶珊瑚甙含量
的影响 本试验观察了蔗糖、葡萄糖、麦芽糖等不同
碳源对悬浮培养细胞生长和桃叶珊瑚甙含量的影
响，选用不同的碳源浓度均为 20 g／L。由表 1可
见，以蔗糖为碳源时，最适于细胞的生长，且桃叶珊
瑚甙含量最大，其它两种碳源的效果都不如蔗糖。
一 一5 B一 8c8 uI号onv
他 8 6 4 2 0
∞侣 他 8 6 4 2 0
(]／暑一Ma
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238 广 西 植 物 27卷
2．3．2不同蔗糖浓度对悬浮细胞 生长及桃叶珊瑚甙
含量的影响 本试验考察了浓度分别为 2O、3O、4O、
5O、60 g／L的蔗糖对细胞生长及桃叶珊瑚甙含量 的
影响。由图 3可知，当蔗糖浓度为 50 g／L时，细胞
生长量最大，但此时对应的桃叶珊瑚甙含量却不是
最大；相反，当蔗糖浓度为 20 g／L时，细胞生长量最
小，但此时对应的桃叶珊瑚甙含量最大，由此可见，
蔗糖对桃叶珊瑚甙的生成有一定 的抑制作用 。
表 1 碳源对悬浮细胞生长及桃叶珊瑚甙含量的影响
Table l Effect of different carbon sources on the growth
of suspension cell and the content of aucubin
图 3 蔗糖浓度对悬浮细胞生长及桃叶珊瑚甙含量的影响
Fig．3 Efect of concentration of sucrose on the growth
of suspension cell and content of aucubin
2．4培养基对悬浮细胞生长及桃叶珊瑚甙含量的影
响
本试验考察了 MS、B5、N6等培养基对细胞生
长及桃叶珊瑚甙含量的影响。由图 4可知，N6培养
基最适于细胞生长，MS培养基最利于桃叶珊瑚甙
的合成，而 B5培养基的效果明显不如 N6和 MS。
由此可见，以获得高产量次生代谢物为目的的悬浮
培养，应选用 MS培养基作为基本培养基。
2．5培养基初始pt对悬浮细胞生长及桃叶珊瑚甙含
量的影响
在其它条件相同情况下，考察了培养基初始
pH的影响效应。试验结果表明，pH对细胞生长的
影响不是很大，但对产物含量影响较大，当 pH 为
5．8时，桃叶珊瑚甙的产量最大。
图 4 不同培养基对悬浮细胞生长及
桃叶珊瑚甙含量的影响
Fig．4 Effect of different medium on the growth of
suspension cell and the content of aucubin
图 5 pH对悬浮细胞生长及桃叶珊瑚甙含量的影响
Fig．5 Effect of p H on the growth of suspension
cell and the content of aucubin
2．6激素对悬浮细胞生长及桃叶珊瑚甙含量的影响
本试验考察了生长素和分裂素对细胞生长及次
生代谢产物含量的影响。由表 2可知，添加了2，4一
D、NAA等生长素后，均能检测出桃叶珊瑚甙，随着
生长素浓度升高，桃叶珊瑚甙的含量也增加，且在
2．0 mg／L时产量最大，在此基础上继续加大生长素
浓度时，桃叶珊瑚甙的含量反而减少。低浓度的细
胞分裂素如 6一BA也能促使桃叶珊瑚甙的合成，但
浓度不能超过 1．0 mg／L，而 KT无论什么浓度均不
能促使桃叶珊瑚甙的合成，且抑制细胞的生长。
3 讨论
影响悬浮细胞培养物中次生代谢物含量的因素
很多，如外植体种性、生育状态、培养方法、培养条件
等内、外因素等。内在因素主要指物种的特性，不同
材料培养的成愈效果差异很大；外界因素主要是培
(] 占uo L ∞。uoo ul皿n。nv
驼∞∞；5； ∞ ∞侣
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2期 王亚琴等：杜仲细胞悬浮培养生产桃叶珊瑚甙的研究 239
养条件如培养基类型、碳源、pH、激素等，这些均能
显著影响次生代谢过程的因素均可考虑作为调控手
段(于荣敏，1999；李春斌 ，2003)。本实验以广州乐
昌基地种植的杜仲为研究对象，主要考察了培养条
件对其细胞悬浮培养生产桃叶珊瑚甙的影响。实验
表明，MS培养基更有利于桃叶珊瑚甙的合成，而
N6培养基更利于细胞生长，由此可见，适合细胞生
长的培养基不一定利于次生代谢物的合成。
表 2 激素对悬浮细胞生长及桃叶珊瑚甙含量的影响
1ahle 2 Effect of different phytohormone on the growth
of suspension cel and the content of aucubin
激素 激素浓度(rag／L)细胞干重(g／L) Au浓度
Phytohor- Phytohormone Dry weight (mg／I )
mone c0neent：ration of ce¨ AtI concent,·￡trion
培养基的pH值作为细胞悬浮培养的重要因素
对细胞生长及次生代谢物的合成起着重要作用，是
因为培养基的酸碱度对培养基中各种营养成分(如
Fe盐中的铁离子等)的活性有直接影响，从而影响
细胞对其吸收利用。张娟芳等(2003)在研究印楝细
胞悬浮培养时发现，pH值的高低对细胞生长有一
定的影响。本实验结果表明，pH值不仅影响杜仲
悬浮细胞的生长，而且对桃叶珊瑚甙的合成影响较
大，当pH值为 5．8时，桃叶珊瑚甙的含量最大。
激素常作为诱导和调节细胞生长的重要因素而
用于次生代谢产物的研究，但其中生长素和细胞分
裂素的作用大不相同。一定浓度的激素可以明显促
进细胞生长，但也会抑制次生代谢物的产生。如
NAA促进桔叶鸡眼藤悬浮培养物中蒽醌的产生，
而 2，4-D则完全抑制蒽醌的合成。在本实验中，较
低浓度的 2，4-D、NAA及低浓度的 6-BA均能促使
桃叶珊瑚甙的产生，但浓度过高时就会产生抑制，而
KT则完全抑制桃叶珊瑚甙的产生。
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