全 文 ：广 西 植 物 Guihaia 23(5)：464— 469 2003年 9月
蔗糖对 牛角藓愈伤组织悬浮细胞 的生理学影响
高永超 ，薛 红 ，沙 伟
(齐齐哈尔大学生命 科学与：E程学院生物 系，黑龙江齐齐哈尔 161006)
摘 要 ：以 MS培养 基为基本 培养基 ，对 牛角藓(Cratoneuronfilicinum)进 行 了细胞 悬浮培养 。研究不 同蔗
糖浓度对细胞生长规律及其生理生化特性的影响 ，结果表 明蔗糖是悬 浮培养过 程 中重要 的碳 源 ，是细胞生 长
的能量来源和构成细胞骨架的主要成分 。蔗糖浓度为 30 g／L对细胞生长最为有利 。
关键词 ：牛角藓 ；悬 浮培养 ；蔗糖
中图分类号 ：Q943 文献标识码 ：A 文章编号 ：1000—3142(2003)05—0464—06
Physiological effect 0f sugar 0n the suspended
cell 0f Cratoneuron filicinum
GAO Yong—chao，XUE Hong，SHA W ei
(Department of Biology，College of Life Science and Engineering，Qiqihar University，Qiqihar 161006，China)
Abstract：In this paper，using MS medium as a basic medium ，the author studied the effect of different concen—
tration of sucrose on the physiology and biochemistry of the suspended cell of Cratoneuron filicinum．The re-
sult shows that sucrose is the important source of carbon．It is the sources of the energy and the main compo-
nent of cell structure．It is the best for the growth of suspended cell in the concentration of 30 gram per liter．
Key words：Cratoneuron filicinum；suspension culture；sugar
牛 角 藓 (Cratoneuron filicinum)为 柳 叶藓 科
(Amblystegium)，牛角藓 属 (Cratoneuron)植 物 。主
要分布于我 国黑龙江省(大兴安岭、小兴安岭)、吉
林、辽宁等地。此藓种是湿生藓类 ，其植物体较粗
壮 ，羽状分枝，叶基宽大 ，角部下延角细胞分化明显，
梢带黄褐色，常突出。多生于林 区塔头沼泽地或沼
泽地(敖志文等，l992)。本实验 旨在通过对牛角藓
细胞进行悬浮培养，以进一步了解培养基 中几种成
分对苔藓植物悬浮细胞生长情况和一些生理生化特
性的影响，并为今后详细研究其次生代谢产物打下
基础 。
苔藓植物组织培养在国内的研究较落后 ，利用
苔藓植物的愈伤组织进行悬浮培养的报道极少 ，徐
产兴(1986)对地钱(Marchantia polymorpha)悬浮
培养物的研究进行了初步的介绍 ，但未见到相关报
道。国外在这方面的报道较多，并且大部分是利用
植物细胞悬浮培养的技术研究和生产苔藓植物中含
有的特殊的次生代谢产物(Nabeta等，l996；Tazaki
等，l996；Matsui等，l996；Matsuo等，l996)。本试
验以配子体作为外植 体诱导出的愈伤组织作为原
料，建立了松散易碎 ，生长旺盛的悬浮细胞系，对在
不同培养基成分上悬浮细胞的生长情况及其生理生
化特性进行 了较 细致的研究 。
1 材料和方 法
1．1材料
试验所用的材料采于大兴安岭克一河杜鹃山
收 稿 日期 ：2002—08—05 修订 日期 ：2003一O1—20
基金项 目：黑龙江省教育厅资助项 目(9551093)
作者简介：高永超(1 977一)，男 ，硕士生，主要从事植物遗传学研究。*为通讯作者
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5期 高永超等：蔗糖对牛角藓愈伤组织悬浮细胞的生理学影响 !!
庄，材料采集后用无菌土培养，上面覆盖一层塑料
膜 ，以保 持水 分 。
1．2愈伤组 织的诱导与继代
(1)取材 ：选 取室 内培养 的 牛角藓 的幼嫩 茎段 。
(2)消毒 ：用 0．01 9／5的 HgC1 灭菌 10 S，然后用无菌
水 冲洗 4～5次 。(3)接种 ：将 消毒 后 的茎 段切 成 1
cm左右的小段，接在愈伤组织诱导培养基(MS+2，
4一D 2 mg／L)上 ，调整 pH 至 5．8，每瓶 接 3～4段 。
在 24~26℃诱导愈伤组织 。(4)继代 ：诱导出愈伤
组织后 ，每隔 2周继代 1次，继代时挑选生长状态良
好 ，嫩绿色 的愈 伤组 织 。
1．3愈伤组织 的悬浮培养
(1)取材 ：选取继代两 次 以上 、生长 旺盛 、结构疏
松的愈伤组织 。(2)接种 ：用镊子轻轻夹 取愈伤组织
(注意 ：不要带有固体培养基)，放在含有不同成分的
50 mL MS液体培养基 中，振荡使制成单细胞悬浮
液。用灭过菌的吸管吸取 5 mL悬浮液，加入到 45
mL液体培养基中，振荡培养 。每 50 mL培养基 中
加约 0．1 g·DW 愈伤 组织 (即 2 g·Dw／L)。(3)
悬浮培养：摇床转速为 100～110 r／min，室温 ，漫射
光 下培养 。
1．4悬浮细胞生长速 率的测定 (周 春江等 ，2002)
悬浮细胞生长量测定采用细胞干重法。将 1～
2瓶细胞 悬 浮 液 用 双 层 滤 纸 过 滤 ，60℃ 烘 干 约 12
h，至恒重 ，称重后计算干重 量 。
增 加干重(AG )一
测量干重 (G )一接种干 重 (G。)。
然后换算成每升培养基增加 的细胞干重克数。即
g／L，表示细胞生长速 率 。
1．5可溶性 蛋白含量的测定 (上 海市植 物生理学 会 ，
1999；段 辉 国，2000)
(1)取材 ：细胞 悬浮液 3 500 r／min离 心 15min，
弃上清液。(2)可溶性蛋 白的提取：取沉淀物 0．5 g
· Fw，加 5 mL预 冷 的 0．2 mol／L磷 酸缓 冲液
(pH6．0)冰浴研磨，10 000 r／min离心 20 min。保
留上清液用于测可溶性蛋 白的含量。(3)测量光密
度 ：取 0．5 mL的可溶性 蛋 白提 取 液 ，加 5 mL考玛
斯亮蓝 试剂 ，静止 2 min，用光 径 为 1 cm 的 比色 杯 ，
以蒸馏水作空白调零，721型分光光度计在 595 nm
处读取 光密度 值，mg／g·Fw 表 示蛋 白质含 量。
(4)标准曲线的制备：称取 100 mg牛血清蛋白溶于
0．9 的 生 理 盐 水 中，定 溶 至 100 mL，制 成 1 000
~g／mL母液 ，再配制成每 0．1 mL分别含 0、10、20、
30、40、50、60、70、80、90、100／~g／mL的标准 液。准
确吸取 0．5 mL上述 11种牛血清蛋白标准液，分别
放人 10 mL具塞试管 中，加 5 mL考玛斯亮蓝蛋 白
G一250染 色剂 ，放置 2 min，用光 径 为 1 cm 的 比色
杯 ，721型分光光度计在 595 nm 处读取光密度值 ，
制作标准曲线。(5)计算 ：依读取的光密度值从标准
曲线上查得蛋 白提取 液 中可溶 性蛋 白浓度 ，根 据 以
下公式计算悬浮 细胞 中蛋 白质含量 。
蛋 白质含量 (mg／g)一
蛋 白质浓度 (／~g／mL)×5 mLX 10
0．5 g
1．6叶绿素含量的测定 (华东师范大学生物系植物
生理教研 组 ，1980)
(1)取 材 ：细 胞 悬 浮 液 3 500 r／rain离 心 15
min，弃上清液。(2)叶绿素的提取 ：取沉淀物 0．5 g
· Fw，置于研钵中，加 5～6 mL蒸馏水 ，碳酸钙少
许及适量石英砂，仔细研磨成匀浆 ，用蒸馏水定溶至
10 mL。然后用移液管吸取 2．5 mL，置于一大试管
中，加入丙酮 10 mL，摇动试管，促使叶绿素溶于丙
酮中，静 置片刻，过滤后 即为叶绿素丙酮提取液。
(3)测量光 密度 ：用 光 径 为 1 cm 的 比色杯 ，以 80
的丙酮作空 白调零 ，721型分光光度计 在 663 am 和
645 am处读取光密度值，用 mg／g·Fw 表示叶绿
素含量。(4)计算 ：根据 测量得到 的光 密度 D 、
D 代人下列公式计算悬浮细胞中叶绿素含量。
CA= 12．7 D663— 2．69 D645
叶绿素 a含量 (mg／g ·FW)=
CA× × ×忐=0．1 C
CB一 22．9 D645— 4．68 D663
叶绿素 b含量(mg／g ·FW)一 0．1 cB
叶绿素总含量(mg／g ·FW)一 0．1
一 0．1× (CA+ CB)
= 0．1× (20．2 D645+ 8．02 D663)
1．7总含磷量的测定(张志 良，1990)
(1)取 材 ：细 胞 悬 浮 液 3 500 r／min离 心 15
min，弃上清液。(2)磷 的提取 ：取沉淀物 0．5 g·
Fw，加 5 mL 5 的过氯酸，用研钵于 0℃下研磨成
匀浆，3 000 r／rain离心 10 min，倾去上清液。用同
样的方法再提取 2次 ，以完 全除 去酸 溶性 蛋 白。残
渣用乙醇一乙醚一氯仿(2：2：1)混合液，于室温下
3 000 r／rain提取 4次 ，每次 提取 15 min，以除 去磷
脂 。核酸残渣干燥后 加 2．5 mL 5 的三氯 乙酸 ，放
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在 90℃恒温水 浴中水解 30 min。(3)测量 光密 度 ：
三氯 乙酸水解液 于 721型 分 光光 度 计 在 268．5 nm
处测定 OD值 ，以同样 条 件 下 (90℃ ，3O min)处理
过 的 5 三 氯 乙酸 作 为空 白调零 ，比色 杯 光径 为 1
cm。(4)计算 ：
根据 E 一9 850，用下列公式计算总磷含量：
， 、 30．98X D268． 5
乙 一 — —
C为磷浓 度(g／L)，D ¨ 为样 品在 268．5 nm 处
测得的光密度，e 为磷原子的吸收系数 。
1．8鲜、干重比例的测定(王东等 ，1997)
将细胞悬 浮 液 3 500 r／rain离 心 15 min，称 鲜
重 ，鲜细胞 置 于 60℃ 下烘 干 12 h以上 ，至恒 重 ，计
算比值：
鲜／干重一
2 结果与分析
2．1不 同蔗糖 浓度对牛角藓 悬浮细胞 生长及 生理影
响
2．1．1不 同蔗糖 浓度对 细胞 生长 的影 响 在 无蔗糖
的培养基 中，由于 细胞 得 不 到 足 够 的碳 源 ，生 长缓
慢，悬浮细胞培养液颜色变化很小，而且在培养末期
细胞的增长量还有下降的趋势。在蔗糖浓度为 15
g／L的培养基 中 ，0～4 d细胞生 长十分缓慢 ，为停滞
期；第四天后细胞生长速率开始加快 ；第八天时细胞
干重是接种干重的一倍，并且细胞始终处于增长阶
段 。在蔗糖含量 为 30 g／L的培养基 中 ，细胞增长最
快，仅在第二天细胞干重就增加了 5倍 ，第四至六天
是细胞生长的停滞期 ，第六天后悬浮细胞的干重量
呈直线上升 。由图 1可见 ，在所 设 的 3个 不 同的浓
度梯度 中 ，随着培养基 中蔗糖含量 的增 加 ，悬浮细胞
的增长速率也增加 。因为蔗糖作为悬浮细胞所必须
的碳源，对合成悬浮细胞的结构性物质有巨大的作
用 。
2．1．2不同蔗糖 浓度对细胞 内可溶性 蛋 白质含 量 的
影响 由图 2可见 ，在蔗糖含量不同的培养基中，悬
浮细胞中可溶性蛋 白质含量也不相同。不加蔗糖的
培养基中可溶性蛋 白的变化十分剧烈 ，前四天细胞
内可溶性蛋白的含量剧烈下降，而后两天又剧烈升
高，随后便急剧下降。而加入蔗糖的培养基中可溶
性蛋白的含量却先有所下降，而后随培养的时间延
长逐渐升高。蔗糖的含量越高，可溶性蛋白的含量
升高 的也越快 。
造成 上述 结果 的原 因可 能是 因为 ：在 无蔗糖 的
培养基中，蛋白质合成受到抑制，促使细胞本身的可
溶性蛋白发生降解 ，而使胞内蛋白质含量降低。降
解掉的物质又被重新利用来合成可溶性蛋白。后期
可溶性蛋 白含量降低的原因可能是由于前期合成的
可溶性蛋 白转化 为结 构性 蛋 白的缘故 (王东等，
1997)；在蔗糖含量为 15 g／L的培养基中，第六天蛋
白质含 量达到最低 ，为 0．31 mg／g；在蔗糖浓度 为 30
g／L的培养基中，第四天蛋白质含量稍有下降，然后
一 直升高，在这种培养基中蔗糖含量很高，细胞始终
处于旺盛的生长状态，因而细胞 内蛋 白质的合成 比
较旺盛 。细胞 中可溶性蛋 白含量的变化与图 1中细
胞 的生长状况是一致 的 。
=^ 誓
I DH
星-号
矗
O 2 4 6 8 1O
时间 t／d
图 1 不同蔗糖浓度对悬浮细胞
生长状况 的影 响(g·Dw／L)
Fig． 1 The effect of different concentration of
sucrose on the growth of suspended cells
O 2 4 6 8 1O
时间 t／d
图2 不同蔗糖浓 度对 细胞蛋 白含量 的影响(mg·FW／g)
Fig．2 The effect of different concentration of sucrose
on the content of soluable protein of suspended cels
2．1．3不 同蔗糖 浓度对 叶绿 素含 量的影 响 如表 1
所示 ，悬 浮培养后 无蔗糖 的培养基 中 ，叶绿素 a的含
6 5 4 3 2 1 O
c一 0 a 0 c c0u
一8／旨 一 钽皿趟
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5期 高永超等 ：蔗糖对牛角藓愈伤组织悬浮细胞的生理学影响 467
量相对于培养前有所增加 ，叶绿素 b的含量却减少
了 ，而 总叶绿素含 量基 本不 变 。在蔗糖 浓度为 l g／
L和 30 g／L的 MS培养基中，无论叶绿素 a、叶绿素
b或总叶绿素含量与培养前相比均降低 ，且蔗糖浓
度为 15 g／L时叶绿素含量最 低 。
同时亦可发现，无光照条件下叶绿素含量基本
保持不变 ，但 叶绿素 a含量有所增 加 ，叶绿 素 b含量
基本保持不 变 。这 说 明 在这 种漫 射 光下 ，如果 没 有
碳源和能源的存在，悬浮细胞就会被迫利用 自身的
光合作用器官合成 自身所需 的物质 ，叶绿素 b基本
不变 ，说明在现有 的含 量下 基本 能 满 足对短 波长 的
光的吸收，细胞内部叶绿素 a的量相对增加，促进对
长波光更好 的吸收 。
当培养基中蔗糖含量达到 15 g／L时，从图 l可
以看到，细胞的生长仍然较为缓慢，细胞的生长悬浮
细胞的生长与培养基中能量的供给基本达到平衡状
态 ，细胞基本不用进行光合作用，叶绿素的存在已没
有太 大的意义 ，因而 ，大部 分 的叶绿 素都 被分解 掉 。
当培养基中蔗糖含量达到 30 g／L时，细胞在高浓度
的蔗糖的刺激下 ，细胞生长旺盛，细胞干重增长数十
倍 ，这时，细胞内部的光合作用系统的作用又开始增
强 ，因而 叶绿 素含量又 开始 有所增加 。
表 1 不 同蔗糖浓度下培养前后细胞 叶绿素含量 比较
Table 1 The comparison of chlorophyll content in different concentration of sucrose(mg／g·FW )
2．1．4鲜／干重和总含磷 量的变化 我们还对培养
前后鲜／干重和总含磷量进行 比较。得到结果如下 ，
在无蔗糖和 15 g／L蔗糖的培养基中，培养后鲜／干
重比值均升高。在液体培养基中，蔗糖含量越低 ，溶
液的渗透势越低，从而有可能导致细胞含水量增加，
尤其是在无蔗糖的培养基中，其渗透势极低，细胞被
迫吸收 了培养基 中大 量 的水 分，以至 于鲜／干 重
(11．10)大大高出培养前(3．33)。而蔗糖浓度为 l5
g／L的培养基中培养的细胞鲜／干重(5．02)相对于
培养前也提高了很多。在全蔗糖 的培养基中，细胞
鲜／干重(3．29)与培养前相当。由此可见，随着蔗糖
浓度的加大，鲜、干重 比值趋于稳定 ，在所设的三个
浓度梯度中，蔗糖浓度为 30 g／L时对维持细胞的渗
透压最 为有利 。
另外 ，在这三种培养基中培养后的总磷含量相
对于培养前均大大降低，但在不 同蔗糖浓度的培养
基之间差距并不显著 (表 2)。因而 ，蔗糖对细胞 内
核酸含量无直接影响。王东等(1997)在对粉叶小檗
细胞悬浮培养时发现，随着细胞生长的进行总磷含
量急剧下降，到第 7 d时几 乎在培养液中检测不到
磷的存在。在细胞培养中高水平的磷含量通常对细
胞生长有促进作用 ，而对次生产物的生产有抑制作
用(StMfoed等，l986)。造成这种抑制作用的原 因
可能是细胞 内过高的能量水平会抑制次生代谢产物
— — — — — —
— ‘ ‘ ‘ ● ’ 。 。 。 。 。- ～ ‘ ●
合成途径中酶的活性 。当外界磷水平下降时，便会
导致细胞内磷的消耗 ，从而对细胞生长造成抑制。
在其实验结果 中可以看到 ，在细胞培养到 7～l3 d
时细胞内的总磷含量降到最低 ，而后再逐渐升高 ，这
与本文中对培养 l0 d后的细胞测得的结果相吻合 ，
但 与蔗糖含 量无相关性 。
表 2 不 同蔗糖浓度 下培 养前后 鲜／干重及总磷含量 比较
Table 2 The comparison of flesh—‘to·-dry—weight ratio
and general phosphorus content between
before CUlture and after culture in different
concentration of sucrose(mg／g·FW)
3 讨 论
碳源是细胞生长的能量来源和构成细胞骨架的
重要成分(邢建 民等 ，l998)。植物细胞培养一般采
用蔗糖、果糖 、葡萄糖为碳源，而蔗糖是生长效果最
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468 广 西 植 物 23卷
好的(侯学 文等 ，2ooo)。很 多实 验 已证 明高 浓度 的
蔗糖能提高培养细胞中次生代谢产物的含量 ，其原
因之一是提高了培养基的渗透压，因而刺激次生产
物的形成(甘烦远等，1997)。培养液中的蔗糖是通
过植物细胞壁上的转化酶在微酸的环境 中被迅速分
解为等分子的葡萄糖和果糖 ，而后培养细胞优先利
用葡萄糖 ，然后利用果糖 。侯学文等(2ooo)在使用
不同浓度蔗糖对玫瑰 茄 细胞 进 行悬 浮 培养 时发 现 ，
加入的蔗糖量为 20 g／L时不 利于细胞 的生 长 ，当加
入的量达到 30~40 g／L时 ，基本能 满足玫瑰茄细胞
的生长 ，而 当浓度 达到 50 g／L时 ，细胞 生长 出现 明
显的基质抑制效应 ，其原因可能是 因为在这种高渗
环境中细胞 的活力受到抑制。甘烦远等(1997)在培
养云南红豆杉时发现 ，当蔗糖浓度为 20~30 g／L时
培养的细胞生长 良好，当低于此浓度时细胞生长速
度急剧下降。这与本文中的结果相符。
苔藓植物为典型的阴生植物，它适应在荫蔽的
环境中生存 。以光 饱 和点 来说 ，阳生 植物 的光饱 和
点是全光照 的 100 ，而 阴 生植 物 的 则 是全 光 照 的
1O％～5O 。另外 ，阴生植物的基粒较大，基粒片层
数较多，叶绿素含量较高 ，这使得阴生植物特别适于
吸收漫射光中较短的波长。而叶绿素 a在红光部分
的吸收带偏向长光波方面，而叶绿素 b在蓝紫光部
分的吸收带较宽。阴生植物的叶绿素 a和叶绿素 b
的 比值小 ，即叶绿素 b的含量 相对较 多 ，所 以阴生植
物便能强烈地利用 蓝紫 光 ，而适应 于 在遮 蔽处 生长
(潘瑞 炽 等，1995)。Takami等 (1988)在对 角 苔
(Anthoceros punctatus)培养 时发现，在暗处培养的
细胞叶绿素含量很高，并且光合作用活性很强。从
表 3中可以看到，在漫射光 下细胞 内叶绿素种类及
含量的变化是与叶绿素的吸收波长紧密相关的，培
养基中蔗糖的浓度会对其产生直接的影响。
细胞 内的可溶性蛋 白含量与细胞 的生长状况 密
切相关 ，培养基中能量高 ，细胞生长快，细胞 内各种
物质合成速度相应加快 ，因而细胞内蛋 白含量会持
续的升高。但是 ，在培养期间究竟可溶性蛋 白为何
会出现先下降而后升高的现象却难以解释。王东等
(1997)在对粉叶小檗细胞悬浮培养时发现 ，悬浮培
养的前期，蛋白质含量显著增加，到第 7 d达到最大
值。他认为这是与延迟期细胞旺盛的代谢和指数生
长期细胞的分裂有关，而此时细胞 的生长尚未达到
最大峰值，前期合成的可溶性蛋白可能转化为了结
构性蛋 白。
Katoh在对地钱进行悬浮培养时发现，地钱悬
浮培养物在不 同的培养基上 营养方式可以分为 2
类：一 ，光混合营养(photomixotrophic)；二，光 自养
(photoautotrophic)。在两种不同的培养基 MSK一1
和 MSK一2对地钱进行悬 浮培养时发现 ，地钱悬浮
培养细胞叶绿体发育较好 ，叶绿素含量高，其中在
MSK一1上的培养的地钱悬浮培养物叶绿素的含量
是原来细胞的两倍 ，但是这种情况的出现依赖于光
的存在，在暗处则停止生长。MSK一2上地钱细胞营
养方式是光混合营养的，地钱细胞所需的能量主要
来源于非循环光合磷酸化，其细胞所需能量主要是
提供进一步生化反应的底物 ，而不是主要提供能量。
另外，地钱细胞还可在仅含有 2，4一D的培养基上生
长 ，地钱细胞能单一地利用大气 中的 COz作为碳
源 ，行光 自养生长。
从以上的讨论中可以得出，在牛角藓悬浮培养
中蔗糖是一种不可缺少的成分，它对于细胞的分裂
生长具有很强的促进作用。在所设的三个浓度梯度
下 ，浓度为 30 g／L时细胞 生长 旺盛 ，细胞的鲜／干 比
值比较稳定 ，细胞内可溶性蛋白含量持续保持增长，
细胞处于一种很好的生长状态。核酸含量与培养基
中蔗糖含量无明显相关性 。
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