全 文 ：广 西 植 物 Guihaia 23(1)：31— 35 2003 年 1月
植物转基因沉默及控制
韦 珂，黄 艳，何勇强
(广西大学农学院，广西南宁 530005)
摘 要：植物基因工程的 目的就是获取外源基因能够按照设计要求正常表达 和稳定遗传 的转基因植物 。近
几年来，广泛报道了转基 因植物中存在转基因沉默现象。主要阐述 了两种转基 因沉默的机理 即转录水平的基
因沉默和转录后水平的基 因沉 默 ，各种机理都涉及 DNA-DNA，DNA-RNA，RNA—RNA的相互作用。同时，
还讨论一些控制转基因沉默现象的策略 ，特别是 MAR在转基因植物中具有增 强基 因表达和减少株间差异的
作用 。
关键词：转基 因植物 ；基 因沉默 ；控制
中图分类号：Q784 文献标识码：A 文章编号 ；1O0O一3142(2O03)O1—0031—05
Plant transgene silencing and its controlling
W EI Ke，HUANG Yan，HE Yong—qiang
(The Agriculture Department of Guangxi University，Nanning 530005，China)
Abstract：The goal of plant genetic engineering is tO obtain transgenic plants that foreign gene can be normaly
expressed and faithfully inheritted in a predictable manner． But in recent years，it was widely reported that
transgene silencing was often found in transgene plant．In this article，we discuss two level of transgene silen—
cing phenomenon：Transc riptional Gene silencing and Post—transcriptional Gene silencing． Its mechanisms in—
volved DNA-DNA，DNA—RNA ，RNA-RNA ，interaction respectively，and we discuss some strategies tO over—
come transgene silencing also．Especially，Matrix attachment region(MAR)show capacity tO increase level of
transgene expression and reduce transformat—-to-transformat variation of transgene expression in stable trans—-
formated plant．
Key words：transgene plant；gene silencing；controlling
植物基因工程研究为培育作物优良新品种开辟
了一条崭新的途径 ，随着该学科的日益发展，许多具
有重要经济价值的转基因作物已开始陆续进入实际
应用阶段。自1996～2000年，全球共有 13个国家
种植了转基因作物，2000年种植面积达到 4 420万
hm2，是 1996年 25倍。然而各 国学者大量研究结
果表明外源基因在转基因植物中并不一定能稳定表
达，甚至完全不表达是一个较为普遍的现象。这种
遗传不稳定性并不是由于所导入的 DNA发生缺失
或突变，而是转基 因失活，即所谓的转基 因沉默造成
的。转基因沉默是指利用遗传转化方法导入并稳定
整合进入受体细胞中的完整的外源基因在当代转化
体或在其后代中表达受到抑制的现象。首例基因沉
默是 1986年 ，Peerbolte发现根癌农杆菌 T—DNA上
的基因在转基因烟草中发生甲基化而其表达受到了
抑制(1]。
转基因沉默的机理
转基因沉默有多种机理，并且各种机理都涉及
收稿 日期 ：200卜08—21； 修订 日期 ：2002—01—10
作者简介：韦 珂(1972一)，女，广西宜州市人 ，讲师，博士生，植物病理学专业。
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32 广 西 植 物 23卷
到 DNA-DNA，DNA—RNA，RNA—RNA间的相互作
用，形成相互影响、相互制约的复杂调控机理。目前
人们通常将转基因沉默分为转录水平 的基因沉默
(Transcriptional Gene silencing；TGS)和转 录后水
平 的基 因沉 默 (Post—transcription Gene silencing；
PTGS)两种。
1．1转录水平的基 因沉默(TGS)
它是指对转基因专一的细胞核 RNA合成的失
活，它的发生主要是由于基因无法被顺利转录成相
应的 RNA而 导致 基 因沉 默。引起 TGS的机理 主
要有以下几种 ：
1．1．1转基因及其启动子甲基化 甲基化修饰在基
因表达，植物细胞分化以及系统发育中起着重要的
调节作用。植物 DNA 甲基化程度是较高的，核基
因组中几乎 2O ～3O 的胞 嘧 啶残基 处于 甲基 化
状态。然而大量研究表明，在转基 因植物中 DNA
甲基化严重影响了转基 因的正常表达。Kilby等
(1992)[2)使用新霉素磷酸转移酶(NptⅡ)基因(npt
lI)转化拟南芥，获得了具有卡那霉素(Kanamycin；
kan)抗性的转基因植株。对后代进行遗传稳定性
分析时发现了两个卡那霉素敏感株系，Southern—
blot分析 表 明 Kan抗 性 的消 失 并 不 是 由于 外 源
DNA的畸变或丢失造成的，使用去甲基化试剂 5一
氮胞苷(5-ozacytidine)可使抗性再度恢复。用限制
性内切酶 Sst I和 HindIlI酶 切分析 Kan敏感 株系
的基因组时发现，npt lI基因上游的胭脂碱合成酶基
因启动子(Pnos)中的 Sst I位点被甲基化。目前发
现 ，DNA 甲基化易发生在外源基 因启 动子 区 CG和
CXG位点 的胞嘧啶残基上(Kilby，1992)[2)，该 区域
碱基的甲基化往往 导致 的转 录受 到抑制 (Kumpat—
la，1997)(39。植物 DNA 甲基 化引起外源基 因失活
的现象十分类似细菌的限制修饰系统，这一防御机
制可以有效识别出外来 DNA序列。植物染色体上
的碱基组成是不均一的，某些区段常有确定的 GC
含量比例，外源 DNA的插入会破坏其原有的组织
结构，因此可被植物修饰系统所识别，并通过甲基化
使之失活[4，5]。
1．1．2位置效应(position—efect) 当导入 的外源基
因随机地插入到宿主基因组时，如果它被导入到转
录活跃 区，如常染色质中的解旋 DNA，转基 因就会
顺应那个区域的染色质结构，因而可能进行高水平
的转录。相反，如果转基因插入转录不活跃区域或
异染色质区域，转基因通常会融入该区域的染色质
结构，使转基因进行很低水平的转录，或使转基因发
生异染色质化而导致基 因沉默[们。
1．1．3多拷 贝重复转基 因序列引起的 TGS 直接基
因转化法常常导致多拷贝转基因在宿主细胞基因组
中的整合，多拷贝转基因无论是单位点整合还是多
位点整合分散在基因组中，都能使转基因植株发生
较高机率的基因沉默现象。其中之一原因是同源基
因间的反式失活 (transinactivation)：反式失活主要
是由于拥有同源序列的沉默位点其它位点的 DNA
相互作用而引起 的转基 因沉默[7．8．9]。原 因之二是
DNA—RNA协 同(association)。当外源 DNA 的插
入使转录出的 RNA水平过高时，这些过剩的 RNA
就会与同源的 DNA配对，使这个基因位点甲基化
或异染色质化，阻碍了基因正常转录。
1．1．4后成修饰作用(epigenetic effect)导致 的转基
因沉默 后成修饰作用是指转基因的序列和碱基组
成不发生改变，但是其功能却在个体发育的某一阶
段受到细胞内因子的修饰作用后而关闭。后成修饰
作用导致的转基因沉默与受体植物的染色体组型结
构有关(103。
1．2转 录 后水 平 的 基 因 沉 默 (Post transcripti0nal
Gene silencing PTGS)
转 录后水平 的基因沉默是指转基 因在细胞核里
能稳定转录，但在细胞质里却无相应的稳定态 mR—
NA存在现象。其中共抑制(cosuppression)是转录
后水平基因沉默中最常见的现象。它是由于转基因
编码区与受体细胞基因组间存在的同源性，导致转
基因与内源基因的表达同时受到抑制。共抑制现象
最初由Mol等[11)在研究矮牵牛苯基苯乙烯酮合成
酶(HS)时报道。目前人们通常用以下几种模型来
解释 PTGS：
1．2．1 RNA 阀值模 型(RNA threshold mode1) 由
MeinsandKunz提出。该模型主要是指细胞只能容
纳和处理一个特定阀值以下的转基因转录物，一旦
细胞内的转基因转录物超过这个阀值后，内源 RNA
依赖下的 RNA聚合酶以过多的转基因 mRNA为
模板，通过反转录合成拷贝 RNA(cRNA)，触发了
转基因及其相关内源基因转录物的序列依赖性降
解。这些 cRNA能与转基因和内源基因的 mRNA
杂交，成为降解的靶同源转录物[12)。
1．2．2异常 RNA模型(aberrant RNA mode1) 由
David和 James提出，异位配对 的 DNA转录出异 常
RNA(rRNA)，在原生质 中 rRNA与 RNA相互作
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1期 韦 珂等：植物转基因沉默及控制 33
用 ，使正常 RNA被降解 。
1．2．3碱 基 配 对模 型 (inter—orintra—molecular base
pairing mode1) 是指转 录物 间的碱基配对 以及转
录物内的碱基配对造成同源转录物的降解[13，1 4]。
2 转基因沉默 的控制
为 了克服转基因沉默 ，世界各 国分子生物学家
对转基因沉默的机理及其防止开展了广泛研究，积
累了不少经验(表 1)，其中关于 MAR的研究取得
令人兴奋的进展。
2．1 M AR
2．1．1 MAR的提 出 Leammli等[15]于 1971年首
先提出非 组蛋 白核 骨架 假 设 ，他 们 在 除去 组蛋 白
(histone proteins；HP)和大部分非组蛋 白(non-his-
tone proteins；NHP)后，在电子显微镜下观察到由
NHP构成 的染 色体骨架(scaffold)和 由骨架伸展出
的无数 DNA侧 环组成 的晕 圈，环的大小大致 自十
至数千碱基对 ，DNA环 的基部与非组蛋白的骨架相
联结。每个侧环代表染色质的一个独立的结构域，
进行基因的转录和表达 。侧环 DNA 的基部有一段
特殊的序列与蛋白质的核骨架相结合，称为核基质
结合序列(Matrix attachment region；MAR)或核骨
架结合序列(Scaffold attachment region；SAR)。目
前已经纯化和鉴定 的 MAR结合蛋 白共 1O余种，
MAR结合蛋白的发现，及 MAR结合蛋白既可以和
MAR紧密结合 ，又是核基质 的组分，有力证明了
MAR能与核基质相互作用C163。
表 1 转基因沉默的控制方法
Table 1 The control of transgene silencing
篓 ， of 洲Prob舳able m舸eth odof施in ⋯ i itrans ennactivati0n act Vat 0n c0nt0儿ng
多拷贝的插入
转基因甲基化
共抑制
转基 因与插 入位 点 附近
序列的相互作用
农杆菌法优于基 因枪及电激法。谷类作物改用农杆菌转化法。选择完整单拷贝插入序列。
避免同源序列 ，包括启动子 ，结构基因及标记基因 ；不同基 因用不同启动子驱动；避免用相同的选择
标记 ；第二次转化时用两种选择标记同时选择 ，建立删除选择标记的技 术体 系。鉴定并利用去甲基
化序列 ，如免疫球蛋 白 K链基 因中的一个增强子可局部去 甲基化(direct regional demethylation)。
从大量转基因植株中筛选稳定表达的个体。建立位点特异重组体系 。
用 MAR(Matrix attachment region)建立独立的结构域。
2．1．2 MAR的分子结构特征 通过对截至 1997年
底所发现并鉴定的所有 MAR分子的序列分析，我
们可以找到一些 MAR的结构特征 。1MAR的分子
结构特征 MAR一般长约 1OO～1 000 bp，但也有长
达 7 kb的(如人 l3干扰素基因5 上游的 MAR)。富
含 A／T。一 般大 于 7O 。MAR 中有几 类基序
(Breyne，et a1．，1994)C173。
A．1Obp A—box AAT AAA(A／C)AAA
B．1Obp T-box，TT(T／A)T(T／A)TT(T／A)
TT
C．AT ATTT
D．与果蝇拓扑异构酶 Ⅱ(topoisomerase I)共
有切割位点 GTN(A／T)A(T／C)ATTNATNN(G／
A)的同源序列。在动物和酵母 MAR中很多，植物
MAR中较少。
以上基序虽常在 MAR中发现，但没有一个基
序是普遍共有的。有些 MAR没有或只有很少几个
这种基序。成串的 Topo I位点也在非 MAR DNA
中发 现。不 同 的 MAR 分 子 之 间 并 不 能 相 互 杂
交[ 8]。故不同的 MAR序列同源性不高，也无严格
的保守序列。
MAR二级结构表现为狭窄的 DNA小沟，易于
弯曲和解链。富含 AT 的 DNA 并不一定 就是
MAR，一些 AT含量较低的 DNA序列由于具有
MAR的二级结构特征而可以与核基质特异性体外
结合。通过比较 MAR与来源于不同物种的核基质
的体外结合能力，发现 MAR与核基质的相互作用
在进化上是高度保守的C193。
MAR一般位于功能转 录单位的侧翼，作为一
种边界元件；但也有一些 MAR位于某些基因的内
含子中(如中国仓鼠DHFR基因、人类拓扑异构酶 I
基因、小 鼠 IgK和 Ig 基因)。
2．2 MAR在转基 因中的作用
将 MAR 置 于所 转基 因的两侧 翼，构 建成
MAR—gene—MAR，可以创造一个独立的结构域(转
录域)。推测其作用一是可克服基因组对碱基组成
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不同的外来基因的识别，二是可避免插入位点附近
染色体的影响。从而能够减少甲基化增强基因表
达，消除减少位置效应消除多拷贝数的引起的反式
失活。事实上不同作者报道的 MAR的消除转基因
沉默的结果各不相同(Spiker，Thomp son，1996)原
因可能是所用的 MAR、报告基因、细胞或有机体及
转化方法不同。比较肯定的一点是，多数实验有提
高基因表达水平的效果，有的则明显减少了株间差
异 。
值得注意的是，人工合成的类似 MAR的基序
也有增强基 因表达的作用。Bode J等 (1992)报
道C203，免疫球蛋 白重链基 因 (IgH)增强子 的 MAR
3’有 AATATATTT基序，可使碱基不配时，若将
其突变成 ACTGTCTTT或 ACTGCTTT，碱基 不
配对被抑制，与核骨架的亲和力降低。因此它们人
工合 成 了 25 mar的 寡 核 苷 酸 5’TCTTTA—
ATTTCTAATATATTTAGAA 3’并将这 25bp重
复连接 7次成(25bp)7共 190bp，发现它与核骨架的
结合力达 75 ，用它作两侧翼转基 因后荧光素酶
(1uc)的活性比无(25bp)7的载体高 6倍。
基于上述，预计可能会在未来转基因中更多地
使用 MAR，以增强基因表达和减少株间变异。
3 小 结
由于真核生物基 因的表达调控是发生在多水平
上的，所 以造成植物转基因沉默的原 因可能很多 ，而
且会有不同的作用机制。它们不一定在某一例转基
因失活中同时出现，但也不彼此排斥，而是相互影响
甚至协同作用。转基因失活反映了生物体在基因调
控水平上进行的一种自我保护。可以推测：细胞本
身存在着沉默系统。转基因诱导的基因沉默可能是
由于外源 DNA插入后，破坏宿主基因组的特征性
组成，使染色质的三维结构改变，同时，同源序列的
插入还会造成异位配对，这些都可能触动沉默机制
的开关，进而导致一系列链锁反映，包括甲基化、异
染色质化或 RNA的降解，最终造成基因不能正常
表达。
近年来在研究转基因沉默方面已取得了不少进
展C21)，但仍有许多问题尚不清楚，如对转基因沉默
机制的认识还很朦胧，所提出的各种模型和假设还
不能解释各种实验结果。转基因沉默已经成为生物
遗传工程商品化和实用化的巨大障碍。如何减少并
克服转基因沉默已经成为世界各国生物界亟待解决
的问题 。
致谢 感谢王强同学所提供的帮助。
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