全 文 ：广 西 植 物 Guihaia 25(1)：53— 57 2005年 1月
昆仑锦鸡儿(豆科)的遗传多样性研究
刘美华，李忠超，陈海山，葛学军
(中国科学院华南植物园，广东广州 510650)
摘 要：采用 ISSR方法，对昆仑锦鸡儿及其近缘种吐鲁番锦鸡儿的遗传多样性进行检测。结果表明，两个种
多态位点百分率分别为 79．O7 和 41．86％，昆仑锦鸡儿遗传多样性水平明显高于吐鲁番锦鸡儿；两个种间的
遗传距离为 0．394 3；昆仑锦鸡儿居群间的遗传一致度较高(平均 0．961 4)，遗传分化很低(Gs1’：O·083 6)。
关键词：昆仑锦鸡儿；吐鲁番锦鸡儿；遗传多样性；ISSR标记
中图分类号：Q943 文献标识码：A 文章~i．es-：1000—3142(2005)01—0053—05
Genetic tion of Caragvaria ana
polourensis(Leguminosae)
LIU Mei—hua．LI Zhong—chao，CHEN Hai—shan，GE Xue—j un
(SD“th China Botanical Garden，The Chinese Academy of Sciences，Guangzhou 510650，China)
Abstract：Inter—simple sequence repeat(ISSR)marker was used to detect genetic variation of 3 Caragana po—
z0“rensis Franch populations and 1 C．turfanensis(Krassn．)Kom．population from Xinjiang．86 bands were
generated by 7 ISSR primers，of which 79．07 and 41．86 bands were polymorphic in C．polourensis and C．
turfanensis，respectively．Higher level of genetic variation was revealed in C．polourensis than that of C．
turfanensis．The average Nei’S genetic distance between these two species was 0．394 3．
Key words：Caragana polourensis；C．turfanensis；genetic diversity；ISSR
锦鸡儿属(Caragana)(豆科)是一个温带亚洲
分布型属，lOO余种，主要分布于亚洲和欧洲的干旱
和半干旱地区(张明理 ，l998)。我国产 62种 9变种
l2变型。该属在新疆有 32种(牛西午 ，1999)。昆
仑锦鸡儿(Caragana polourensis Franch．)分布于
新疆昆仑山北坡(乌恰 一且末)和甘肃祁连山北坡
(山丹)，生于低 山、山前平原。吐鲁番锦鸡儿 (Ca—
ragana turfanensis Kom．)分布于新疆喀什西部，
生于海拔 2 000 m的山坡、河流阶地、峭壁。昆仑锦
鸡儿和吐鲁番锦鸡儿为近缘种，它们的形态学特征极
其相似，二者间区别仅在于吐鲁番锦鸡儿的嫩枝和子
房无毛(中国科学院中国植物志编辑委员会，1993)。
在新疆乌恰地区，昆仑锦鸡儿和吐鲁番锦鸡儿
经常和我国濒危常绿灌木小沙冬青 (Ammopiptan—
thusnanus Cheng f．)生长在一起。由于分布区内生
态环境恶劣，干旱少雨 ，加之近年来人为破坏，小沙冬
青的分布面积不断缩减，个体数量日益减少，已处于
濒危状态，急需开展保护研究工作。这两种锦鸡儿和
沙冬青生长在同一个生态环境中，生活史特征相似，
但锦鸡儿却不是濒危物种。通过它们之间遗传学资
料的比较，可以探讨物种遗传多样性与濒危的关系。
简单重复序列区间扩增 ISSR(Inter-Simple Se—
quence Repeats)，是利用真核生物基因组内广泛存在
的简单重复序列，设计单一的简单重复序列作为引物
对基因组DNA进行 PCR扩增。在评价遗传多样性
的各种分子标记中，ISSR作为一种可靠的基因标记
被广泛用于探讨种内的遗传变异(Gupta等，1994；Zi—
etkiewicz等，l994；Wolfe等，1998)。对野生居群的
收稿 日期：2003—1i-i7 修订 日期：2004—03—22
基金项目：中国科学院知识创新工程重要方向性项 目(KSCX2一sw一104)；国家 自然科学基金研究项 目(30370282)
。
作者简介：刘美华(1978一)·女，山东昌邑县人，在读硕士生，从事植物保育遗传学研究工作。 通讯作者 E_mail：xjge@scb ac
． c
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ISSR研究表明该标记有很强的通用性和用于居群水
平研究的巨大潜力(Ge等，1999；Culey等，2001)。
本实验采用 ISSR标记来检测锦鸡儿的遗传多
样性，目的在于通过对锦鸡儿遗传多样性的检测，与
在相同生境中生长的濒危植物小沙冬青的遗传多样
性进行比较，评价锦鸡儿遗传多样性水平，并探讨小
沙冬青珍稀濒危的原因。
1 材料和方法
1．1居群取样
采用居群随机取样的方法，根据居群大小，每个
居群至少取 10个个体的新鲜叶片，用硅胶迅速干燥
保存。3个昆仑锦鸡儿居群和 1个吐鲁番锦鸡儿居
表 1 居群取样地点
Table 1 Population locations of Caragana polourensis and C．turfanensis
群共 63个个体(表 1)。
1．2 DNA提取和 PCR反应
用改进的 CTAB法提取总 DNA(Doly，1991)。
2O uL ISSR初始反应体系为：模板 DNA 2O ng，
10mM Tris—HC1(pH8．3)，50mM KC1，0．1 oA
Triton X—100，2．0raM MgC12，0．1raM dNTPs，2％
formamide，200nM primer和 1．5 units Taq poly—
merase。PCR反应在 PTC一100 96孔热循环仪上进
行。首先 94℃变性 5 min，然后进行 35个循环 ：94
℃ 30 S，50~52℃ 45 s(根据不同引物确定)，72℃
90 S；最后，72℃延伸7 min。ISSR引物采用加拿大
UBC 9号引物。100个引物中，筛选出 7个高多态
性的引物(808，809，813，834，880，881，888)。PCR
产物在含 EB的 1．5 琼脂糖胶上电泳分离，以鼎国
生物技术有限公 司生产的 100bp DNA Ladder(100
～ 1 500 bp)为分子标记。DNA片段通过 UVP凝
胶 成像 系 统 (LabWorks Software Version 3．0；
UVP，Upland，CA 9l786，USA)观察 ，记录。
1．3数据分析
由于 ISSR是显性标记，电泳带谱按照扩增带
的有(1)和无(0)记 录，形成 ISSR表型数据矩阵用
于进一步分析。
用 POPGENE V．1．3l软件 (Yeh等，1999)进
行 Nei’S基因多样性统计(Nei，1973)并计算 Shan—
non多样性信息指数。用 WINAMOVA 1．55进行
分子方差分析(AMOVA)，计算居群内、居群间和种
间的变异方差分布(Excoffier等，1992)。利用 NT—
SYS—pc 2．0中的 SAHN和 TREE程序对从 POP—
GENE得到的遗传距离矩阵进行 UPGMA聚类分
析，建立聚类分支图(Rohlf，1998)。
2 结果
两个种 共扩增 出 86个位 点，平均 每个 引物
1O．8个位点。扩增片断大小为 280～1 800 bp。在
所有居群水平上，83个位点 (96．51 )是多态的。
种水平上，昆仑锦鸡儿有 68(79．07 )个多态位点，
吐鲁番锦鸡儿有 36(41．86 )个多态位点(表 2)。
2．1昆仑锦鸡儿的遗传多样性
昆仑锦鸡 儿 3个 居群多态位点率分 别为
58．14 、66．28 和74．42 ，平均为66．28 ，其中
巴音库鲁提居群的遗传多样性最低(P：58．14 ，
HE：0．1936，Ho：0．290 9)，而乌恰一康苏居群的最
高(P：74．42 ，HE：0．240 0，Ho：0．362 9)(表 2)。
居群水平基 因多样度(H )为 0．22l 3，Shannon指
数(Hpop)为 0．333 5；种的水平上，总基因多样度
(HT)为 0．241 5，Shannon指数(Hsp)为0．375 3。
昆仑锦鸡儿的遗传分化系数 GsT为 0．083 6，表
明总的遗传多样性中有近 92 的遗传变异来自居
群内部。居群间遗传一致度较高，平均为 0．96l 4。
居群间遗传距离较低，从 0．035 8到 0．044 8，平均
为 0．039 4。居群间基因流(Nm)为 2．74(表 3)。根
据 Shannon指数计算的遗传分化系数为 0．1ll 4，
这与Nei氏遗传多样性估算值近似。AMOVA分
析表明有91．70 的差异存在于居群内部，和 POP—
GENE分析结果完全一致。
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l期 刘美华等：昆仑锦鸡儿(豆科)的遗传多样性研究 55
2．2昆仑锦鸡儿和吐鲁番锦鸡儿遗传多样性的比较
与昆仑锦鸡儿相比，吐鲁番锦鸡儿遗传多样性
略低 ，其多态位点百分率为 41_86 ，Net氏基 因多
样度 (H )为 0．159 6。在 86条 扩 增 带 中，36
(41．9 )条带是两个种均有的，昆仑锦鸡儿和吐鲁
番锦 鸡儿 的特有 带分 别为 34(39．5 )和 l6
(18．6 9，5)，两个种间表现出较大的遗传差异。昆仑
锦鸡儿 3个居群与吐鲁番锦鸡儿 1个居群配对间的
遗传一致度较低(0．649 0～0．662 6)，明显低于昆
仑锦鸡儿3个居群间的遗传一致度(表 4)。种的水
平上两个种的遗传一致度为 0．674 l，遗传距离为
0．394 3。吐鲁番锦鸡儿和昆仑锦鸡儿 3个居群的
平均遗传距离为 0．4257。AMOVA分析也证明了
两个种之间存在明显遗传差异，在总遗传变异中，
56．53 来自两个种间，39．26 来 自居群内，而种内
各居群间变异仅占4．2l 9／5(表5) 根据各居群间遗
传距离利用 NTSYS—pc 2．0软件进行不加权平均聚
类分析(UPGMA)，建立一个遗传距离聚类树(图 1)。
表 2 居群内的遗传多样性
Table 2 ISSR variation within populations of
C．polourensis and C．turfanensis
表 3 Net指数估算的居群遗传多样性
Table 3 Net’S Analysis of Gene Diversity in Caragana Population
表 4 四个居群间的遗传距离(D)和遗传一致度(I)
Table 4 Nei S Original Measures of Genetic Identity
and Genetic distance between populations of
C．polourensis and C．turfanensis
Net s genetic identity(above diagona1)and genetic distance(below
diagona1)
3 讨论
3．1昆仑锦鸡儿与吐鲁番锦鸡儿遗传差异的比较
7个引物扩增 出的 86个位点中，50(58．14 )
个位 点不 是两个种 共有 的，表明两 个种 的分化 。
Gemmil等(1998)认为如果一个种从另一个种 中分
离出来，产生一个祖先一衍生种 ，那么，衍生种的大
多数甚至全部等位基因都来自祖先种，衍生种很少
或根本没有新等位基因。虽然昆仑锦鸡儿和吐鲁番
锦鸡JDJl部形态特征很接近，不易区分，但昆仑锦鸡
儿和吐鲁番锦鸡儿的特有位点分别为 34和 l6，因
此这两个种可能没有祖先一衍生的关系。Gottlieb
(1977)根据等位酶实验分析结果，提出同种种内居
T
KB
IlUUU U．2 U- J
Nei’S genetic distance
图 1 昆仑锦鸡儿和吐鲁番锦鸡儿四个
居群的遗传距离聚类图
Fig．1 Phenogram of UPGM A cluster analysis based
on Net’S genetic distance between the four
populations of C．turfanesis and C．polo rP”sis
群间遗传距离通常小于0．05，同属不同种种间的平
均遗传一致度通常为 0．67。本实验结果昆仑锦鸡
儿和吐鲁番锦鸡儿种间的遗传一致度 I为0．674 1，
显著小于昆仑锦鸡儿 3个居群间的遗传一致度
(O·956 2～O．964 9)；种间遗传距离(0．394 3)明显
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大于昆仑锦鸡儿的任意两个居群间的距离，说明两
个种间的遗传分化非常明显。同时也表明 ISSR标
记可以有效鉴定近缘物种。
3．2昆仑锦鸡儿和小沙冬青的遗传多样性的比较
昆仑锦鸡儿和吐鲁番锦鸡儿遗传多样性都比较
高 ，与锦鸡儿属其它植物，如柠条(Caragana spp．)
的研究结果一致(P：0．796～0．994，HT：0．301，Hs：
0．248)(魏伟等，1999)，符合 Hamrick和 Godt
(1990)提出的多年生、远交的植物应该具有较高水
平遗传多样性的统计分析。新分化的年轻种具有较
高的遗传多样性 (Aradhya等，1991；Batista等，
2002)。锦鸡儿属植物起源和分化较晚(第三纪中新
世末至上新世初)，青藏高原隆起、内陆早化导致本
属植物主要沿适应高寒早化和干旱两个方向发生剧
烈分化(周道玮 ，1996)。昆仑锦鸡儿和吐鲁番锦鸡
儿都可能是新分化形成的种，可能它们继承的祖先
的遗传多样性就较高。
与上述两种锦鸡儿相比，同生境的珍稀濒危植
表 5 昆仑锦鸡儿和吐鲁番锦鸡儿的 AMOVA分析
Table 5 Analysis of molecular variance(AMOVA)for C．polourens is and C．turfanensis using ISSR
物小沙冬青的遗传多样性较低 (H 一0．0638，P=
25．89 。)。遗传多样性的降低和丧失将使居群对
环境变化的反应潜力减小 ，导致居群易于趋于灭绝
(Frankham 等，2002)。汪小全等(1996)用 RAPD
标记对我国特有植物银杉(Cathaya argyophylla)
的遗传多样性研究认为，较低的遗传多样性可能是
使其濒危的原因之一。由于小沙冬青和这两个锦鸡
儿的生境相同，而锦鸡儿生长良好 ，因此我们推测不
同的遗传多样性水平可能是造成它们生长状态不同
的主要原因之一，即锦鸡儿较高的遗传多样性水平
使其能具有更宽的遗传选择基础，从而能够适应不
断恶化的环境；较低的遗传多样性水平可能是导致
小沙冬青处于濒危状态的重要原因之一。
本 实验得到郝刚博士、余艳和张林斌的热情帮
助 ，谨致谢 意 !
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