全 文 ：广 西 植 物 Guihaia 24(1)：49— 51 2004年 1月
水稻谷蛋白启动子驱动下的 ipt基因
在转基因烟草中的表达
申佩弘，乔越美，黄 胜，武 波
(广西大学生命科学与技术学院，广西南宁 530005)
摘 要：利用农杆菌系统介导 ，采用叶盘转化法 ，将在水稻谷蛋白启动子驱动下的外源 ipt基因导人烟草植株
中，经过抗生素筛选、PCR与测序分析检测 出转基因植株 。成熟的转基因烟草种子经过 ELISA细胞分裂素试
剂盒检测 ，发现 iPAs含量为对照的 2．43倍 ，此外，种子的重量也增加了 7．8 。
关键词：ipt基因；水稻谷蛋白启动子；种子；iPAs
中图分类号 ：Q943．2 文献标识码：A 文章编号：1000—3142(2004)01-0049—03
lpt gene dri,len under gluteline promoterP v a~ 0f t
rice seed expressed in transgenic tobacco plants
SHEN Pei—hong，QIAO Yue—mei，HUANG Sheng，W U Bo
(College of Life Science and Technology，Guangxi University，Nanning 530003，China)
Abstract：An ipt gene driven under the gluteline promoter of rice seed was introduced into tobacco plants by
A．tumefaciens mediated transformation．After selected using antibiotics，PCR and sequencing analysis con—
firmed that ipt gene has integrated into the genomes of the tobacco plants．Cytokinin level in seeds waS deter—
mined bv EU SA kit．The result showed that the iPAS 1evel of transgenic seeds iS about 2．43 fold than CK．at
the same time，the weight of seed has increased by 7．8 percent．
Key words：ipt gene；rice gluteline promoter；iPAs；seed weight
Ipt基因是农杆菌A．tumefaciens Ti质粒上的
一 段序列，编码异戊烯基转移酶，该酶是调节、催化
CTKs合成的第一步关键酶，它能催化异戊烯基焦
磷酸腺苷的分解，产生异戊烯基单磷酸腺苷，也就是
所有细胞分裂素的前体。到 目前为止，该基因已被
广泛克隆并应用于调控植物体内 CTKs的含量，或
改良农作物品种(于晓红等，2000)，利用不同启动子
驱动 ipt基因在植物中的表达也有过不少研究，转
基因株大多表现为细胞分裂素含量增加、叶片延缓
衰老、外部形态发生变异、生理代谢受到影响等
(Anne和 Jacques等，2002；Sa等，2002；Hans和
Rhin等，2001；耿飒等，2000)。
由于人口的增长，自然资源的短缺，如何培育出
优良的农作物品种，提高农业生产率已成为众多科
学工作者研究的课题。植物基因工程便是一条方便
而有效的途径，我们采用了种子专一性表达启动子
驱动 ipt基因在模式植物烟草中的表达，以研究能
否使基因在种子中表达而提高种子重量 。
1 材料与方法
1．1材料
植物材料：普通烟草 K326种子，普通水稻种子
桂 99，经常规方法消毒后 ，播种于 MS培养基上 ，萌
收稿 日期 ：2003—0卜O8 修订 日期 ：2003—04—22
基金项目：教育部高等学校青年骨干教师基金；广西十百千人才工程专项经费(2000206)。
作者简介 ：申佩弘(1977一)，女 ，湖南邵东人 ，硕士生 ，分子遗传学方 向。 *为通讯联 系人
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5O 广 西 植 物 24卷
发待用。菌株及质粒：pBI 121质粒，根癌农杆菌
LBA 4404菌株，帮助质粒 pRK 2073，Ecoli菌株
DH 5a，含有 ipt基 因的 pGEMT-easy质粒 (由北京
大学生命科学院学院林忠平教授惠赠)。试剂盒：
pGEM-T vector试剂盒购于 Promega公司，ELISA
检测试剂盒购于中国农业大学 。主要酶类包括限制
性内切酶、Taq酶、连接酶，均购于 TaKaRa公司。
1．2方法
1．2．1植物总DNA的提取 参考文献(王关林等，
1982)。
1．2．2细茵质粒DNA的提取、转化、连接、酶切等均
参照文献(Sambrook等，1982)。
1．2．3启动子的 PCR扩增 采用 SDS法微量提取
水稻总DNA，参照 GeneBank上已报道的水稻谷蛋
白启动子序列，设计了一对引物，上游引物为 5f-
agccccgggtgagataaaggctcttgc一3 ，下游弓I物为 5 r_ata—
agcttaggtcatagggagaggga一3 ，两引物分别含有 SmaI
与 HindI酶切位点。94℃ 1 min，94℃ 30 S，52℃
3O S，72℃ 2 min，3O个循环后，72℃ 延伸 3 min。
PCR扩增出 880 bp左右的目的条带，试剂盒 回收
后，克隆到 pGEM—T vector上 。
1．2．4 ipt基因的 PCR扩增 根据 ipt基因序列设
计了如下引物 ，上游 引物 为 5 r_acagatctattcgattag—
gatccatg一3 ，其中含有 BglⅡ位点，下游引物为 5『_
acgagctctaatacatccgaacgga一3 ，含有 SacI酶切位点。
并以林忠平教授提供的pGEM—T easy质粒为模板，
进行扩增，PCR反应条件为 95℃，lmin~94℃，30
S，50℃，30 S，72℃，l min，循环数为 30；1 min 30
S；72℃ ，3 min。 、
1．2．5普通烟草 K326的遗传转化 将烟草种子用
0．1％的升汞消毒 10 min，无菌水冲洗 3遍，接种于
1／2 MS培养基上，3周后取幼嫩的烟草无菌苗叶
片，用 lO NaClO消毒 5 min后，无菌水清洗2～3
遍 ，切成 0．2～0．5 cm。大小 的方块 ，在含 目的基 因
的LBA4404菌液中感染 3～5 min，无菌滤纸吸干，
接种于共培养基上，25℃暗培养 4 d后，再将外植
体转接于含有 50 mg／L卡那霉素、100 mg／L头孢
霉素的分化培养基上进行筛选培养，得到的 4株抗
性株移栽于大田中。
1．2．6植物细胞分裂素的提取及 ELISA检测 取 l
g转 ipt基因烟草的成熟种子(每株取 0．25 g)，在
液氮中研磨成粉末，加入 4mL甲醇提取缓冲液，混
匀 ，于 4℃下提取 4 h，离心后取上清液 ，经 C l8处
理后的样品液冷冻干燥，再用 2 mL样品稀释液溶
解 。
2 结果
2．1水稻谷蛋白启动子 PCR扩增结果
经过测序分析，与 GeneBank上报道的相比较
具有 99 的同源性，其登录号为(Y00687．1)。
2．2通过 PCR扩增 出的 ipt基因片断(740 bp)
经电泳回收后，连接到 pGEM T—vector上，测
序分析该序列与 GeneBank上报道的 ipt基因序列
(登录号为 X53945)比较具有 100 的同源性。
2．3植物表达载体的构建
将载体 pBI 121与克隆在 T-vector上的启动子
分别用 HindⅢ与 Sma I进行双酶切，连接两外源片
段，此载体命名为 pBI 121-I。用 SmaI与SacI两内
切酶将 ipt基因与 pBI 121一I进行酶切，连接后获得
植物表达载体 pBI 121一Ⅱ(图 1)
M 1 2
图 1 组质粒 pBI 121-Ⅱ及其酶切电泳图
Fig．1 The agarose gel electr0ph0resis of the
recombination plasmid pBI 1 2 1一Ⅱ and its
digestion by Sma I and HindⅢ
M．1 kbmarker；I．重组质粒 pBI 121一I ；2．重组
质粒 pBI 121一I的 SmaI和 Hind lI双酶切 。
1．The recombination plasmid pBI 121一I；2．The plasmid
pBI 121一I degested by SmaI and Hind II．
2．4转基因株的 PCR检测及序列分析
CTAB法微量提取烟草抗性株的总 DNA，以水
稻谷 蛋 白启动子 上游 引物 5，_agcccgggtgagataaag—
gctcttgc一3 和 ipt基因下游引物 5，_acgagctctaatacat—
tccgaacgga一3 对转基 因抗性株与对照同时进行 PCR
扩增(图 2)，从 1、2、3、4号株中都扩增出了 1．6 kb
(gluteline promoter+ipt)的带，在对照 中没有扩增
出相应 的带，回收 l号株 的 目的条带，克隆到
pGEM—Tvector上 ，送 至宝生物公司测序，结果表明
ipt基因已整合到烟草的基因组中。
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1期 申佩弘等：水稻谷蛋白启动子驱动下的ipt基因在转基因烟草中的表达 51
2．5成熟种子的重量及其 iPAs含量分析
烟草成熟种子的重量如表 1，转基因种子的平
均千粒重为 0．082 g，对照的平均千粒重为 0．076 g，
转基因种子重量 比对 照的增加了 7．8 ，经过统计
学分析相差显著。
表 1 成熟种子的千粒重
Table l The weight of tobacco seed(g／1000 grains)
⋯
号 z号 s号 号
经过 ELISA检测 ，每克对照种子的 iPAs含量
为 166．7 pmol，每 克转 基 因种 子 的 iPAs含量 为
405．03 pmol，转基 因种子的 iPAs含量与对照相 比
增加了 2．43倍 。
1OKb一
2Kb。-一
1．5Kb一
图 2 转基因烟草基因组的 PCR检测
Fig．2 PCR analysis of genome
of transgenic tobacco
M．1 kb marker；1、2、3、4．转基因株 PCR检测的
“启动子+ipt基因”片段；CK．阴性对照。
1、2、3、4．“启动子+ipt基因”amplified by PCR from
transgenic tobacco，CK．Negative contro1．
3 讨 论
在对阳性株进行检测时，单采用 ipt基因的引
物对植物总 DNA进行 PCR扩增时 ，在对照中也有
相应的740 bp的条带出现，而用水稻谷蛋白上游引
物与 ipt基因的下游引物进行 PCR检测时，对 照中
没有相应的 1．62 kb(启动子十ipt基因)的电泳带
出现，进一步测序证明外源基因已导入烟草植株中。
在此研究进行的同时，我们还研究 了 ipt基 因分别
在椰菜花叶病毒启动子(CAMV35S)与水稻醇溶蛋
白启动子驱动下的表达，发现 ipt基因在组成形启
动子 35 S驱动下的表达使烟草外形发生变异 ，叶片
卷缩，分枝较多 (未在此文 中做说明)，结果与文献
(Faiss等 ，1997)报道的相同。而该基因在种子特异
性表达启动子(水稻醇溶蛋白启动子)驱动下的表达
使得烟草种子的 iPAs含量提高了4．73倍，种子的
重量增加了 12．8 (另文发表)。这些实验结果表
明利用组织特异性表达启动子驱动 ipt基 因在植物
中的表达以提高种子重 量是可行 的，也为下一步如
何利用该基因提高一些具有经济价值的农作物的产
量提供了可靠的依据。
参考文献 ：
王关林 ，方宏筠．1982．植物基 因工程原理与技术．
Anne Guivarc’h，Jacques Rembur，Marc Goetz，eta1．2002．
Local expression of the ipt gene in transgenic tobacco
(Nicotiana tabacum L．CV．SR1)axilary buds establishes
a role for cytokinins in tuberization and sink formation[J]．
Journal of Experimental Botany，53(369)：621—629．
Faiss M，Zalubilova J，Strnad M，et a1．1997．Conditional
transgenic expression of the ipt gene indicates a function
for cytokinins in paracrine signaling in whole tobacco plants
[J]．Plant J，12(2)：401—415．
Geng S(耿 飒)，Ma M(麻 密)，Li GF(李国风)．2000．
Effects on fertility in transgenic tobacco by localized ex—
pression of ipt gene(ipt基因定位表达对转基因烟草育性
的影响)[J]．Acta Botanica Sinica(植物学报)，42(2)：
217— 220．
Hans J A van Rhijn，J Brian Power，Michael R Davey，eta1．
2001．Effects of PSAG 12一ipt gene expression on develop—
ment and senescence in transgenic lettuce1[J]．Plant
Physiol，127：505— 516．
Sa G，Mi M，He-Chun Y，Guo-Feng L．2002．Anther— —
specific expression of ipt gene in transgenic tobacco and it
sefect on plant development[J-}．Transgenic Res，11(3)：
269— 78．
Sambrook J，et a1．1 982．Molecular Cloning：A laboratory
manual[M]．New York：Cold Spring Harbor Laboratory
Press，l3．
Yu XH(于晓红)，Zhu YQ(朱勇清)，Chen XY(陈晓亚)，et
a1．2000．Aherations of root and fiber in transgenic cotton
plants with chimeric ph／p-ipt gene expression(种子特异表
达 ipt转基 因棉花根 和纤维的改变)[J]．Acta Botanica
Sinica(植物学报)，42(1)：59—63．
维普资讯 http://www.cqvip.com