全 文 ：广 西 植 物 Guihaia 26(1)：18— 21 2006年 1月
五种大戟属植物 nrDNA的 ITS序列分析
及其叶的比较解剖学研究
孟 娜1，周守标¨ ，蒋继宏
(1．安徽师范大学 生命科学学院，安徽 芜湖 241000；2．江苏省药用植物技术重点实验室 ，江苏 徐州 221116)
摘 要 ：运用 PCR直接测序法和石蜡切片法 ，测定 5种安徽产大戟属植物的 nrDNA的内转录间隔区(ITS)
序列包括 5．8SrDNA及其叶片的解剖。结果表明：(1)5种大戟属植物的 ITS的长度范围为 64l～662 bp，运
用 Maga软件构件 ITS树把 5种植物归为两大支 ：大戟、月腺大戟与乳浆大戟聚为一支 ；地锦和斑地锦聚为另
一 支。结果表明：地锦和斑地锦亲缘关系较近 ，而大戟、月腺大戟和乳浆大戟亲缘关系较近。(2)5种大戟属
植物的叶片结构 中，除地锦和斑地锦外 ，其余 3种有明显的栅栏组织和海绵组织之分，但二者在叶肉中的厚度
比在种间有一定 的差别 ；而地锦和斑地锦叶的栅栏组织与海绵组织分化不明显 ，且 皆有乳汁管 ，其他 3种植物
叶片内未见此结构 ，叶片结构分析表明：大戟、月腺大戟和乳浆大戟叶片结构相近，而地锦草和斑地锦叶片结
构也相近 。(3)分析表 明 nrDNA的 ITS序列及叶的比较解剖特征具有明显的相关性。以上研究结果为大戟
属植物的分类和药用开发提供了实验证据。
关键词 ：大戟属 ；ITS序列 ；比较解剖学
中图分类号 ：Q944．5 文献标识码 ：A 文章编号：1000—3142(2006)0l-O018—04
Seq uence 113 based on ITS gi0n of nuclear3 U analysis 0 1 1 re l
ribosomal DNA and comparative anatomy on
the leaves of five species in Euphorbia
MENG Na ．ZHOU Shou—biao ．JIANG Ji—hong
(1．Colege of Life Science，Anhui Normal Uniuersity，Wuhu 241000，China；2．Key Laboratory
of Medicine Plant and Biotechnology，Xuzhou 221116，China)
Abstract：The sequence of ITS region(ITS1-5．8S—ITS2)of nuclear riboaomal DNA from 5 species of genus Eu—
phorbia was determined using PCR products and the leaf structure was examined by anatomical method．The
results are as follows：(1)The length of ITS region ranges from 641 bp to 662 bp．Two clades of five species．
with one including E．pekinensis，E．ebracteolata，E．esR~a，and the other including E
． ]lLI7／li厂“ 以and E．s“pi”“，
are identified．The result shows that there is a close relationship between F．humi厂“s and E． “ 7＆，and sim—
ilarly，there is a close relationship among E．pekinensis，E
． ebracteolata and E．esula by direct sequencing of
PCR products．(2)Except E．humifusa and E．supina，the leaves of E．pekinensis，E．ebracleola^z and E． s“Z“
are differentiated into the palisade tissue and the spongy tissue，but the thickness of leaves and percentage of
palisade and spongy tissue are different among species．They have nonarticulate laticifer and the structure is
similar between palisade and spongy tissue．It is indicated that the leaf structure of E
． h“7 f．s“and E．s“pi”“
is similar and that Of E．pekinensis，E．ebracteolata and E．esu[a is alike． (3)The ana1ysis shows that there is
收稿 日期：2004—11-01 修回日期：2005—08—28
基金项 目：安徽省自然科学基金(0004241 5)资助[supportcd by Natural Science Foundation of Anhui Province(00042415)]。
作者简介：孟 娜(1977一)，女，安徽省宿州人，硕士研究生 ，植物分类学专业，E—mail：~angnem@1 63．c()m>。
通讯作者(Author for correspondencc)
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1期 孟 娜等 ：五种 大戟属植物 nrDNA的 ITS序列分析及其叶的比较解剖学研究 19
the relevance between ITS sequence and comparative anatomical charact er of the leaves
Key words：Euphorbia；ITS sequence；comparative anatomy
大戟属(Euphorbia)为大戟科 (Euphorhiaceae)
中最大的属 ，全世界有 2000余种 ，安徽产 6个野生
种。大戟属植物资源丰富，从热带到亚热带，从陆地
到沙漠 ，皆有分布 ，本属植物含 白色或 黄白色乳汁，
具有重要的药用价值 (钱啸虎 ，1988)。 目前对大戟
属植物研究主要集 中在对其化学成分及药理方面。
浮光苗等(2003)研究 了月腺大戟的化学成分，从中
分离出 7个化合物 ；孔令义 等(1996)从大戟根 中分
离出9个化合物；刘湘新等(1996)对地锦有效成分
进行鉴定，为兽医临床合理使用地锦提供实验依据；
柳润辉等(2001)为进一步寻找斑地锦的抗菌活性物
质，对斑地锦进行了化学成分分析 ，从 中分离得到 9
个化合物，并鉴定了其理化性质。但在 nrDNA的
ITS序列测定及叶的解剖学特征 尚未见报道。本文
首次报道了安徽产 5种 大戟属植物 nrDNA的 ITS
序列分析及其叶的解剖学研究，为探讨大戟属植物
的系统演化关系提供分子和解剖学证据 ；同时为大
戟属植物的分类和药用开发提供实验证据。
1 材料与方法
1．1材料来源
本研究所用材料，均采 自安徽省 ，详见表 1。
表 1 材料 来源
Table 1 The origin of materials
1．2 nrDNA的 ITS序列
用于 DNA提取的材料均为新鲜叶片 ，总 DNA
提取方法为CTAB法(马兵钢等，2000)。PCR反应
过程及所用 引物参 照王建波 (1999)。PCR扩增产
物用 Wizard丁M PCR Preps DNA Puridication Svs—
tern(Promega公司)纯化后直接作为测序模板。测
序工作在中科开瑞芯片股份有限公 司的 I)NA 自动
测序仪上完成。每种植物的 ITS序列均用 P1和 P4
引物正反链测定，保证序列测定的准确性，所得的
ITS序列包 括 5．8SrDNA。序 列经用互 补链校对
后 ，参照 GenBank上检索号为 AF537546的序列确
定非 编码 的 ITS1和 ITS2的边 界。序列 排列 用
Clustal X程序进行对位排列 ；进一步用人工核对排
列。持排好的序列运用 Maga软件构件 ITS树，进
行 系统 发育分 析 ，并用 自展 法 (boolstrap)进行 检
测，自展数据集为 1 000次结果。
1．3叶的形态解剖
选择正常植株上 的完整成熟叶片(第 3片叶)，
剪取叶中部 0．5 Crn x 0．5 Crn 的小块 ，用 FAA 固
定，采用常规石蜡切 片法 ，切 片厚度为 12 m，番红
一 固绿对染 ，中性树胶封 片，然后在 OI YMPUS显
微镜下观察 和拍照 。
2 荚验结果
2．1 ITS序列分析结果
本文 测 定 了 6种 大 戟 属 植 物 的 ITS(包 括
ITS1，5．8SrDNA，Iq、S2)序列(含栽培种一品红)，用
人工核对排列 ，持排好的序列运用 Maga软件构件
ITS树，进行系统发育分析，并用 自展法(bootstrap)
进行检测 ，自展数据集为 1 000次结果详见图 1。如
图 1可知 ，大戟、月腺 大戟和乳浆大戟归为一大支 ，
而地锦与斑地锦归为另一大支，其 中的一品红(E．
pulcherrima)为栽培种，在此不做分析。
2．2叶片解剖特征观察结果
5种大戟属植物 叶片厚度在 104～227 p-m 之
间 ，都由表皮、叶肉和叶脉构成，其 中大戟、月腺大戟
和乳浆大戟叶片结构较相似，表皮为一层长方形 、圆
形细胞 ；栅栏组织为一层含较 多叶绿素的近长柱形
细胞 ，海绵组织为 4～5层排列较疏松的细胞 ；但三
者的厚度比、排列密度及疏松程度不 同，大戟、月腺
大戟栅栏组织排列稍疏松 ，海绵组织排列也疏松，栅
栏组织与海绵组织厚度比分别为 0．77与 1．0；乳浆
大戟栅栏组织与海绵组织细胞排列紧密 ，栅栏组织
与海绵组织厚度 比分别为 1．43(表 2和图 2—8)。而
地锦和斑地锦叶片结构 明显不 同于以上三种植物 ，
在栅栏组织和海绵组织之问 ，可 以看到许多呈椭 圆
形或近圆形的乳汁管，乳汁管由一层原生质浓厚 ，染
色较深的分泌细胞包 围，外 围由数层鞘细胞围绕，它
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2O 广 西 植 物 26卷
们构成一种特殊结构。
3 分析与讨论
通过 ITS序列分析 ，结合解剖学研究 ，可以得
到以下结论 ：
(1)通过 ITS序列分析结果表 明，所研究 的大
戟属 5个类群可分为两大支。其中地锦和斑地锦为
一 分支，其具有强的支持率(100 )，说明两者的亲
缘关系很 近。而大戟 、月 腺大 戟和乳 浆大戟具 有
93 较强的支持率而聚为一类 ，也有较近的亲缘关
系，其中大戟和月腺大戟间的亲缘关系较乳浆大戟
更 近 。
(2)从 叶片内部结构观察结果可以看出大戟、月
E．pekinensis
E．ebracteolata
E esula
E．pulcherrima
Ehumifusa
Ksupina
图 l 基于 ITS区序列分析得到的系统树
Fig． 1 The parsimonious trees based on sequences of ITS
分支 L的数字是 1 000次重复抽样检测的bootstrap值
Sequence numbers above branches are bootstrap、，alues( )of 1 000 replications
表 2 大戟属叶片的解剖特征比较
Table 2 The comparison of leaf analomy of Eupkorbin
注 ：
．
uE “pp。 epiderm一上表皮；LE—l。wcr eplde rI1：下表皮：PT=palisade tissue一栅栏组织；ST=sf)()f1gy tissuc：海绵组织
：TL： thick
。fl。 yes= t片厚度 ；I—c layer。f cels==细胞层数 ；TC—tblckncss。f ccls一细胞 厚度 ：TPT=thickne s。f p}lisade sue
一 栅栏组织厚 度 TST
—thickness of spongy tissue=海绵组织厚度 ；C=compact~紧密 ：L一1o。se：疏松
。
⋯ 。 。 ‘ ⋯
腺大戟和乳浆大戟叶片结构较相似，其中大戟、月腺
大戟结构更为接近 ，而地锦和斑地锦 的叶片结构也
相似，此结果与 ITS序列分析结果相一致。
总之 ，本实验通过植物 nrDNA 的 ITS序列及
叶的比较解剖学两方面对 5种大戟属植物进行分析
和研究 ，所得结果完全吻合 ，为进一步开发和利用该
属植物的系统分类研究提供了新依据。
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图 2 8
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