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全 文 :广 西 植 物 Guihaia 25(5):455— 458 2005年 9月
白花蛇舌草叶片离体培养及试管无性系的建立
李国平1一,黄群策 ,秦广雍
(1.郑州大学离子束生物工程省重点实验室,河南郑州 450052;2.莆 田学院环境与生命科学系,福建莆 田 351100)
摘 要:以白花蛇舌草叶片为材料,建立 了白花蛇舌草叶片高效不定芽发生、植株再生体系。研究了不同激
素及其组合对外植体不定芽发生的效应。结果显示,在MS基本培养基中单纯添加 6-BA,当6-BA浓度为0.1
mg/L和0.5 mg/L时,不能诱导离体叶片发生不定芽,6-BA浓度在 1.o~5.0 mg/L范围内,诱导率随BA浓
度升高而增加,适宜浓度为3.0 mg/L;当6-BA与NAA配合使用时,其诱导率随着培养基中6-BA与NAA的
相对比值的提高而提高;以Ms+BA 3 mg/L+NAA 0.01 mg/L作为继代培养基,建立起白花蛇舌草高效、稳
定的试管无性系,为白花蛇舌草遗传转化研究奠定了基础。
关键词:白花蛇舌草 ;离体叶片培养 ;不定芽;再生
中图分类号 :Q943.1;$661.1 文献标识码 :A 文章编号:1000—3142(2005)05—0455—04
In-vitro culture of Hedyotis diffusa leaves
and establishment of regeneration system
LI Guo—ping , ,HUANG Qun—caH 。QIN Guang—yongI
(1.Provincial Key Laboratory of Ion Beam Bio—engineering,Zhengzhou University.Zhengzhou 450052
China;2.Department of Environment and Life Science,Putian University,Putian 351100,China)
Abstract:High frequency adventitious shoot formation and plant—let regeneration system were established
through in-vitro culture 0f Hedyotis diffusa leaves.The results showed that leaf adventitious shoots could not
be induced on basal MS medium supplemented with 6-BA 0.1 mg/L or 6-BA 0.5 mg/L.When 6-BA 1.O~5.0
mg/L was added in MS medium,adventitious shoots generated.The higher the concentration Of 6-BA Was.the
higher the regeneration rate and number of adventitious shoot per leaf were obtained
. However,MS medium
added with 6-BA 3.0 mg/L was suitable for leaf adventitious shoot formation and growth.The combination 0f
6-BA and NAA promoted the regeneration efficiency of leaf in-vitro
. This study indicated that it Was the rati0
0I 6-BA/NAA rather than the quantity that influenced the regeneration of adventitious shoot.The optimaI ra-
tio of 6-BA/NAA was 10.MS basal medium supplemented with BA 3 mg/L and NAA 0
. 01 mg/L was used as
subculture medium and a high frequency and stable regeneration system was built,which laid a foundation f0r
Agrobacterium—mediated genetic transformation

Key words:Hedyotis diffusa;leaf culture in-vitro;adventitious shoot;regeneration
白花蛇舌草(Hedyotis diffusa)为茜草科耳草
属植物,是重要的抗癌植物,临床广泛用于治疗多种
恶性肿瘤。其研究多集中于分析化学成分及医疗价
值(吕华冲等,1996;逮萍等,2000)。近年报道该植
物含有具免疫活性的多糖,有增强非特异免疫的作
用(单保恩等,2001;谭宁华等,2002;于新等,2002;
收稿 日期 :2004-09-16 修订 日期 :2005—02—2O
基金项目:国家“十五”科技攻关项 目(2001BA302B);福建省教育厅科研项目(JA02268)(Supported by the National Kev Pro—
ject of China,Grant No.2001BA302B;the Scientific Research Fund of Education Department of Fuian Province.
Grant No.JAo2268)。
作者简介:李国平(1966一),男,福建莆田人,副教授,博士生,主要从事离子束植物诱变研究。
’通讯作者(Auther for correspondence)
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赵浩如等,2002;Li等,2002)。利用植物生物技术 ,
进行白花蛇舌草的组织 、细胞培养研究 ,筛选高产免
疫多糖的细胞株,通过细胞悬浮培养并从其培养物
中提取纯化高含量 的活性多糖,可为这种免疫多糖
的产业化生产提供一条新的途径 。带顶芽或带腋芽
茎段离体培养经腋芽萌发途径再生植株 已有报道(李
国平等,2002)。本文通过该植物细胞组织培养的研
究报道离体叶片培养及试管无性系建立的研究结果。
1 材料与方法
1.1外植体与接种
以野生植株分枝顶端 2~4叶位的幼嫩叶片作
为外植体。外植体灭菌方法:先用少量洗衣粉洗刷
后在自来水下冲洗 2~3 h,然后在超净工作台上用
7O 酒精消毒 20 S,再在 0.1 升 汞溶液加数滴吐
温2O中灭菌 10 min,无菌水冲洗 5~6次。自叶柄
顶端剪取叶片,远轴面向下,接种在培养基表面。每
瓶接种 5个叶片,每处理 9瓶 。
1.2培养基
生根培养以 1/2MS为基本培养基,其它实验项
目中基本培养基均为 MS。按实验设计添加生长调
节物质组合 。培养基均附加蔗糖 30 g/L,琼脂 8.0
g/L,pH5.8。所有培养基均在 121℃、1.1 kg/cm
高温高压灭菌 20 rain。
1.3培养条件
培养温度为 25±2℃,光照 12 h·d~,光照度
为 1 500~2 000 lx。
1.4结果调查与统计分析
在叶片接种后 30 d,对不定芽的发生情况进行
调查。诱导率( )一发生不定 芽叶片数/接种叶片
数x 100;平均不定芽苗数(个/叶片)=不定芽苗总
数/发生不定芽叶片数。不定芽苗指高度大于 0.5
cm的由不定芽长成的无根不定芽苗。解剖、观察和
表 1 不同浓度 6-BA对白花蛇舌草叶片不定芽发生的影响
Table 1 Effect of 6-BA on adventitious shoot regeneration from the leaf of Hedyotis diffusa
o.1
o.5
1.o
2.o
3.o
5.O
o
o
33.3
62.2
1oo
1OO
o
o
8
23
52
37
19
1 5
1o
7
保持绿色,不见变化
稍微增厚 、卷曲
增厚 ,于切口处形成少量愈伤组织继而发生不定芽
肿胀明显,整张叶片愈伤化,不定芽分布稍稀 ,芽苗节间长
肿胀 ,扭 曲,继而叶两面呈疙瘩状突起,不定芽分布较密,芽苗正常
稍微弯曲,肿胀不明显,叶边缘形成密集不定芽,芽苗矮小
照相在体视显微镜下进行。
2 结果和分析
2.1细胞分裂素对离体叶片不定芽发生的影响
2.1.1不 同6一BA浓度对不定芽发 生的影响 当离
体叶片接种至培养基 MS+6-BA 0.1~5.0 mg/L
(单位下同)上 ,发现不同浓 度的 6-BA对不定芽发
生有较大影响 ,结果见表 1。由表 1可见 ,当 6-BA
浓度为 0.1和 0.5时,不能诱导离体叶片发生不定
芽;当6一BA浓度为 1.O~3.0时,诱导率、平均不定
芽苗数随BA浓度升高而增加,而始出现不定芽时
间随 BA浓度升高而缩短 ;当 6-BA浓度为 5.0时 ,
培养 至第 7天 即 可观 察 到不 定 芽 发 生 ,诱 导率
100 ,但平均不定芽苗数有所减少,丛生芽苗数较
矮少,且外植体愈伤化程度低,表现出一定的抑制作
用(图版 I:5)。综合几个指标,我们认为离体叶不
定芽诱导 的最适 BA浓 度应 当为 3.0。在培 养基
MS+6一BA 3.0中,培养至第 1O天 即可观察到不定
芽发生,不定芽发生过程大致如下 :叶片增厚一卷曲
一肿胀一形成少量愈伤组织一叶两面呈疙瘩状突起
一出现肉眼可见的“芽苗”一不定芽形成。经解剖观
察,此“芽苗”具维管束与外植体相连,不易剥离,故
属于不定芽发生途径(图版 I:1、2、3、4、6)。
2.1.2不同细胞分裂素对不定 芽发生的影响 在基
础培养基 MS+NAA 0.01中分别 添加 6一BA、KT
和 ZT,浓度均为 3.0,以比较不 同细胞分裂素对不
定芽发生的影响。三种细胞分裂素均可高效诱导离
体叶片不定芽发生,6一BA、KT的诱导效果大致相当
(表2)。从离体叶片初始出现不定芽的时间看,ZT
的诱导作用较 6-BA、KT强,6-BA的作用较 KT稍
强。从不定芽苗形态看,培养基 MS+NAA 0.01+
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5期 李国平等:白花蛇舌草叶片离体培养及试管无性系建立 457
ZT 3.0中不定芽发生情形与 2.1.1实验中MS+6一
BA 5.0中的大致相似,外植体近于不经愈伤组织阶
段而直接发生不定芽,不定芽较密集,所形成的芽苗
较矮小,且平均不定芽苗数有所减少。所以,ZT诱
导不定芽发生的能力较强 ,浓度为 3.0时即表现出
一 定的抑制作用。
2.2不同 6-BA、NAA配比对 白花蛇舌草叶片不定芽
发生 的影 响
在预备实验 中,在 MS基本培养基 中添加不 同
浓度的 6一BA和 NAA对白花蛇舌草离体叶片的生
长发育方向影响极大,于是我们设计 、实施了一些实
验组合,结果见表 3。由表 3可见,BA与 NAA的相
对比例影响离体叶片不定芽的发生。在 1号处理中,
外植体仅发生不定根;在 2、7与 8号处理中,外植体
上亦无不定芽发生(图版I:7);随着培养基中 6一BA与
NAA的相对比例逐渐提高,其诱导率也逐渐提高,且
比值越高 ,每个外植体上形成的不定芽数量越多,外
植体愈伤化程度越低;当培养基中6一BA与 NAA的
相对比例大于 2时,外植体上才有不定芽发生。
2.3试管无性系的建立
综合 2.1、2.2的实验 ,我们以 MS+BA 3.0+
NAA 0.01作为继代培养基,以芽苗顶端 2~4叶位
的离体叶片作为外植体,建立起白花蛇舌草试管无
性系。在该培养基中,外植体从脱分化到不定芽高
频形成需 10 d左右,每个外植体可产生芽苗 5O个
左右,每个月可继代 1次,代期短且稳定性高(三年
试验结果无差异),所 以,成 为我们开展白花蛇舌草
离体培养研究的理想实验系统。
表 2 不同细胞分裂素对白花蛇舌草
叶片不定芽发生的影响
Table 2 Effect of different CTK on adventitious shoot
regeneration from the leaf of Hedyotis diffusa
表 3 不 同6-BA、NAA配比对白花蛇舌草叶片不定芽发生的影响
Table 3 Effect of different combination of 6-BA and NAA on adventitious
shoot regeneration from the leaf of Hedyotis diffusa
T 。 № e ⋯ A R
。 慧 羞 化h啦⋯ 山吣
1:1
5:1
10:1
10:1
4:1
2:1
1:1
近叶柄处发生少量不定根 ,无愈伤
叶片表面发生不定根,有少量愈伤
无不定根发生,愈伤稍多,不定芽少
无不定根发生,愈伤少,不定芽多
无不定根发生 ,愈伤少,不定芽多
无不定根发生 ,愈伤多,不定芽少
无不定根发生,愈伤多,但无不定芽
叶表面发生较多不定根 ,愈伤量稍多
2.4生根培养与试管驯化移栽
从继代增殖培养基 MS+BA3.0+NAA 0.01
中,挑选高达 3~5 cm、茎叶粗壮的丛生芽苗,分割
下来接种到生根培养基 1/2MS+NAAO.5上 ,15~
2o d后可形成完整 的根系 ,生根率可达 100 。已
生根的试管苗经炼苗 5~6 d,小心洗净根部琼脂,移
栽至灭过菌的草炭土和珍珠岩混合基质上,注意温
度、湿度及水肥管理,移栽成活率可达 85 9,6以上。
3 讨 论
植物离体培养中器官发生是一个极其复杂的过
程,受内源激素和外源生长调节物质 的调控。6一
BA、NAA是植物组织培养中最常用的生长调节物
质,其不同配比是影响离体叶片再生不定芽的重要
因素。本研究表明,在 MS基本培养基中单纯添加
BA时,低浓度的 6一BA不能诱导白花蛇舌草离体叶
片发生不定芽 ,高浓度的 6一BA可 以有效诱导不 定
芽发生,但 BA浓度太高时表现出抑制作用。6一BA
的这个诱导作用与苹果、洋桔梗、毛白杨等植物离体
叶片培养中的结果相似(杨霞等,1997;师效欣等,
1999;王艳等,2002;Du等 ,2002)。
在2.2项实验中,我们观察到离体叶片在 MS
+6一BA 0.5培养基 中无不定芽发生 ,但在 MS+6一
BA 0.5+NAA 0.1中可发生不定芽,可见,低浓度
6一BA需与 NAA配合才可诱导不定芽发生。另外,
o o ∞ o o
1 1 1 1 2 5 0 O
O O O O O O 1 2
O 1 5 O O O O O
0 O O 1 2 2 2 2
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影响不定 芽发 生 的重 要 因素是培 养基 中 6一BA与
NAA的比例,而不是其绝对值 ,如在 MS+BA2+
NAA2中仅形成愈伤组织 与不定根 ,无不定芽发生
(图版 I:8);当培养基中 6-BA 与 NAA 的相对比例
为 4或 5时,可诱 导不定 芽发生 ;当 6-BA 与 NAA
的相对 比例为 1O时则可诱导不定 芽高频发生。我
们认为,这个实验结果的合理解释是 :白花蛇舌草中
有与不定芽发生有关 的基 因,此基 因的表达受外源
生长调节物质的调控 ,尤其 是受 到细胞分裂素与生
长素比例高低的调控,当细胞分裂素与生长素浓度
比例达到一定值时,两者能互相协同作用,启动不定
芽发生基因的转录 、翻译 ,从而促进不定 芽的形成;
在一定比值范围内,细胞分裂素与生长素浓度比值
越高 ,有关基因表达得越快越强 ,不定芽发生所需时
间更短,形成的不定芽更多,在形态上表现出不定芽
的高频发生。
离体叶片在 MS+6-BA 0.5和 MS+BA 2+
NAA2培 养基 中无 不 定芽 发 生,但 在 MS+6-BA
0.5+NAA 0.1中可发生不定芽 ,这个实验结果可
为研究离体器官发生调控机制提供典型实验材料,
我们将以此现象进一步研究细胞分裂素与生长素的
相互影响机制和外源生长调节物质与基因表达的关
系,以便更深入地阐明不定芽发生的调控机制。.
一 般认为,植物离体培养中不定芽发生有两条
途径 :一是经愈伤组织发生不定芽,二是不经愈伤组
织阶段直接发生不定芽,但从本研究结果看,不定芽
的形成是否经过愈伤组织 阶段与培养基 中 6-BA浓
度或 6-BA、NAA 配 比有关 ,当 6-BA 浓度低或 6一
BA:NAA比值低时,离体叶片愈伤化程度高,而 6一
BA浓度高或 6-BA:NAA比值高时,外植体愈伤
化程度低 ,趋于直接发生不定芽(图版 I:5)。
研究离体器官发生首先需要一个较为理想和一
致的、同步性好的试验材料(谷瑞升等,1999)。本研
究所建立的白花蛇舌草无性系繁殖系统大致符合上
述条件,且不定芽发生频率高,继代代期短,故可作
为研究植物离体培养中器官发生调控机制的一个良
好试验体系。白花蛇舌草高效、稳定再生体系的建
立为我们利用细胞工程或基因工程技术进行遗传改
良奠定了必要基础。
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