全 文 ：广 西 植 物 Guihaia 26(5)：479— 482 2OO6年 9月
农杆菌介导的抗茵肽 A基因转入
沙田柚影响因素研究
韩美丽1，陆荣生1，吴耀军2，杜晓莉1
(1．广西农业科学院 植物保护研究所 ，广西 南宁 530007；2．广西林业科学院，广西 南宁 530001)
摘 要：以沙田柚上胚轴为对象 ，进行了农杆菌介导的抗菌肽 shivaA基因转人沙田柚影响因素研究。研究结
果表明：转化 中抑菌抗菌素以羧苄青霉素为首选 ，最佳转化条件为：菌液稀释至 OD6oo0．5，浸泡时间 10 min，
共培养 3 d，卡那霉素起始选择浓度 5O btg／mL。农杆菌再悬浮液与共培养基中加人 150 t~mol／L阿魏酸可提
高转化频率。PCR与 Southern杂交证明，外源基因已转人沙 田柚基因组中。
关键词 ：农杆菌 ；沙 田柚 ；转化
中图分类号 ；Q943．2 文献标识码：A 文章编号：lOOO-3142(2006)05—0479-04
Studies on factors influencing ShivaA gene
transformation mediated’ Agrobact~ St-O O l by D ermm
in Citrus grandis Osbeck CV．Shatianyu
HAN Mei～li ，LU Rong～sheng ，WU Yao-jun ，DU Xiao-li1
(1．Institute of Plant Protection，Guangxi Academy of Agricultural Sciences，Nanning 530007，
China；2．Guangxi Forestry Research Institute，Nanning 530001，China)
Abstract：Transformation and regeneration of Citrus grandis plants were studied by Agrobacterium—mediated．
Transgenic plants with ShivaA gene had been obtained．The carbenicillin was better to control Agrobacterium
growing after explants were infected．Epicotyls fragment were infecting for 1 0 min as OD600 of Agrobacterium
suspending liquid is 0．5．Epicotyls fragment were CO—cultured with Agrobacterium for 3days．The transforma—
tion frequency of explants was promoted when 1 50 btmol／L ferulic acid was added in Agrobacterium suspension
liquid＆ CO—culture medium．It was useful for anti—Kan positive shoot producing when initial concentration of
kanmaycin was 5O btg／mL．Foreign gene is proved going to C．grandis by PCR ＆ Southern blot detective．
Key words：Agrobacterium；G．grandis Osbeck CV．Shatianyu f transformation
沙 田柚是我国主要栽 培柑桔 品种之一，近年来
随着种植面积不断扩大，生产上对其品质与抗病能
力的要求也不断提高。由于沙田柚为多年生木本植
物，常规方法进行新品种培育时间长，难度大。遗传
转化技术的出现为沙田柚新品种培育研究提供了新
方法。常用的遗传转化方法主要有生物法、物理法、
收稿 日期：2005—05-23 修回日期：2005-12-08
基金项 目；国家科技攻关项 目 (国攻 2000-13073)；广西科技攻关项 目 (桂科攻 0014002)；广西农科院科技发展基金 (2003002)
[Supported by National Key Technologies Research and Development Program of China(2000一D073)；Key Technologies Research
and Development Program of Guangxi(0014002)；Development Foundation for Science and Technology of Guangxi Academy of
Agricultural Sciences(2003002)]
作者简介：韩美丽(1963一)，女，陕西铜州市人，高级工程师，博士，从事生物技术研究，(E-mail)lurong@public．nn．gx．cn。
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化学法 ，在这 3种方法中，以农杆菌介导的转化方法
应用最为广泛 ，所取得 的转基因植株最多(闰新甫，
2003；贾士荣等 ，1996)。抗菌肽是一种小分子蛋 白
质，具有较强的抗菌活性，体外试验表明其对细菌性
病害有较好的抑制作用 ，已有抗 菌肽基 因转入马铃
薯、大白菜等作物的报道(方宏筠等，1999；邵志芳
等，2003；陈善春等，1997)。柑桔遗传转化研究起始
较晚，国内外已有多起柑桔属植物转基 因成功的报
道 ，但转入基因多为报告基因及选择基因，目的基因
转入的公开报道很少(Pena等，1997；Rogers等，
1985；Kaneyoshi等 ，1994)，尚未 见抗 菌肽 shivaA
基因转入沙田柚的公开报道。本研究 以沙田柚上胚
轴为对象，抗菌肽 shivaA基因为目的基因，农杆菌为
载体 ，进行了遗传转化研究 ，成功地将抗菌肽 shivaA
基因转入了沙田柚 ，进一步的应用正在研究。
1 材料与方法
1．1植物材料
取收集 的沙 田柚 (Citrus grandis(L)0sbeck
ev．Shatianyu)种子 ，经 常规方法 消毒 ，播种 于 1／z
MS固体培养基中，25～3O℃黑暗下萌发待用。
1．2农杆菌菌株与培养
农杆菌菌株为 LBA4404，含双质粒表达载体
pTYB1(由美国麻萨诸塞州大学遗传实验室提供)。
载体 pTYB1上插有 35s启动子驱动的抗菌肽 shivaA
基因及筛选标记基因新霉素磷酸转移酶基因(NTP一
Ⅱ)，shivaA基因全长 186 bp。该质粒图谱如图 1。
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LBEc Bm KP Hd RB
图 1 质粒 pTYB1图谱
Fig．1 Schematic representation of the pTYB1
农杆菌固体平板培养基为 LB附加卡那霉素 3O
~g／mL，四环素 10~g／mL。转化前挑单菌落接种于
5O n 液体培养基中，28~C黑暗下 120 r／min振荡培
养至对数期(OD6。一O．8～1．0)，然后 3 000 r／rain离
心 10 min，除去上清液，再用悬浮液悬浮待用。
1．3转化方法
将实生苗上胚轴切0．5 cm长片段，在农杆菌悬
浮液中浸泡 1O～15 min，滤纸吸去多余的菌液，放
置培养基上，26~28℃黑暗下共培养 2～3 d，转至选
择培养基上选择培养 。
转化中所用悬浮培养液、共培养基、分化培养基
的基本成分均为 MT，上胚轴分化选择培养基附加
成分为 BA 2．0 mg／L+Km 70 mg／L+Car 300～
500 mg／L，生根 培养基附加 NAA 0．5 mg／L，Km
70 mg／L。培养过程均在 26～28℃光照下进行 ，光
照强度 1 400 lx，光照时间 12 h／d。
1．4测定 方法
转化频率( )测定：上胚轴在分化选择培养基
上连续选择 60 d，所获得的具卡那抗性芽的外植体
占感染总外植体的百分率 。
植物 DNA 及 质 粒 DNA 提取 分 别采用 SDS
法 、碱裂解法 。
PCR测定 ：PCR反应采用 25 L反应体系。反
应体系 中含 ：植 物 DNA 20 ng，dNTPS 200#mol／
L，Primer1与 Pruimer 2各 0．1#mol／L，TaqDNA
酶 1单位，1O×PCR缓冲液。样 品 DNA先 94℃变
性 6 min，然后经 94℃ 1 min、56℃ 1 min 30 S、72℃
1 min 30 S共 35个循 环，最后 72℃延伸 8 min。扩
增产物在 1．6 琼脂糖凝胶上电泳 ，并在紫外透射
仪上 分 析 结 果。引 物 Primer1：5，-3 TAT TTT
TAC AAT TAC AAA CAA CAA Primer 2：5 一3
GGT GTG GCT AGG ACT GAT GGA GTG。预
期扩增长度为 186bp。
Southern blot杂交采 用 Dig成套试剂盒试剂
及反应条件。植物 DNA 经 BarnH I及 HindⅢ 酶
切消化后 ，4℃ 下，0．8 琼脂糖上 电泳 12 h，经 变
性 ，转移至硝酸纤维素膜上。烘干膜后进行预杂交、
杂交及显色。杂交带预期位点为 536 bp。
2 结果与讨论
2．1不同种类、浓度抗菌素对沙 田柚上胚轴不定芽
发生率影响研究
转化选择中需加入抗菌素以抑制农杆菌生长，
抗菌素在抑制农杆菌生长的同时 ，对外植体不定芽
形成也会产生一定影响(Lin等，1995)。因此，确定
抗菌素的使用种类、浓度对转化研究的开展很有必
要，我们选择了羧苄青霉素、头孢噻肟钠、头孢曲松
钠进行了试验 ，结果见表 1。
从结果看出，不同浓度羧苄青霉素、头孢噻肟
钠、头孢曲松钠对沙田柚上胚轴不定芽形成影响不
同。羧苄青霉素在所用浓度范围内的加入对外植体
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5期 韩美丽等 ：农杆菌介导的抗菌肽 A基因转人沙田柚影响因素研究 481
不定芽发生率无明显影响。头孢噻肟钠加人在浓度
500 mg／L以下时，对不定芽发生率无影响，当加人
量达 600 mg／L时，上胚轴不定芽发生率有明显的
下降，且少量外植体发黄。头孢曲松钠浓度在 200
～ 3OO mg／L时 ，不定 芽发 生率无 变 化 ，400～600
mg／L时，不定芽发生率明显下降。
综上，沙田柚转化以羧苄青霉素为首选 、头孢噻
肟钠次之 ，头孢曲松钠不宜采用。
2．2菌液浸泡浓度与时间对转化频率的影响
一 定密度农杆菌充分附着于外植体伤口表面是
转化成功的必要条件，为了达到这一目的，外植体感
染时合适的菌液浓度与浸泡时间尤为重要。植物伤
口处细胞对农杆菌较为敏感 ，浸泡时间过长，会导致
外植体褐化死亡，难以得到抗性芽；浸泡时间过短，
农杆菌不能充分地附着于表面，转化频率受到影响。
从表 2可看出，沙田柚上胚轴转化频率高低与
农杆菌菌液稀释浓度与浸泡时间有明显关系。菌液
OD 值为 0．1时，各处理均无转化芽出现；OD ∞值
为 0．3时 ，浸泡 5、10 rain的二个处理无转化发生 ，
浸泡 20 rain的处理转 化频率达 2．0 ；OD 值 为
0．5时，浸泡 10 rain，转化频率可达 11．0 ，浸泡时
间延长至 20 min时，转化率下降，且外植体有死亡
发生；OD 。。值为0．7时，浸泡时间 5 rain时，转化频
率达 6．2 ，浸泡时间 1O～20 min，无转化发生，且
15、20 rain二个处理外植体上农杆菌附着过多，移
人抑菌培养基后一个星期，因细菌难于控制，全部腐
烂死亡。因此 ，最适 稀释浓度 以 OD 0．5、浸泡时
间 10 rain为宜。
表 1 不同浓度抗菌素对沙田柚上胚轴不定芽发生率的影响
Table 1 Effect of antibiotics on adventious shoot formation of epicotyls
表 2 茵液浸泡浓度与时间对转化频率的影响
Table 2 Effect of bacterial density& infection time on transformation frequency
菌液浓度 Bacterial density(OD6oo) 0．1 0．3 0．5 0．7
侵染时间 Infection time(min) 5 10 15 20 5 10 15 2O 5 10 15 20 5 10 15 20
转化频率 Transformation frequency(％) 0 0 0 0 0 0 1．1 2．0 1．7 11．0 8．9 5．8 6．2 0 0 0
各处理外植体数均为 300。 No．of explants per treatment is 300
表 3 酚类化合物种类、浓度对外植体抗性芽产生的影响
Table 3 Efect of phenolic compounds
on frequency of Kmr shoot
酚类化合
物浓度
Concen-
tratlon
(／~mol／l )
转化频率 Transformation frequency(％)
乙酰丁 邻苯二 酚 阿魏酸 羟基苯甲酸
香酮 o-Dihydro—Trans-ferulic wHydroxy—
As xybenzene acid benzoic acid
2．3酚类化合物种类、浓度对外植体抗性芽产生的
影响
许多研究表明，酚类化合物的添加对农杆菌向
植物细胞的附着、转移有较大的促进作用，不同植物
所 需 的作 用 浓 度 有 较 大 的 差 异 (Sangwan等，
1993)。我们在农杆菌菌液感染液与共培养基中添
加了乙酰丁香酮、阿魏 酸、邻苯二 酚、羟基苯 甲酸 4
种酚类化合物，以研究酚类化合物对沙田柚转化的
影响，结果见表 3。
从结果可看 出，酚类化合物种类对转化的影
响差别较大，对转化频率的促进作用大小依次为
阿魏酸 、乙酰丁香 酮、邻 苯二酚与羟基苯甲酸。阿
魏酸最适浓度为 150 tLmol／L，转化频率达 13．6 ，
1 4 8 9 2 5 一
3 4 5 7 6 1 一 n
O 8 1 6 7 1 一b
一～一～nL
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乙酰丁香酮最适浓度 为 1O0~lmol／L，转 化频率达
11．1
2．4卡那霉素 (Km)起始浓度高低对沙 田柚上胚轴
抗性芽产生率的影响
转化选择过程中，选择剂起始浓度过高 ，转化细
胞抗性基因尚未充分表达，易于在选择过程中大量
死亡 ，降低转化率 ；起始浓度过低 ，未转化 的细胞有
可能未经选择剂破坏而发生 “逃避”现象 ，导致假转
化体的大量发生。我们在选择的最初 7 d对 Km浓
度做了不同程度的降低，7 d后均移人 Km 70 mg／L
的选择培养基上，持续选择至60 d，以研究Km起始
浓度高低对转化频率的影响。
从结果看出，感染后 30 d抗性芽发生率高低与
Km起 始浓度成反 比，浓度越高 ，抗性芽获得率越
低 。随着选择时间的延长 ，各处理的抗性芽数量发
生变化。至感染后 60 d，各处理抗性芽发生率均有
不同程度下降。Km起始浓度较低的处理抗性芽下
降率高于其它处理。Km起始浓度为 0时，感染后
60 d抗性芽发生率 只有 0．5 ，比感染后 30 d下降
36．3 ；起始浓度 50 mg／L的处理，下降率只有
l1．0 ，抗性芽所 占比例高 于 CK。因此，Km 起始
浓度以50 mg／L为宜，过低则假抗性芽太多，会给
表 4 起始卡那霉素浓度对抗性芽产生率的影响
Table 4 Effect of initial concentration of kanmaycin on frequency of Kmr shoot
卡那霉索浓度 Concentration of Km (mg／l ) 0 30 40 50 60 70(CK) 80
外植体数(个)No．of explants 350 320 330 345 350 350 365
感染后 30 d抗性芽发生百分率 ( ) 38．0 28．1 23．9 21．4 17．4 14．8 8．5
Rate of explants with Kmr shoot after culturing 30 days
感染后 60 d抗性芽发生百分率取 ( ) 0．5 2．5 4．8 10．4 10．3 8．0 3．3
Rate of explants with Kmr shoot after culturing 60 days
以后的进一步抗性鉴定带来不必要的麻烦。
2．5 Km对无菌苗生根的影响与抗性植株的初步鉴定
Km对植物生根有抑制作用 (王关林等，1998)，
利用这一特点，在生根培养基 中加入不同浓度的
Km，以确定无菌苗生根对 Km的敏感浓度。在此基
础上，对所得的抗性芽作进一步的选择，结果见表 5。
从表 5可看出，生根培养基 中添加不同浓度
Km时，无菌苗生根受到影响，当 Km 浓度为 7O
mg／L时，生根被完全抑制，即使再移人无 Km的生
根培养基也不再有根产生，最后植株发黄、死亡。因
此 Km 70 mg／L为沙田柚抗性无性系生根选择浓度。
切取所获得的沙田柚抗性苗，培养于含 Km 70
mg／L的生根选择培养基上，生根率达 78．4 ，对照
则为 0，可以基本认定在生根选择培养基上正常生
根的抗性苗为转化植株 。
表 5 卡那霉素对无菌苗生根的影响
Table 5 Effect of kanmaycin on seedling rooting
2．6转基因无性系的 PCR与 SouthernBlot结果分析
从所得的生根抗性苗 中，随机选择 7株进行
PCR检测 ，有 5株在所扩增的条件下，在 186 bp位
置扩增出一条可分辩的 DNA带 ，对照则无。
将这 5个 PCR阳性植株进一步进行 Southern
杂交分析，在预期的536 bp位置出现杂交带。证实
基因已完全转入，并整合到植物基因组中。进一步
的抗病试验仍在进行之中。
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5期 余小芳等：Hystrix patula与Ps oroPg Pr 口libanotica属间杂种的细胞学研究 575
表 l H．patula和 P．1ibanotica和杂种 Fl花粉母细胞减数分裂中期 I染色体配对
Table 1 Chromosome pairing at M I of PMCs in H．patula，P．1ibanotica and their Fx hybrids
与 P．1ibanotica同源，即 H．patula含有 P．1iban—
otica的 St染色体组。
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