全 文 ：广 西 植 物 Guihaia 26(2)：194— 199 2006年 3月
甘蔗 ACC氧化酶全长 cDNA的克隆及序列分析
王爱勤 ，杨丽涛 ，王 自章2，韦宇拓3，
何龙飞1，李杨瑞 ，
(1．广西大学 农学院，广西 南宁 530005；2．中国科学院 植物研究所，北京 100093；3．广西大学
生命科学与技术学院．广西 南宁 530005；4．广西农业科学院 ，广西 南宁 530007)
摘 要：ACC氧化酶是高等植物乙烯生物合成途径中的限速酶。根据报道的植物 ACC氧化酶基因序列设计
特异引物 ，从甘蔗 cDNA文库中克隆到一 ACC氧化酶基因片段 ，命名为 GZ-ACO，该基 因长 792 bp，与甘蔗基
因组文库中克隆的 ACO基因片段仅 18个碱基之差。根据该 cDNA片段序列，设计两对末端扩增的特异引
物，利用 RACE—PCR技术 ，获得 GZ—ACO片段的 5 端和 3 端序列。用 Vector NTI 7．0软件对三个序列进行
拼接和分析 ，结果得到全长的甘蔗 GZ—ACO氧化酶基因。GZ—ACO cDNA 核苷酸序列长 1 307 bp，具有一个
972 bp完整的读码框，启动子 ATG位于 126 bp，终止子 TAA位于 1 097 bp，推导编码 323个氨基酸。系统进
化分析表明，GZ—ACO基因氨基酸序列与其它植物已报道的ACC氧化酶基因具有 65 ～86 的同源率，且与
单子叶禾本科植物首先聚类 ，其次与单子叶芭蕉科、兰科植物聚类 ，最后与双子叶植物聚类，与植物形态的系
统进化结果一致 。该基因已在 DDBJ／EMBL／GenBank基因数据库注册 ，注册号为 AY521566。
关键词：ACC氧化酶 ；cDNA克隆 ；甘蔗；基因
中图分类号：Q943．2 文献标识码 ：A 文章编号 ：1000—3142(2006)02-0194-06
Cloning and sequencing of full-length cDN。Al~ U tI-U ~I C
encoding ACC oxidase in sugarcane
W ANG Ai—qinI，YANG Li—taoI，W ANG Zi—zhang1一，
W EI Yu-tuo3，HE Long—feiI，LI Yang-ruP，
(1．Agricultural College，Guangxi University，Nanning 530005，China；2．Institutes of Botany，the Chinese Academy
of Sciences，Beijing 100093，China；3．College of Life Sciences and Technology，Guangxi University．Nanning
530005，China；4．Guangxi Academy of Agricultural Sciences，Nanning 530007，China)
Abstract：1一aminocyclopropane-1一carboxylic acid oxidase is one of the key rate-limiting enzymes for ethylene
biosynthesis in higher plants．In the present study，a cDNA fragment of 792 bp，designated GZ—ACO，was ob—
tained from sugarcane cDNA library．According to the GZ—ACO cDNA fragment sequence，full length of GZ-
ACO cDNA was generated by 5 RACE and 3 RACE methods．GZ—ACO cDNA was 1 307 bp in length．W ithin
the full—length cDNA，a clear open reading frame(ORF)was 972 nucleotides，coding 323 amino acids．The 5
end included a putative translation start codon(ATG)at position 1 26 bp：the 3 end included an end codon
(TAA)at position 1 097 bp and had a poly(A)tail．The identity of the other polypeptides to each other varied
between 65 ～ 86 ．The results of phylogenetic analysis showed that ACC oxidase from sugarcane and from
Gramineae clustered together firstly，and then came those from M usaceae and Orchidaceae，dicotyledon came
subsequently．The clustering results of ACC oxidase molecules accorded with morphological classification sys一
收稿 日期：2005—01—26 修回日期 ：2005—07—26
基金项 目：国家自然科学基金(39860039)；广西 自然科学基金(桂科青 9912014)资助[Supported by the National Natural Seience
Foundation of China(39860039)；Natural Science Foundation of Guangxi(9912014)]。
作者简介：王爱勤(1966一)，女，广西上恩人，博士生，副教授，从事植物学教学和科研工作，E-mail：。
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2期 王爱勤等 ：甘蔗 ACC氧化酶全长 cDNA的克隆及序列分析 195
tem．The sequence of GZ—ACO had been submitted to the DDBJ／EMBL／GenBank database，the accession
number was AY521566．
Key words：1-aminocyclopropane-1一carboxylic acid oxidase cDNA cloning；Saccharum officinarum L-Hy—
brid；gene
乙烯对植物生长和发育过程具有广泛的调节作
用 ，如调控种子萌发、生根 、茎叶的生长、花芽分化、
果实的成熟 、衰老和脱落 、对环境胁迫的应答等。生
理生化研究表明，乙烯利对甘蔗的增产 、增糖具有重
要的调节作用。Singh等 (1998)和 Solomon等
(2001)报道，甘蔗收获前 7～10 d，用乙烯利处理甘
蔗，有效地提高甘蔗的品质、地下潜伏芽色氨酸和锌
的含量，维持细胞膜的稳定，从而提高冬季甘蔗的发
芽率。Li等(2003)报道在甘蔗分蘖初期用 200～
400 mg／L的乙烯利进行叶面喷施 ，对甘蔗生长有明
显的抑制作用，80～100 mg／L浓度的乙烯利则促进
叶面积、株高、有效茎数增加；甘蔗生长后期，高浓度
的乙烯利则可提高甘蔗糖分、蔗汁锤度、蔗汁糖分、
蔗汁重力纯度 ，降低蔗汁还原糖含量 ，抑制甘蔗开花
抽穗。关于乙烯利调节甘蔗增产、增糖的机理 ，目前
有两种不同的观点，一是外源乙烯利诱导甘蔗体内
乙烯的形成(Yang等，1984)；二是外源乙烯利不影
响ACC和 ACC合成的水平，与体内乙烯的形成无
关 (Foster等 ，1992)。ACC合成 酶 (ACS)和 ACC
氧化酶(ACO)是高等植物乙烯生物合成的两个关
键酶，已经从多种植物中分离和克隆它们的基因，但
在甘蔗中，除王自章等(2003)从基因组文库中分离
到一段 ACO基因片段外，未见有其它报道。为阐
明乙烯调控甘蔗增产和增糖的分子机理 ，进行 ACS
和 ACO基 因的克隆与表达研究 ，对全面了解 甘蔗
生长与环境胁迫关系、乙烯诱导甘蔗增产、增糖及开
花机理，进而利用基因工程手段 实现 品种改 良具有
重要的理论和实践意义。作为第一步工作，我们从
eDNA文库分离了甘蔗ACO基因全长，并提交DD—
BJ／EMBL／GenBank基 因 数 据 库，登 录 号 为
AY521566，同时利用基因数据库资料对该基因序列
进行 比较分析。
1 材料和方法
1．1供试材料、菌株和试剂
甘 蔗 (Saccharum officinarum L．Hybrid
ROC2O)由广西大学农学院教学科研基地提供。以
一 芽一节种植于温室大棚 中(30℃ ±2)。每天定时
喷雾淋水。选取 4～5叶期甘蔗健壮幼苗为材料，用
0．5mM IAA+0．05mM BA+75mM LiC1喷淋甘蔗
幼叶至叶面完全湿透。5 h后 ，剥取甘蔗幼嫩心叶，
迅速加液氮，置一80℃冰箱保存。受体大肠杆菌菌
株 JMlO9由广西大学生物科学与技术学院微生物
发酵中心保存。Taq DNA聚合酶、限制性内切酶、
IPTG、X—Gal、dNTP、AM V—RNase、PMD18一T Vec—
tor、DL2000、胶 回收试剂盒、质粒小量抽提试剂盒
等分子生物学试剂购 自大连宝生物工程公司。
1．2甘蔗总 RNA的提取和 eDNA第一链的合成
甘蔗幼嫩心叶加液氮研匀，移人预冷的 5O mL
离心管中，迅速加入 Trizol提取液。室温下剧烈振
荡 5 rain。加人酚 ：氯仿 ：异戊醇(125：24：1)，
室温下剧烈振荡 10 rain，离心 10 rain。取上清液于
一 干净 RNA—free的预冷的 5O mL离心管中。加人
无水乙醇后分别转人 UVIQ-lO柱 ，放置 5 rain。离
心弃去废液 ，加入洗液离 心 1 rain。取 出 UVIQ一10
柱 ，放在 一干 净 RNA-free的离 心管上 ，加 人 0．5
mL的TE洗脱液于柱中央。室温下放置 5 min，离
心 1 rain，所得溶液即为总 RNA。
eDNA第一链的合成：5 g甘蔗总 RNA，0．5
ng Oligo(dT)36，5×RT buffer 4 L，RNase inhibi—
tor 20U，40mM dNTP 2 L，AM V Reverse tran—
scriptase 5U反转录合成 cDNA第一链。
1．3甘蔗 ACC氧化酶基因 eDNA片段的克隆和测序
据 GenBank核酸数据库中报道的甘蔗 ACO部
分序列，设计一对引物 P3f：5-GCATTCTGAAC—
CACGGCATCTC一3， P4r： 5-TAGGCCTCGAAC—
CTTGTGCCG-3。由上海 生物工 程公 司合 成。合
成的eDNA第一链产物稀释 10倍后作为模板，用
TaKaRa公司的 EX Taq酶，以 P3f和 P4r为 引物，
对目的片段进行 PCR扩增。反应条件：94℃预变
性2 rain，94℃变性 3O S、57℃退火3O S、72℃延伸
2 rain，35次循环，然后 72℃延伸 10 rain。PCR扩
增产物经 1 的琼脂糖凝胶 电泳后 ，切下含 目的片
段，用上海华舜生物工程有限公司胶回收纯化试剂
盒回收目的片段。 目的 DNA片段与载体 pGEM—T
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196 广 西 植 物 26卷
Easy Vector连接，转化 大肠杆菌 JM109，菌落在含
有 IPTG和 X—gal的平 板上进行蓝 白菌斑筛选 ，挑
选出白色的转化菌落质粒 DNA进行质粒酶切鉴定。
克隆的 PCR产物由上海生物工程公司测序。序列用
NCBI-Blast等软件和 Vector NTI7．0软件对核酸数据
库及推导的蛋白质序列进行同源性分析。
1．4甘蔗 ACC氧化酶基 因 cDNA片段 末端扩增 引
物的设计
利用 Vector NTI7．0软件对报道 的甘蔗 ACO
(AF442821)部分序列和前面克隆的 cDNA片段 序
列进行 对 比并修 正后 ，通 过 NCBI—Blast的 Gene—
Fisher网站对 ACO基因 cDNA片段的 5 末端和 3
末端区域设计若干条引物，分析后选择以下引物交
由上海生物工程公司合成。
Prt(5 末端磷酸标记引物)：5-CGCTCTTGTA
CCTGCCGTTG一3，P{1：5-TCACCAACGGCAGGT
ACAAGAGC 3，Pf2：5-GGCTGCTGGACCTTCT
GTG(’-3，Prl：5-GGTATCTCGGCGATGTTGGA一
3，Pr2：5一AGCGTCTTGCTGGCGAACT一3，Oligo
(dT)。+3 末端锚定引物 ：5一TTTTTTTTTTCTG
ATCTAGAGGTACCGGATCC一3，3一末 端 锚 定 引
物 ：5一CTGATCTAGAGGTACCGGATCC一3，Prl 1：
5一GGCGGACGAAGAAAGTGC-3，Pr22：5-CGTC
CTTGAGCGTCTTGC一3。
1．5甘蔗 ACC氧化酶基因 cDNA片段 5 端和 3 端
的扩增
3 末端 PCR扩增按照大连宝生物工程公 司的
3-ful RACE Core Set Kit试剂盒说明书进行。以
Oligo(dT)。o+3 末端锚定引物为引物，反转录合成
cDNA第一链，将合成的锚定 eDNA第一链的产物
作为模板，合成的特异引物 Pfl和 Pf2分别与 3 末
端锚定引物进行 3 末端 PCR扩增 。
5 末端 PCR扩增按 照大连宝生物工程公 司 3一
ful RACE Core Set Kit试剂盒说明书进行 。以 5
末端磷酸标记引物(Prt)为引物，反转录合成磷标记
的 eDNA第一链；将环化的单链 cDNA连接产物稀
释 1O倍后作为模板，以特异引物 Pf2和 Prl、Pf2和
Prl1分别作为引物对，对目的片段进行第一次 PCR
扩增；将 cDNA片段 5 末端第一次 PCR扩增产物
稀释 1O倍后作为模板，以特异引物 Pfl和 Pr2、Pfl
和 Prl1、Pfl和 Pr22分别作 为引物对 ，对 目的片段
进行第二次 PCR扩增。扩增产物的克隆和测序同
E 1．3。
1．6甘蔗 ACC氧化酶基 因 eDNA全长 的获得及其
推导的氨基酸序列同源性分析
用 Vector NTI7．0软件对 已克隆的三段 cDNA
核苷酸序列进行分析和拼接，拼接所得的序列再用
NCBI-Blast等软件和Vector NTI7．0软件对核酸数据
库及推导的蛋白质序列进行同源性比较和分析。
1．7甘蔗 ACO基因全长 DNA PCR扩增
根据已获得 的全长序列 ，用 Vector NTI7．0软
件中的引物设计功能在编码框外设计一对引物，即
P33：5一ATGGCGCCTGCATTGTCATT一3和 P44：
5一AAACCAGAGCTAGGCGCAGG一3，以甘蔗基 因
组 DNA为模板 ，进行 PCR扩增。扩增产物的克隆
和测序同上 1．3。
2 结果与分析
2．1甘蔗 ACC氧化酶基 因 eDNA片段的克隆与序
列分析
以cDNA第一链为模板，P3和P4为引物，PCR
扩出预期 750bp左右的特异性带(图 1：1)。测序分
析结果表明，该片段核苷酸序列长度为 792bp，与基
因组 中克隆的片段 (AF442821)同源性高达 97 ，
仅有 18个碱基的差异。推导编码 264个氨基酸序
列与甘蔗基因组 中克隆的片段(AF442821)同源性
高达 95 。
2．2甘蔗 ACC氧化酶基 因 eDNA片段 3 端和 5 端
的克隆与序列分析
引物和反应条件优化 的结果 ，以 Prl1和 Pf2为
第一次 PCR扩增引物的 PCR产物为模板，Pr22和
Pfl为二次扩增引物，退火温度为 6O℃，进行 5 端
的扩增 ，可扩出约 400bp左右特异性带，记为 5R(图
1：2)。测 序 结 果 表 明 ，5R 核 苷 酸 序 列 大 小 为
382bp。该序列两端引物完整，与 cDNA片段的序
列进行拼接分析，发现它们有 118bp的一段是相重
叠，而且相重叠的序列几乎完全相同，仅有一个碱基
的差异 。证明所克隆的 5 末端 的核苷酸序列是 cD—
NA片段序列未知的上游序列。
以53℃退火温度、引物 Pfl进行 3 末端的扩
增，可扩出特异性强的 600bp左右条带，记为 3R(图
1：3)。测序结 果表 明，3R 核 苷酸 序列大小 为
516bp。该序列具有完整的两端引物序列和 1O个
Poly(A)尾 。与 cDNA 片段 的序列进行拼接分析，
发现它们有 217bp的一段是相重叠，而且相重叠的
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2期 王爱 等 ：甘蔗 ACC氧化酶全 eDNA ∞克隆段序 列分析 1 97
GZ GZCK+M T5RTCK-5R M
750bP
500bp
250b口
3R M M GZ34
750b13
5O0bD
2000bD
1 000bp
! 3 4
图 1 甘档 GZ ACO基 困 n A扩增
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198 广 西 植 物 26卷
序列几乎完全相同(仅有 2个碱基的差异)。证明所
克隆的 3 末端的核苷酸序列是 cDNA 片段序列 的
延伸，是该基因的下游未知序列 。
2．3甘蔗 ACo基因全长 DNA PCR扩增
以 P33和 P44为特异引物 ，60℃退火温度扩出
1 200bp左右的特异带(图 1：4)。测序分析所得的
结果与已获得的全长序列完全相 同，进一步验证 了
所拼接的序列 的正确。
2．4甘蔗 ACC氧化酶基 因 eDNA全长的获得及其
推导的氨基酸序列
根据 以上 的克隆工作 ，我们将所克隆到的三个
cDNA片段通过 Vector NTI 7．0和 NCBI-Blast软
件进行拼接分析 ，获得 了甘蔗 ACO基因全长 cDNA
序列(图 2)。该序列核苷酸序列大小为 1 307 bp，读
表 1 甘蔗 ACO基 因推导的氨基酸序列与已知其它植物的 ACO氨基酸序列同源性比较图
Table 1 Alignment of AY521566 and some plant ACO amino acid sequences in GenBank
Y 3 59 5 7 5
9 5 7 6
图 3 Vector NTI 7软件分析不同来源的 ACC氧化酶基因推导的氨基酸序列聚类分析结果
Fig．3 Phylogenetic analysis of amino acid sequences of ACC oxidases
from sugarcane and other plants in GenBank database
注册 号为 AY521566和 AF442821是甘蔗 ；AFO49888、Q4O634、AP004058和 T02754是水稻 ；AB044747毛竹 ；AY359575和 AY359576
玉米；AJ223232、U5577o、U88o45、AJ6O4546和 AJ5O5611是 香蕉 ；AFoo4662、Q397o5、JQ2274、P31238和 AY598793兰 科 植 物；
AB161946郁金香；P19464油梨；ABo73oo9柿子；P31237中华猕猴桃；U19856天竺葵；AB033504胡杨；AB013101番茄；AF384821
马铃薯；AFI15261白三叶；AF129O74桃；X98627苹果；U68215番木瓜；Y10749垂枝桦等的ACC氧化酶基因及其基因家族。
Among the entries，AY521566 and AF442821 are from sugarcane；AFO49888，Q4O634，AP004058 and T02754 are from rice；AB044747
is from Bamboo；AY359575 and AY359576 are from Zeamays；AJ223232，U55770，U88045，AJ6O4546 and AJ505611 are from Mu ⅡⅡ一
cuminate；AFOO4662，Q397o5，JQ2274，P31238 and AY598793 are from Phalaenopsis sp．；AB161946 is from TulipⅡgesner “ Ⅱ：
P19464 is from Persea americana，ABO73OO9 is from Diospyros kak{；P31237 is from Actinidia chinensis；U19856 is from P lⅡrgo i“m
X hortorum；ABO335o4 is from Populus euramericana；AB013101 is from tomato；AF384821 is from patato；AF115261 is from white
clover；AFI29074 is from peach；X98627 is from apple；U68215 is from Carica papaya；and Y10749 is from B t“lⅡP d“l“
．
码框为 126～1 097 bp，其中，起始密码子 ATG(即
启动子)位于 126 bp，终止密码子 TAA(即终止子)
位于1 097 bp，推导 323个氨基酸(图2)。该基因已
在 DDBJ／EMBL／GenBank基因数据库注册，注册
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2期 王爱勤等 ：甘蔗 ACC氧化酶全长 eDNA的克隆及序列分析 199
号为 AY521566。
从甘蔗 ACO基因推导 的氨基酸序列与 已知其
它植物的 ACO序列有 65 ～86 同源性 ，其中与
水稻 ACO基因同源性最高为 86 ，其次是毛竹 、香
蕉、兰花、玉米等单 子叶植物 ，与双子 叶植物如马铃
薯、白三叶等同源性在 65 ～68 之间(表 1)。
2．5甘蔗 ACC氧化酶基因推导 的氨基酸序列系统
进化分析
对 GenBank同源性搜索获得的其它植物 ACO
基因氨基酸序列进行 系统进化分析，发现甘蔗
(AY52l566和 AF442821)最先与水稻(AF049888，
Q40634)聚类合并 ，接着与 毛竹 (AB044747)、水稻
(AP004058 和 T02754)、玉 米 (AY359575 和
AY359576)聚类合并 ，然后 与兰科植物(AF004662，
Q39705，JQ2274，P31238和 AY598793)、芭蕉科植
物 (AJ223232，U55770，U88045，AJ6O4546 和
AJ5056l1)聚类 ，最后 与双子 叶植 物聚类合 并 (图
3)。系统进化分析结果符合按照形态特征进行判断
的系统进化关系。
3 讨论
从 eDNA文库 中分离植物基 因比从基因组文
库中克隆要难得多，主要是 DNA提取条件比较简
单，不容易降解，而 RNA在提取过程中，非常容易
降解。因此基因克隆成功的关键是 RNA提纯的质
量。利用上海生物工程公司生产的 Trizol UNIQ10
柱式 RNA抽提试 剂盒 ，可 以在较短 的时间获得植
物总RNA，减少 RNA降解的机会。基因全长的克
隆方法很多，用核酸探针杂交分离，通过建立 DNA
或 cDNA文库等克隆 目的基因是较常用 的方法 ，但
工作量和难度都很大，对一个已知部分 DNA片段
的基因而言，采用 PCR和 RACE PCR方法从 cD—
NA文库中克隆基因全长是 目前最简便而快速有效
的方法 。根据拼接结果 ，在全长编码 区两端设计引
物，从 DNA文库 中扩增 到甘蔗 ACO基因全长 (图
3)，推导的氨基 酸序列 与报道 的其 它植物 ACO基
因有较高的同源率，以及氨基酸序列系统进化分析
结果都证实所克隆的GZ-ACO基因确实是 ACC氧
化酶基因。该基因的获得，为进一步了解乙烯与甘
蔗生长 、糖分积累的关系 ，构建反义或正义基因，通
过遗传转化培育出具有反义或正义基因的基因工程
甘蔗，优化蔗糖积累代谢打下了基础。目前该基因
的结构与功能鉴定工作正在进行中。
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