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Analysis of genetic diversity in Thuja sutchuenensis populations as revealed by morphological and molecular data

濒危植物崖柏遗传多样性研究



全 文 :广 西 植 物 Guihaia 27(5):687— 691 2007年 9月
濒危植物崖柏遗传多样性研究
张仁波1一,窦全丽 ,何 平¨ ,邓洪平l
(1.西南大学 生命科学学院,重庆 400715;2.遵义师范学院 生物系,贵州 遵义 563002)
摘 要 :以重庆市大巴山和雪宝山的崖柏为研究对象 ,对其鳞叶的形态分化进行 了初 步研究,并用 RAPD分
子标记技术探讨了该物种在分子水平上的遗传变异。结果表明:崖柏居群内和居群间均存在着广泛的表型及
基因型的变异 ;基于形态数据建立的崖柏居群之间的关系和基于 RAPD数据建立的关系不相符;空间距离和
生态因子对崖柏居群进化的影响较小 ;崖柏居群之间的基因流水平较低;应对崖柏居群采取就地保护的措施。
关键词:崖柏;遗传多样性;形态分化 ;RAPD分子标记
中图分类号 :Q943 文献标识码:A 文章编号:lO00—3142(2007)05—0687—05
Analysis of genetic diversity in sutchuenensis
populations as revealed by morphological
and molecular data
ZHANG Ren-BoI,2,DOU Quan-Li ,HE PingH ,DENG Hong-Ping
(1,College of Life Sciences,Southwest University,Chongqing 400715,China;2.Department
of Biology,Zunyi Normal College,Zunyl 563002,China)
Abstract:This study analyzed the morphological and molecular variations of six natural populations of Th n
sutchuenensis from Chongqing,China.The morphological characters of scale leaves were measured and the morpho—
logical differentiation was studied.The molecular variations were investigated by using Random Amplification of
Polymorphic DNA(RAPD).Considerable genetic diversity was found among and within the T.sutchuenensis popula—
tions studied.Two dendrograms were independently constructed from morphological and RAPD data and the clusters
resulting from each method were not congruent.Both two dendrograms showed little correlation between clusters and
geographic regions,and there is little correlation between clusters and ecological factors.It suggests that geographic iso—
lation and ecological factors have litle influence on the evolution of the sutchuenensis populations.Conservation in situ
of sutchwenensis should be carried out and the gene flow between populations should be cautiously strengthened or not.
Key words:Thuja sutchuenensis;genetic diversity;morphological differentiation RAPD
崖柏 (Thuja sutchuenensis)隶 属于柏科 (Cu—
pressaceae)崖柏属 ,是一种常绿 乔木,为我国特有 。
该物种在 1892年被法国传教士首次发现 ,曾被认为
是已灭绝的 3种中国特有植物之一,1999年又被重
新发现 ,现已被 IUCN评估为世界级的极为濒危物
种(傅立 国,1991;刘 正宇等 ,2000;重庆 市林业局 ,
2003)。崖柏能生长于石灰岩山地 ,对环境条件 的要
求与柏木相似(中国科学院中国植物志编辑委员会,
l978)。该物种仅分布于我国重庆市东北的城口县
大巴山自然保护区和开县雪宝山 自然保护 区(近年
来据报道在四川省万源市花萼山自然保护区和湖北
省保康县五道峡自然保护区也有发现)。崖柏被重
新发现以来 ,易思荣等(2001)进行了扦插繁殖试验
并获得成功 ,刘建锋(2003)进行了居群生态学、居群
收稿日期:2006—09—04 修回日期 :2006—12—13
基金项 目:国家自然科学基金(30070080)[Supported by the Nationa!Natural Science Foundation of china(30o7oo80)]
作者简介:张仁波(1977-),男,贵州桐梓人,硕士研究生,主要从事植物分类学研究。
通讯作者(Author for c0rresp0ndence,E—mail:)
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结构与动态以及居 群空间格局与动态等研究 ,唐熙
等(2OO5)研究了崖柏木材结构的特点,李建华等
(2005)研究 了崖柏属的系统演化和生物地理关系。
1 材料和方法
1.1形态分化研究
在崖柏分布区,选取 6个居群作为研究对象(图
1)。其中龙门和葛藤坝样地位于城 口县的大巴山自
然保护区,王家岩、回龙 山、上方寨和飞龙寨样地位
于开县的雪宝山自然保护区。在样地内观察其鳞叶
生长特性 ,记录一些基本环境特征 ,挖取土壤。
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I
图 1 崖柏天然居群分布示意 图
Fig.1 Thuja sutchuenensis populations
included in the study
F:飞龙寨;G:葛藤坝;H:回龙山;L:龙门;
S:上方寨 ;W:王家岩
在每个样地内选取 l3~l5株个体,每株分上、
中、下三层各采集 1个枝条。每株在老枝上用小镊
子共选取 5对较大的侧 面叶,在末级枝上共选取 5
个较大的分节。用游标卡尺和电子天平分别测量老
枝上的侧面叶和 5个分节 ,再测量分节上的 中央叶
和侧面叶,分别记录 20项指标(表 2):分节长、分节
宽、分节长/宽 、分节厚、分 节重 、中央叶长 、中央叶
宽、中央叶长/宽、中央叶厚 、中央叶重 、侧面叶长、侧
面叶宽、侧 面叶长/宽 、侧面叶厚 、侧面叶重 、老枝侧
面叶长、老枝侧面叶宽、老枝侧面叶长/宽、老枝侧面
叶厚 、老枝侧面叶重 。
利用统计软件 SPSS l1.0中的 One—Way过程
计算各形态性状在居群内的平均值并进行显著性分
析。利用 Hierarchical cluster过 程对 83个个体的
20个性状构成的83×20矩阵进行个体水平上的聚
类分析;再将每个居群内个体的同一性状取几何平
均值 ,每~居群得 20个平 均值 ,6个 居群得 6×20
的矩阵,获得形态方面的统 计数据和居群间的聚类
结果 。
1.2 RAPD分子标记研究
在每个崖柏样地 内,各选取 l5个植株,在每个
植株上摘取当年生的少量幼嫩鳞叶,置于保鲜袋中,
加入足够的硅胶,密封保存。带回实验室后放入一35
℃保存。
用改良的 CTAB法进行 DNA的提取 ,用核酸
蛋白仪 (B10一RAD,U.S.A)测 定 DNA样 品 的浓
度,参照刘建锋(2003)的方法 (包括筛选的引物)在
扩增仪上进行 PCR扩增。RAPD产物经 1.5 琼
脂糖 凝胶 (含 GoldView 染 料)电 泳 (9 V/cm,40
rain)分离 ,每块凝胶加上一个 200~2 000 bp已知
分子量 的 DNA Marker,在 凝 胶 成像 系统 (BIO—
RAD,Universal Hood Ⅱ)中拍 照。图 2为 引物
A1 6扩增产物的电泳分离图之一。
图 2 引物 A1 6扩增产物的电泳分离图之一
Fig.2 An example of the RAPD profiles
by one of the primers(A16)
M:已知分子量的标准DNA样品。
M :DNA marker.
获得的 RAPD凝胶电泳 图片 ,采用 0(无 )和 l
(有)编码详细记录每个样品在各种引物上的条带,
不好判断的条带记为缺失数据。获得的 0、l数据矩
阵用 POPGENE 32(Yeh等,l 997)软件进行处理,
得到多态位点百分比、遗传分化系数和遗传一致度
等数据和分子水平上的聚类图。
2 结果与分析
形态性状特征的显著性分析表明:在 20项形态
指标中有 l0项达到极显著水平(老枝侧面叶长、老
枝侧面叶长/宽、老枝侧面叶重、新枝分节长、新枝分
n ∞
( . , . .
3 3 3 3 3
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节宽、新枝分节重、新枝中央叶重、新枝侧面叶长、新
枝侧面叶厚、新枝侧面叶重),2项达到显著水平(新
枝中央叶长和新枝中央叶宽)。其中侧面叶和新枝
分节各有 3项指标 的变异达到极 显著水平,说明居
群间侧面叶和新枝分节变异较大,而中央叶变异较
小。这可能是因为中央叶被侧面叶部分包被,受外
界环境条件变化的影响较小,而侧面叶暴露在外面
受环境变化影响较大,新枝上的分节则可能是因为
鳞叶比较幼嫩而容易受环境的影响。
在鳞叶生长状况方面,以葛藤坝居群和龙门居
群为好。可能的原因是:龙门居群位于山脚,紧靠河
流,水分条件较好 。而葛藤坝居群虽然位于山腰 ,但
它与其它 3个处于陡峭山脊的居群不 同。该居群所
处样地海拔较低,且位于两山相夹的山谷地带,风力
较小,夜间环境温度较高。
通过崖柏居群的形态聚类图(图 3)以及居群分
布图(图 1)可以看出,崖柏居 群并 非按 照空 间距离
的远近聚在一起 ,较近的居群可能隔得很远 ,较远的
居群反而可能聚在一起 。这可能是由于形态特征容
易受到环境 因子的影响,并不是真正基因型的反映。
在分子水平上,崖柏居群也未按空间距离之间
的联系聚在一起(图 4)。这可能和各个居群位于不
同的生态环境有关 。地理距离近的居群可能生态环
境大不相同,同样 ,地理距离远的居群可能生态环境
极为相似。如果在环境选择压力的作用下,不 同居
群之间的分子变异可能与地理隔离联系不大。汪小
全等(1996)还发现遗传变异水平与银杉居群生境的
复杂程度有一定的相关性 。
崖柏种内多态位点 比率为 72.O9 ,Nei基因多
样性指数为 0.301 5,Shannon遗传 多样性指数 为
0.436 0,均属较高水平。虽然风媒植物大多具有很
高的遗传多样性 ,但考虑到其极其狭窄的分布 区,其
多样性水平是非常高的。
小群体 问的基 因分化 系数 (Gst)平均值为
0.160 4,说明小群体间的遗传分化不大。大部分遗
传变异存在于居群之内(83.94 ),与风媒异交植物
的遗传变异主要分布于群体内这一规律是一致的。
崖柏各居群间的遗传一致度平均值为 0.922 1,
说明居群间保持了较大的基因相似度。这可能是由
于以前崖柏处于连续的大居群状态,只是由于环境
的破坏和过度砍伐使其变为地理上隔离的小居群状
态,居群间基因交流被阻断的时间不是很长。
崖柏居群问的基因流(Nm)平均值 为 2.617 7,
CASE
LabeINU
F 2
W 5
S 4
G 3
H 1
图 3 崖柏天然居群形态水平上的聚类图(SPSS软件)
Fig.3 Dendrogram of the natural populations of
T.sutchuenensis by morphological characters
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图 4 崖柏天然居群分子水平上的聚
类 图(POPGENE32软件)
Fig.4 Dendrogram of the natural populations of
T.sutchuenensis by RAPD markers
说 明居 群 之 间 的基 因 流水 平 较低 。虽然王 中仁
(1996)认为 Nm>1时,居群之间就有足够的基 因
流。但是 Hamrick等报道 了 4种针 叶树的 Nm值
一 般在 5.3~37.8之间(刘建锋 ,2003)。相比之下
崖柏居群之间的基 因流明显处于较低水平 。
3 讨论
刘建锋(2003)进行了崖柏居群生态学研究,发
现崖柏种内具有较为丰富的遗传多样性。群体内的
变异占种内变异的大部分,而群体间的遗传变异较
小。崖柏群体间基因流动贫乏,遗传漂变成为刻划
群体遗传变异的主要因素。与其研究结果相比,本
文的研究结果也 同样表明崖柏种 内具有较为丰富的
遗传多样性,小群体间的遗传分化不大。但相比之
下崖柏种内的遗传多样性水平略有下降而居群间的
基因流略有上升,这可能是由于采样地点的不完全
相同和居群内植株选择的不同引起的。
Mosseler和 Brauner等发现濒危植物的遗传多
样性普遍较低(张晗等,2003),而遗传多样性单一会
导致适应力的下降,一旦外界环境出现变故容易导
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致物种灭绝(赵锦等,2000)。但濒危植物的遗传多
样性不一定低。葛颂等(1999)研究了濒危物种裂叶
沙参遗传多样性,发现该物种具有很高的遗传多样
性,并未出现遗传变异性的下降。目前国内对柏科
濒危植物的研究还较少(本文的研究对象属柏科),
而对于相近的松科和杉科研究较多。研究发现,有
的濒危松杉目植物遗传多样性较低,如银杉(葛颂
等,1997)和资源冷杉(苏何玲等,2004)等,而有的濒
危松杉目植物遗传多样性较高 ,如红皮云杉 (王秋玉
等,2004)和秃杉 (宋丛文等,2004)等。本文的研究
印证了濒危植物的遗传多样性不一定低这一观点。
致使资崖柏濒危的首要 因素可能是严重的人为
砍伐对其直接的破坏。当有急性病因存在时,物种
灭绝的原因(某种意义上来说)与遗传多样性丧失
没有关系,挽救濒危物种应该首先解 除物种生存所
面临的确定性威 胁(张大勇等 ,1999)。环境的破坏
和过度材用导致现有的崖柏居群处于岛屿状的隔离
生境中。而生境的片断化又是引起植物濒危的原因
之一(陈小勇等,2000)。无论根据居群遗传学理论
还是生态学原理 ,人们 都希望濒危物种 在其地理分
布区内维持多个相互独立的居群(张大勇等 ,1999)。
对片断化居群的保护首先应尽快恢复居群大小,使
遗传变异的丧失减少到最低程度。
生境竞争力的大小对崖柏的濒危可能有一定的
影响。阔叶树种对崖柏生存的挤压可能导致其濒
危。崖柏现实的分布 区可能并非是其最适生境,而
是一种“致危生境”,这种生境增加了居群自交、遗传
多样性下降和遗传漂变的机会(张文辉等,2002)。
但从传粉和基因交流这一角度来看 ,大 多数崖柏居
群所处的严酷生境又是 比较适合的。陡峭的山脊地
势比较开阔,所受的风力较大,传粉时在晴天容易形
成花粉云进人高空,在一定 的情况下 降落到另一个
居群 中。
此外,崖柏 自身的生物学特性 、生活史对策以及
种问杂交也可能对其濒危也起到了一定的作用。崖
柏具有发育缓慢、生殖迟缓 、大种子、小收获量和寿
命长的特点,在一定情况下对居群的更新和扩展是
不利的。
根据崖柏居群的现有状况 ,提 出以下几点保护
措施:(1)就地保护。崖柏居群有一定的自然更新能
力:有的居群内幼苗数量较多;崖柏种内具有较为丰
富的遗传多样性。现已建立了2个主要以崖柏为保
护对象的自然保护区,已经展开宣传及保护工作。
还需进一步加强对崖柏居群生存环境的保护,防止
人为破坏(在上方寨居群和飞龙寨居群中,还有直径
较大的伐桩残留),使崖柏居群能安全度过瓶颈效
应 ,恢复到大居群状态 ,从而容易保持原有的遗传结
构。(2)迁地保护 。崖柏 的扦插繁殖试验 已获得成
功,通过对其进行扦插繁殖,增加崖柏个体数量,到
一 定程度时回归自然。(3)建立资源种质保存基因
库。贮存崖柏球果等器官,保存种质资源。
崖柏居群问的基 因流水平较低 ,说明遗传漂变
成为刻划 崖柏 遗传 结构 的主要 因 素 (刘建 锋等 ,
2003)。而小居群的遗传漂变一般被认为是物种灭
绝的一个主要因素。但对于是否加强崖柏居群之间
的基因交流这一问题要慎重对待。因为现有的崖柏
居群内遗传变异水平较高,居群之间并未出现明显
的分化,说 明居群之 间还是存 在频繁的基 因交流。
崖柏属风媒植物 ,花粉能远距离传播 ,居群问基因流
可以减轻片断居群间的空间隔离效应 ,从而增加总
居群的有效居群大小 ,减轻小居群的近交衰退以及
遗传变异的丧失(陈小勇等,2000)。如果随意加强
其基因流 ,可能导致居群内适应各个异质性生境 的
特化基因消失从而降低物种的适应性。
在研究过程 中得 到了重庆市林业局、城 口县林
业局和开县林业局的大力协助,在此表示衷心感谢 !
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