全 文 ：广西植物Guihaia32(6)：800一805 2012年11月
DOI：10．3969／j．issn．1000一3142．2012．06．016
转拟南芥AfNPRl基因增强水稻对
水稻白叶枯病和稻瘟病的抗性
段承杰1一，罗荡平1一，罗雪梅1一，冯家勋1，2。
(1．亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室，南宁530005；
2．广西大学生命科学与技术学院，南宁530005)
摘 要：A￡NPRl基因是拟南芥系统获得抗性的一个重要调节基因，在拟南芥中过量表达A￡NPRl基因能使
拟南芥对细菌和真菌的抗性同时增强。为了研究在水稻中过量表达A￡NPRl基因对水稻抗病性的影响，将
该基因转入到广西主栽籼稻恢复系品种桂99中。经PCR验证得到了79株转基因植株，DNA斑点杂交表明
A丁NPRl基因已经整合到桂99染色体DNA中。N。rthern杂交和RT—PcR分析表明，A￡NPRl基因在桂99
中已经表达；同时还检测了转基因植株对水稻白叶枯病和稻瘟病的抗性，结果表明转基因植株对该两种病害
的抗性均显著增强。
关键词：AfⅣPRl基因；水稻；桂99；转化；抗病性；水稻白叶枯病菌；稻瘟病菌
中图分类号：Q789文献标识码：A 文章编号：1000一3142(2012)06一0800—06
Ov肾exp麟ionofAm扰dDps主sf胁玩圪nAfM哝1
紫neinriceenhancesthriceresistance
t0bacterialbli咖tandblaStdiseaSes
DUANChen矿Jiel一，LUODan乎Pin91一，I朋OXue-Meil一，FENGJ诗Xunl，2”
(1．S缸据KPyL西o，n￡or了，0rCo扎5㈣fio咒n竹d【崩fi翻￡io咒。厂S甜良ropi∞fAgr矿6 D埘so“rf8s，Nannir培530005，
China；2．CoZ如ge，Lt陀Sci伽ce口”d1矾Ho幻gy，(矗以九gzi【知i础绑i￡y，Nanning530005，China)
Abstract：TheA￡Nj叶己1geneisakeyregulatorofsystemicacquiredresistance(SAR)inAm抚do声s s￡凡口Zin舰．Over-
expressionofA六咿RlinA．≠^nZi口撇enhancedresistancetobothbacterialandfungaldiseases．’Ibinvestigatethe
effectofArNPRlover_expressioninriceonitsdiseaseresistance，theg newastransfornledasar storerinGui99of
Guang)【i．PCRandDNAdotblothybridizationanalysesrevealedthat79transge“cplants、Ⅳereobtained．Northern
hybridizatjonandRT-PCRanalysesindjcatedhatA￡NPRlgenewasoverreXpressedinric ．Thetransgenicplams
werechallengedwithX“小愚07720，砌sor_yz口Ppv．o_跏P(XDD)andM&g舰声。州^Pg—s已n，the^ceba terialblightand
fungalblascpathogens，respectlvely．TheyshowedsignificantlynhancedresistancetoX00andM。gri5配。
Keywords：AfNPRlgene；“ce；Gui99；transformation；diseaseresista ce；X．ory￡nepv．oD，嬲P；M．gris阳
稻瘟病(riceblast)和水稻白叶枯病(ricebacte—
rialbl培ht)是对水稻生产威胁最大的主要病害。在
防治策略上，对稻瘟病、白叶枯病以种植抗病品种为
主。植物系统获得抗性(systemicAcquiredResist一
收稿日期
基金项目
(0007006)
作者简介
’通讯作者
ance，SAR)是一种植物诱导型防卫反应机制，是植
物受物理、化学或生物因子在局部作用后整株表现
出的对较广泛的病原微生物(病毒、细菌、真菌)的抗
性(Durrant等，2004)。这种抗性往往能持续较长
2012一04一08 修回日期：z012—07—04
广阿自然科学基金(桂科自0007006)；广西科技攻关项目(桂科攻0228019—4)[s“pportedbytheNatumlSciencFoundation0fGuarLg妇
theKeyScientl矗candTechnologlcalProjectofGuangⅪ(0228019—4)]
段承杰(197d一)，男，湖南洪江人，博上，副研究员，研究方向为分子生物学，(E_mail)duanq2004@163．com。
冯家勋，男。博f‘，教授，主要从事分子生物研究(E—mail)Jxfeng001@l63．com。
万方数据
6期 段承杰等：转拟南芥A￡NPRl基因增强水稻对水稻白叶枯病和稻瘟病的抗性 801
时间，它显著区别于其它抗病反应：其一，SAR能引
起病程相关(Pathogenesis—Related，PR)蛋白的表达
以及对病原菌有广谱抗性；其二，SAR是一种植物
主动防御机制，从过敏反应到植物系统获得抗性的
产生，发生一系列信号的转导(Baker等，1997；Hunt
等，1996；Smith等，2000)。拟南芥A￡NPRl是导
致拟南芥SAR及局部获得抗性在内的水杨酸(sali—
cylica id，SA)信号传递途径中的一个重要调节因
子(Cao等，1997)。AfNPRl基因在拟南芥中的过
量表达，可导致下游一系列防卫反应基因表达的增
强或PR基因的表达加快，使拟南芥获得对病原细
菌和真菌的广谱抗性，同时转基因植株的生长发育
并不受影响(Cao等，1998；Friedrich等，2001)。
在水稻品种LiaoGeng(LG)过量表达伙NPRl
(NHl)对水稻白叶枯病抗性显著增强，并且抗性可
遗传(Chern等，2005)。Yuan等(2007)将0sNPRl
在TP309中过量表达，提高了对xDo的抗性，同时
发现蕊NPRl与水稻的抗虫性有关。Feng等
(2011)将佻NPRl基因在水稻TP309和桂99中过
量表达，同时提高了水稻对白叶枯病和稻瘟病的抗
性。拟南芥AfNPRl基因最早的异源表达是将之
转入水稻粳稻TP309中，增强水稻对水稻白叶枯病
的抗性(chern等，2001)；Quilis等(2008)进一步发
现AzNPRl基因可同时提高转基因水稻对真菌、细
菌及病毒等植物病原菌的抗性。在番茄(“n等，
2004)、小麦(Makandar等，2006)、柑桔(Zhang等，
2010)、棉花(Parkhi等，20lo)和烟草(Meur等，
2008)等植物中过量表达AzNPRl基因，也增强了
其对细菌和真菌病害的抗性，所以A￡NPRl基因是
培育广谱抗病好作物的热门候选基因。此外A￡一
NPRl基因也被转入罗汉果中，但是转基因罗汉果
的抗病性检测未见进一步报导(杨华等，2011)。本
研究应用根癌农杆菌介导法将A￡NPRl基因导入
广西主栽水稻恢复系桂99中，检测AfNPRl基因
是否能增强桂99对水稻白叶枯病和稻瘟病的抗性。
1 材料与方法
1．1材料
质粒：水稻表达载体pGXN5022，含拟南芥A≠一
NPRlcDNA基因，控制A￡NPRl基因表达的启动
子为Ubiquitin启动子，终止子为NOS，在水稻中的
抗性选择标记为G418；菌株：大肠杆菌DH5a，根癌
农杆菌菌株EHAl05，水稻黄单胞菌水稻变种
13751，水稻稻瘟病菌CHL0742中国菌株；水稻品
种为籼稻恢复系桂99；大肠杆菌培养基：LB(nyp—
tone10g，Yeastextract5 g，NaCl5 g，pH7．o)；根癌
农杆菌培养基：YEB(nyptone5g，Be fxtract5 g，
MgSC)41g，Yeastextract1g，Sucrose5g，pH7．o)；水
稻白叶枯病菌培养基：OB(Peptone2．0g，nyptone
5．0g，Sucrose10．Og，SOdiumglutamate1．Og，Methi—
onineO．1g，K2HP040．72g，KH2P04O．28g，NH4Cl
1．0g，MgCl2·6H201．Og，P+一(E阢～)1ppm，
pH7．O)；稻瘟病菌培养基：淀粉培养基。
1．2方法
1．2．1含A￡NPRl基因的水稻表达载体的构建
拟南芥小苗生长2周后，用BTH(Benz。thiadiazole)
喷雾处理小苗3次后，从小苗中提取总RNA，根据
已发表的拟南芥的A￡NPRl基因的cDNA序列
(GenBank序列号：AY088183)设计一对引物
NPRlU：57一GATCCCGGGTCAATTCATCGGAA
CCTG一37， NPRlD： 57一GCGAGCTCATGACGC—
CAACGATAGAC一3’，在引物的57端分别含有
Sm口I和S口cI位点(下划线部分)，应用RT—PCR扩
增出了全长的A￡NP尺1基因cDNA，将该片段克隆
到经S口fI／Sm以I酶切的载体pBluescriptM13KS
(+)上得重组质粒pGXN5001，经测序验证正确后
再用S口cI／Sm口I双酶切pGXN5001，回收1892bp
的A￡NPRl基因片段，用T4DNA聚合酶补平末端
后再连接到载体pJFNPTII—UbiN的S优位I位点，选
择外源片段正向连接到Ubiquitin肩动子下游的重
组质粒，最终得到含有ATNPRl基因的水稻表达
载体pGXN5022。将该表达载体通过三亲本接合的
方法转入到根癌农杆菌EHAl05。组织培养和转化
的培养基参照文献(乐宁等，2005)。
1．2．2含AzNPRl基因的水稻表达载体对水稻桂
99的转化用Hiei等(1994)报道的用根癌农杆菌
介导的方法对水稻进行转化。具体按乐宁等(2005)
描述的方法进行。
1．2．3转基因植株的PCR检测应用PCR方法检
测所有的G418抗性再生植株。少量提取水稻总
DNA，以引物NPRlU和NPRlD进行扩增。PCR
扩增反应体系：2．5肛L10×PCRbuffer；2I上LdNTP
(2．5mm01／L)；1．o弘L水稻总DNA(1ng／肛L)；1
”LNPRlU(10pmol／i上L)；1扯LNPRlD(10pmol／
肛L)；o．2肛LExTaqDNA聚合酶(5U／肛L)；17．1
万方数据
802 广西植物 32卷
肛LddH20。PCR反应条件：94℃2min变性，94
℃1min，58℃1min，72℃2min进行30个循环，
最后72℃10min。以琼脂糖凝胶电泳检测PCR
产物的大小。
1．2．4DNA斑点杂交提取转A￡NPRl基因的桂
99植株、未转基因的桂99植株的总DNA，取3肛g
DNA经碱变性后点在尼龙膜上，待膜干后进行紫外
交联；用20ng质粒pGXN5022的DNA做为阳性
对照，按同样的方法点在膜上。用A￡NPRl基因作
为探针，用Promega公司的Prime—a_GeneLabe—
lingSystem试剂盒进行标记，方法按试剂盒提供的
程序进行。
1．2．5RT—PCR检测用TRizol试剂提取8株转
AfNPRl基因的水稻总RNA，使用引物NPRlU和
NPRlD进行RT-PCR。详细操作按INVITRO—
GENSUPERSCRIPT7MIIRTKit说明书进行。
1．2．6Northern杂交用TRizol试剂提取转A￡一
NPRl基因的水稻总RNA，总RNA经变性电泳后，
用上行法转移至尼龙膜上。以A￡NPRl基因为探
针，杂交后的X光片用TyphOOn系列(Amersham
Biosciences公司)扫描仪扫描磷屏获得结果。
1．2．7转A￡NPRl基因植株的抗病性检测T1、
T2代的植株抗病性试验于温室盆栽中进行，检测方
法：(1)水稻白叶枯病：接种菌液浓度为0D。。。一
O．001(106cfu／mL)，每个株系剪叶接种30张以上
叶片，接种后14d测量病斑长度。每个试验设3个
重复。(2)稻瘟病：病菌分生孢子悬浮液浓度为1×
106个／mL，加o．2％Tween20作展布剂，均匀喷雾
接种苗期水稻。试验设3个重复，每个重复接种30
张以上叶片。接种后避光保湿24h后置于常规状
态下管理，第7天调查发病情况。并按以下公式计
算病情指数：病情指数一各级发病叶数×各级代表
值／(调查总叶数×最高级代表值)×100。
2 结果与分析
2．1AtNPRl基因表达质粒的构建及其对水稻桂99
的转化
我们将获得的ATNPRl基因正向插入在
Ubiquitin启动子下游的重组质粒命名为
pGXN5022(图1)，A￡NPRl基因置于Ubiquitin启
动子控制下，水稻选择性标记为已通过安全性审批
的G418抗性基因。将重组质粒转化到根癌农杆菌
EHAl05中，得到EHAl05／pGXN5022。
图l含A￡NPRl基因的水稻表达
载体pGXN5022的结构
Fig．1StructureofricexpressionvectorpGXN5022
containingAfNPRlcDNAgene
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1O 1 1
图2转A￡NPRl基因桂99植株的PCR检测
Fig．2PCRanalysisoftransgenicGu 99plants
transformedwithA￡NPRlgene
M．1kbDNAladder；1．阳性质粒(pGXN5022)；
2．未转基因桂99；3—11．转基因株系。
M．1kbDNAladder；1．Positiveplasmid(pGXN5022)；
2．Gui99；3一11．Transgenicplantlin s．
在NB或GI培养基上诱导6～8d时的水稻愈
伤组织(直径约2mm)为转化受体愈伤组织，与根
癌农杆菌EHAl05／pGXN5022在共培养基CC-AS
上共培养3～5d后，转至选择培养基GSl上，10d
后将重新生长出的抗性愈伤挑出到第二轮选择培养
基GS2上继续筛选。愈伤组织在分化培养基上光
照3d后开始出现绿点，1周后就开始陆续分化成小
苗，待再生苗长出根后就将其移到1／2MS壮苗培
养基进行壮苗。当幼苗长至10～15cm时，炼苗3d
后移栽。
2．2转基因植株的分子鉴定
我们共进行了5个批次的转化，得到79株
G418抗性小苗。将获得的抗性小苗以NPRlU和
NPRlD为引物经PCR扩增都得到大约1．9kb的
目标扩增条带(图2)。随机选择3个转基因植株的
PCR产物以NPRlU为引物各做一个测序反应，所
测得序列都与A￡NPRl基因对应部分是完全一致，
证实扩增的PCR产物是A￡NPRl基因，说明A￡一
万方数据
6期 段承杰等：转拟南芥A￡NPRl基因增强水稻对水稻白叶枯病和稻瘟病的抗性 803
NPRl基因已经被导入水稻桂99中。DNA斑点杂
交结果显示阳性对照pGXN5022和经PCR检测阳
性的转基因植株都能产生杂交信号，而未转基因的
水稻不能产生杂交信号，进一步证实外源基因已转
入水稻并已整合到染色体上(图3)。
1 2 3 4 5 6 7 8
● ● ● ● ● ● ●
图3转AfNPRl基因的水稻植株
的DNA斑点杂交检测
Fig．3IdentificationofA￡NP尺1transgenic
plantsbyDNAdotblothybridization
1．阳性质粒(pGXN5022)；2．未转基因桂99；3—8．转基因株系。
1．Positiveplasmid(pGXN5022)；2．Gui99；
3—8．Transgenicplant1ines．
M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 1
图4 RT—PCR检测A￡NPRl基因在
转基因水稻植株中的表达
Fig．4DetectionofthexpressionofAfNPR1
geneintransgenicplantsbyRT—PCR
M1kbDNAladder；1．阳性质粒(pGXN5022)；2．未转基因桂995
3．未加反转录酶，对应第4泳道中的转基因植株；4-11．转基因株系。
M．1kbDNAladder；1．PositiveplasmidpGXN5022；
2．Gui99；3．Noadditionofreversetranscriptase，RNA
usedaslane4；4一l1．Transgenicplant1．nes．
RT—PCR的检测结果表明，转基因植株均能给
出约1．9kb的RT—PCR产物，与用阳性质粒
(pGXN5022)为模板所扩增出的DNA带大小一致，
而对照非转基因植株却不能扩增出此带(图4)，说
明外源AfNPRl基因已在转基因水稻细胞内表达。
Northern杂交表明在转基因植株中A￡NPRl基因是
过量表达的，但各转基因植株之间表达水平有差异，
可能与外源基因整合到染色体的位置有关系，非转基
因植株中没有检测到A￡NPRl基因的表达(图5)。
2．3转A州PRl基因水稻植株的抗病性检测
在对转基因桂99进行水稻白叶枯病的抗性检
1 2 3 4 5 6 7 8
囊一一．薅■奠舞俐川
图5 Northern杂交检测A￡NPRl
基因在转基因水稻植株中的表达
Fig．5Northernhybridizationanalysisofexpression
ofA￡NP尺1geneintransgenicplants
1．未转基因桂99；2—8．转基因株系。
1．Gui99；2—8．TransgenicplantIines．
测过程中，由于转基因桂99的株系较多、且出苗批
次和收获时间不一致，我们采用分批剪叶接种盆栽
转基因植株的办法。首先检测了T1代的N1和N2
这两个株系，对其各单独接种了12个单株，病斑长
度均比桂99显著降低了50％以上。第2次接种的
11个T1代转基因株系的病斑长度也比桂99显著
降低。第3次接种了34个T1代和11个T2代纯
合转基因株系，T1代中30个株系对水稻白叶病菌
的抗性显著增强；T2代11个株系对水稻白叶枯病
的抗性均显著增强。第4次接种了14个T1代和1
个T2代(G60)转基因株系，T1代中8个株系的
抗性显著增强，T2代G60的抗性显著增强。第5
次接种了7个T1代和2个T2代株系，它们的抗性
均显著增强。总计，共检测了68个T1代转基因株
系对水稻白叶枯病的抗性，其中有58个株系的抗性
显著增强，占85％；检测的14个T2代纯合株系对
水稻白叶枯病的抗病性均显著增强，占100％。
对稻瘟病的’抗性检测，第1次实验检测了T1
代的N1和N2这两个株系，它们的抗病性比桂99
提高了约33％。第2次检测了49个T1和T2代株
系，其中27个株系对稻瘟病的抗性均显著增强，占
检测株系的55％。
根据以上结果，我们随机选择了35株T1代转
基因植株同一批次进行了水稻白叶枯病及稻瘟病的
抗性检测。结果发现：21株(占60％)转基因植株同
时抗两种病害，85．7％的转基因植株对水稻白叶枯
病的抗性显著提高，65．7％的转基因植株对稻瘟病
的抗性显著增强；11株转基因植株只对一种病害的
抗性显著增强：9株(占25．7％)只对白叶枯病的抗
性显著增强，2株(占5．7％)只对稻瘟病的抗性增
强；3株(占8．6％)对这两种病害的抗性没有显著增
强(表1，图6)。
万方数据
804 广西植物 32卷
表1 Tl代转基因植株对水稻白叶枯病及稻瘟病的抗性
Table1 ResistanceoftransgenicplamsofT1generationtoX． o删嬲epv．o删嬲eandM． gri阳口ingreenhouse
注：“R”为经TTEsT显著性分析为抗性增强；“s”为经TTEST显著性分析为抗性没有增强。
Note：“R”representsthattransgenicplantsenhancedresistancetodiseasescomparedtowildtypeplantsby’r-Testsignificantanalysis；“S”re—
presentsthatransgenicplantsdidnotenhanceresistancetodiseasescomparedtowildtypeplantsby1乙Testignificantan lysis．
A 1 2 3 B 1 2 3
图6转基因植株的水稻白叶枯病
和水稻稻瘟病的发病情况
Fig．6Diseaseseve“tiesoftransgenicriceT1
plantschallengedwithXooand』坦grisP以
A．接种水稻白叶枯病菌14d后转基因植株叶片上的症状；
B．水稻接种稻瘟病菌后叶片上的症状；1．桂99；2．Nl；3．N2。
A．SymptomsofA￡NPRltransgenicplantlines14days
postinoculationwithXoo；B．ThesymptomofA￡NPRl一
overexpressinglinesinGui997 dayspostinoculationwith
^to，，船P；1．Gui99；2．Nl；3．N2．
3 结论与讨论
根癌农杆菌介导水稻的遗传转化自1994年以
来已获得了巨大的成功，但也还存在着两个方面的
问题：一是转化的周期太长，二是籼稻的转化频率普
遍较粳稻为低，许多籼稻品种转化困难，有些甚至不
能成功转化(Hiei等，1994)。我们成功地将拟南芥
A￡NPRl基因转入栽培籼稻恢复系桂99，得到79
株转基因植株，转化频率达到了10．91％，对于籼稻
品种来说，这是一个高效的遗产转化系统。
A￡NPRl基因具有正向调控拟南芥的系统获
得抗性的功能，系统获得抗性能赋予植物对病原体
产生广谱的抗性(Durrant等，2004)。我们获得的
转基因株系T1代中有60％同时对水稻白叶枯病菌
和稻瘟病菌表现出抗性显著增强；85．7％的转基因
植株对水稻白叶枯病的抗性显著提高，65．7％的转
基因植株对稻瘟病的抗性显著增强。转A￡NPRl
的水稻对水稻白叶枯病抗性提高的株系比对稻瘟病
抗性提高的株系多20％，同时转基因株系也表现出
更强的抗白叶枯病特性，这可能与不同病菌的侵染
机制和生理小种有关，因为植物针对细菌病害和真
菌病害所产生的防卫反应蛋白是不同的，具体的相
应抗性蛋白的表达强度需通过Northern杂交、定量
PCR或Western杂交来确定。8．6％转基因植株对
水稻白叶枯病或稻瘟病的抗性并无显著提高，这可
能是由转入的外源基因A￡NPRl沉默造成的，这也
是做转基因经常出现的情况。引起基因沉默的原
万方数据
6期 段承杰等：转拟南芥A￡NPRl基因增强水稻对水稻白叶枯病和稻瘟病的抗性 805
因：(1)外源基因多拷贝插入到染色体DNA同一位
点上导致的转录失活(Assaad等，1993)；(2)转基因
片段插入水稻染色体的异染色质区或是插人常染色
质区与异染色质区的间隔区所造成的转基因的位置
效应，具体的原因需要通过对转入的A￡NPRl基因
进行基因组定位和确定有多少个插入拷贝数才能来
确定(Mlynarova等，1994)。
尽管Chern等(2001)已在水稻粳稻TP309中
过量表达A￡NP尺1基因增强其对水稻白叶枯病的
抗性，Quilis等(2008)发现转AfNPRl的日本晴增
强了对植物病原细菌、真菌和病毒的抗性，但他们的
转基因水稻亲本都是广泛用于实验的一个水稻品
系，并不是实际生产用的水稻品系。与之相比，我们
转A￡NPRl基因的桂99同时对水稻白叶枯病和稻
瘟病提高抗性，与前两个工作结果是一致，但我们用
的转基因亲本桂99是广西的主要栽培品种。转
A￡NPRl基因植株的外源基因在多代中经检测能
稳定遗传，转基因植株对病源微生物的抗性在多代
多批次的温室盆栽试验也是一致的，它们的抗病性
也能稳定遗传，所以转A￡NPRl桂99为水稻的抗
病育种提供新种质。
转AfNPRl能使农作物增强对病原微生物广
谱的抗性，拟南芥NPRl基因的同源基因也具有类
似作用(Quilis等，2008；Parkhi等，2010)。与此相
反，大部分抗病基因是特异性针对某一种病原物或
某一生理小种才有作用，转入此类基因也只会使作
物产生针对特异病原物的抗性。因此将A￡NPRl
或它在其它植物中的同源基因应用于改良作物的抗
病性是很有前景的一条途径。
致谢 中国科学院遗传与发育生物研究所储成
才提供载体；华南农业大学潘庆华提供稻瘟病茵茵
株；广西南宁市五塘农技推广站提供桂99水稻种子。
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万方数据
转拟南芥AtNPR1基因增强水稻对水稻白叶枯病和稻瘟病的抗性
作者： 段承杰， 罗荡平， 罗雪梅， 冯家勋， DUAN Cheng-Jie， LUO Dang-Ping， LUO Xue-Mei， FENG
Jia-Xun
作者单位： 亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室,南宁530005;广西大学生命科学与技术学院,南宁
530005
刊名： 广西植物
英文刊名： Guihaia
年，卷(期)： 2012,32(6)
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引用本文格式：段承杰.罗荡平.罗雪梅.冯家勋.DUAN Cheng-Jie.LUO Dang-Ping.LUO Xue-Mei.FENG Jia-Xun 转拟南芥AtNPR1基
因增强水稻对水稻白叶枯病和稻瘟病的抗性[期刊论文]-广西植物 2012(6)