全 文 ：广 西 植 物 Guihaia 26(5)：459— 463 2006年 9月
莲 Co t-1 DNA的荧光原位杂交分析
刁 英 一，佘朝文1*，胡中立1，宋运淳1
(1．武汉大学 发育生物学教育部重点实验室 ，湖北 武汉 430072；2．重庆文理学院 生命科学系，重庆 402168)
摘 要：为分析中国莲 Cot一1 DNA在其中期染色体上的分布，从中国莲基因组 DNA 中分离出C0￡一1 DNA，将
基因组和所分离的 C0￡一1 DNA用生物素标记后作探针，对中国莲染色体进行原位杂交。杂交结果用耦联有荧
光素 Cy3的生物素抗体检测 ，发现在每对染色体上均显示出特定的荧光原位杂交带。同时分析了 FISH 和
GISH信号分布的异同。基于 C0￡一1 DNA荧光原位杂交带型及染色体型，构建了中国莲核型。
关键词 ：中国莲；Cot-1 DNA；荧光原位杂交；基因组荧光原位杂交；核型
中图分类号 ：Q943．2 文献标识码：A 文章编号：1000—3142(2006)05—0459—05
Study on Co t一1 DNA of Nelumbo nucifera L．
by fluorescentca 1。／／sz‘tu ’hy’brl⋯dlzat l‘on
DIAO Ying 一，SHE Chao—wen卜 ，HU Zhong—li ，SONG Yun—chunI
(I．Key Laboratory of MOE for Plant Developmental Biology，Wuhan University。Wuhan 430072。China；
2．Department of Life Sciences，Chongqing University of Arts and Sciences，Chongqing 402168，China)
Abstract：In order to study the distribution of Cot一1 DNA in Nelumbo nucifera，Cot-1 DNA was extracted from
its genomic DNA，labeled with biotin—l1一dUTP and in situ hybridized．So did the genomic DNA．The hybrid—
ized locations were detected with streptavidin Cy3．Specific fluorescence in situ hybridization(FISH)signals
were detected on all individual chromosome pairs． The differences of the signals between Co t一1 DNA FISH
and GISH were discussed．The karyotype has been constructed．on the basis of both Co t-1 DNA FISH ban—
ding patterns and chromosome morphology．
Key words：Nelumbo nucifera L．；Cot-1 DNA；fluorescence in situ hybridization(FISH)；genomic in situ hy—
bridization (GISH)；karyotype
莲 (Nelumbo nucifera)是一种古老的植物 ，是
被子植物中起源最早的种属之一 。现代莲属植物仅
存一种，即莲；其下具有两个亚种即开粉红花和白花
的中国莲和开黄花的美国莲 。莲在 中国是一种著名
的文化植物，被视 为佛教的 四大圣物之一。莲具有
较高的经济利用价值，人们常根据功能将莲分为花
莲、籽莲和藕莲。在园艺上，莲因其株型美丽已经成
为了不可缺少的水景植物，通过人们长期 的选育 已
经有上百种观赏品种 (倪学明，l987)。莲还是一种
重要的药用植物，全身都可人药，目前对于莲的药用
价值的开发正日益受到重视。对莲的研究主要集中
在优良品种的选育等应用型研究上，其遗传学基础
研究还相对滞后，大部分停留在传统的核型分析上
(王宁珠等，l985)，比较粗放 ，而揭示 出的信息量较
收稿 日期：2006-05-II 修回日期 ：2006—06—20
基金项目：国家 科技 攻关 项 目(2002BA546C)；湖 南省科 技 攻关 重 大项 目(2002AA205A)；武 汉市 科 技攻 关 重点 项 目
(20022005I32)[-Supported by National Key Technologies Research and Development Program of China(2002BA546C)：Key Tech—
nologies Research and Development Program of Hunan Province(2002AA205A)：Key Technologies Research and Development Pro—
gram of Wuhan City(20022005I32)1
作者简介：刁 英(I978一)，女 ，重庆市永JI1人，博士生 ，从事植物分子细胞遗传学与植物转基因研究 。
’通讯作者(Author for correspondence，E—mail：huzhongli@whu．edu．cn)
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460 广 西 植 物 26卷
少，目前已经有研究者将分子生物学技术引进到莲
的研究中来 ，并且取得了一定的进展，如将先进的荧
光原位杂交技术引进了对莲的分子细胞遗传学研究
(Diao等，2005)，利用分子标记对莲进行遗传作图，
克隆莲中氧化途径 中的重要代谢酶类的基因等。
许多植物基因组中含有很高 比例的重复序列 ，
例如水稻基 因组 中重 复序列 占到 50 (McCouch
等 ，1991)，而柠檬中则 占到 95 (Flavel等，1974)。
亲缘关系较近的物种的特异性重复序列可能有很大
的不同，亲缘关系较远的物种能有相似的特异性重
复序列。C0t-1 DNA仅仅含有高度和中度 DNA重
复序列，不含有单及低拷贝序列 。Yan等人 (1998)
研究表明在 BAC等大片段克隆 的 ISH in situ hy—
bridization)中使用 C0t-1 DNA封 阻是非常必要的，
封阻的使用保证了试验结果更为精确可靠。荧光原
位杂交技术(FIsH)是分子细胞遗传学研究的一种
主要的技术。它可以直观进行物理作 图以及进行物
种进化的研究。目前 BAC-FISH、YAC-FISH在植物
中的运用越来越多，植物 Cot-1 DNA的使用随之增
多。由于重复序列在植物进化研究中的广泛运用，因
此本实验室制备了莲的Cot一1 DNA，并在莲的中期染
色体上进行了原位杂交，试图对重复序列在莲染色体
上的分布状况进行研究 ，同时探讨 Cot-1 DNA作为研
究分类进化的一种方法的可行性。
1 材料与方法
1．1试验材料
中国莲由武汉大学莲藕中心提供。其幼嫩根尖
用于染色体标本制作，嫩叶用于基因组DNA的提取。
1．2实验方法
1．2．1植物总 DNA 的提取 取新 鲜嫩叶 ，总 DNA
提取采用 CTAB法(Doyle等，1988)。
1．2．2莲基因组 DNA的打断及 Cot-1 DNA制备
将纯化的莲的基 因组 DNA用超声波打断至 100bp
至 1 000 bp的长度 ，根据 DNA动力学公式 Cot一1
一mol／L×Ts，计算所需 C0t-1 DNA完全复性的时
间 ，利用 S1核酸酶特异性地切除尚未复性的单或低
拷贝序列，可得到所需的 C。t-1 DNA。具体方法参
见 Zwick等(1997)。
1．2．3莲中期染色体标本的制备 参照 Dilfi等
(1990)的方法并略作修改。取生长旺盛的根尖，在
水饱和的 a一溴萘溶 液中于 25℃处理 2．5 h，切取 1
mm左右根尖，0．075 mol／L KC1前低渗处理 30
min，甲醇 ：冰醋酸(3：1)固定，双蒸水充分清洗根
尖 ，2 的果胶酶及纤维素酶 1：1混合 28℃下酶解
3～4 h，双蒸水后低渗 30 min火焰干燥制片，一20~C
贮存备用 。
1．2．4探针标记 用生物素标记莲基 因组和 C0￡一1
DNA，采用切刻平移的方法(nick translation)，15℃
下反应 2．5 h，加 5 L终止液(0．5M EDTA)终止反
应 。具体参照 Promega公 司生产的切 口平移标记
试剂盒 。
1．2．5杂交及信号的检 出 参 照 Hans等(1999)的
方法略加修改 ，具体 为：将 制好 的 片子 65℃烤 30
min，RNA酶(0．1 mg／mL)37℃处理 30 min，用 2×
SSC(0．3 mol／L氯化钠 0．03 mol／L柠檬酸钠混合
缓冲液)洗 3×5 min，然后用 胃蛋 白酶 (5／~g／mL)
37℃处理 15 min，用 2×SSC洗 3×5 min，1 的福
尔马林处理 10 min，用 2×SSC洗 3×5 min，70 、
95％和 100 梯度酒精脱水(各 2 min)，干燥。用随
机引物法标记的探针 ，配成杂交液(杂交液为 25 L
20％硫酸葡聚糖 ，6 L探针 ，18 L 50 甲酰胺 50
mmol／L磷酸缓冲液混合溶液)，50 L／片，80℃共
变性 2．5 min，然后 37℃杂 交过夜。20％的甲酰胺
(用 2×SSC稀释)42℃处理 3×5 min，依次用 2×
SSC 和 1× TN (0．1 mol／L Tris—C1，0．15 mol／L
NaC1缓 冲液)洗 ，然后 用 100 L／片 TNB(TN+
0．5 blocking)37℃处理 30 min，接着对于生物素
标记的探针用链抗亲和素一Cy3(Strepavidin—Cy3)和
生物素化链 抗 亲 和素 (Biotinylated—anti—streptavi—
din)检测。观察时，载玻片用 1／~g／mL DAPI复染 。
制片在 Olympus BX60荧光显微镜下观察。利用
Sensys CCD 1400E系 统 和 V“ 软 件合 成 图象，
Photoshop软件处理图片。
2 实验结果
2．1莲基因组 DNA的提取 、打断及 c0t-1 DNA制备
莲基因组 DNA提取结果见图 1，超声波打断的基
因组 DNA结果见图 2，其片段集中在 250～1 000 bp之
间，制备的C。t-1 DNA结果见图 3，其片段主要也集
中在250～1 000 bp。其中打断的基因组DNA和制
备的 C0t-1 DNA 的片段长度在 100～1 000 bp之
间。调整 C。t一1 DNA的浓度至 1 g／ L。
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5期 刁 英等：莲C 一1 DNA的荧光原位杂交分析 461
2．2荧光原位杂交
在间期棱上，红色信号呈弥散状分布于整个棱
上，其中可见有个别较强 的信号点 (图 4tA)说明基
因组探 针 除 了个 别 区域 外 分 布 较 均匀 ；而 l
DNA探针在 间期 核上 的红色 信号明显没有 基囡组
探针的信号多，但是也有较强的信号区域出现(图
4，B)。以莲的基 因组为探 针对 莲的 中期 染色体 进
行 自杂交的结果 显示 ，荧 光信 号在整个染 色体 上呈
现出潦染的状态．而且在染色体的着丝粒，端粒及随
体区域 等位置信 号更 强 (图 4，c)。莲 t-1 DNA
探针在莲酌中期染色体上呈现出了红色的明亮 的荧
2000h P
1 000h P
7 50bD
500b P
2 50b口
1 00b P
图 1 莲基因组 DNA电泳结果
Fig l Prepa~atiorL o．r total ge~-omic DNA of N tueifera I
^为莲基 因纽 DNA：M 为 DL2000 marker。
2000b P
1 000b P
750bO
500h0
2 50hD
1 00bp
圈 2 趣声敞打断莲基因组后电泳结果
Fig．2 Auulclave shearing ol total genomic
DNA of N c￡rPrn I ．
A为 断的 DNA‘M 为 DL200OmBrker
光信号 ，主要集 中在端粒 ，着丝粒及随体 区域。在 l
号染色体的长臂上也出现了两对明显的红色荧光信
号(图 4，D)。
2．3莲的基于 c0t-1 DNA FISH的核型及基于 GISH
的核型
将莲的同源染色体按照其相对长度依次排列，
其中随体染色体放在最后分别定为第 7号和第8号
染色体(图 4：E，F) 从 排列的核 型上可 见到t基
因组和 Gt-1 DNA探 针的杂 交信号在 同源染 色体
2000h P
1 000b P
750bD
500bp
250bp
1 00bP
图 3 莲的 岛 一1 DNA电泳结果
Fig 3 Preparation of C 一l DNA
A， l一1 DNA{M ，DL2000 m~rker
上的分布较为一致 。
3 讨论
莲基因组DNA探针在整个间期核及染色体上
都有杂交信号分布，只是信号的强弱有差异。以莲
的 cc L DNA为探针对莲的中期染色体进行荧光
原位杂交的结果显示出了较为恒定的杂交信号 两
者相似酌结果是在染色体末端．敬缢痕以及着丝粒
等区域有较强的信号分布 植物染色体的重要组成
元件包括了端粒，着丝粒以及次缢痕，这些结构在保
证染色体的结构的完整性和正常的复制分裂行为上
起着重要作用，这些区域主要是由各种高度或中度
重复 序列组成 ，虽 然 目前这些 重复序列的功能并未
完全 了解 ，但 是可以肯定 的是 重复序列在保证染 色
体正 常发挥功能上是必需的(Lima de—Far[a·1983)。
同时，以前的研究结果表明莲的异染色质区主要集
中在着丝粒、端粒及次缢痕处．在 1号染色体的长臂
上也有异 染色 质 中心 (刁 英 等 2004)t目前 巴t—l
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26卷
瞄4 莲 r．I I)NA I：ISH厦GISH筇
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更容易削断ml高度 l巾鹿 复序列在 色作上的分
布状况 ：莲巾．I号染色体的长什上就 们对叫
的重复序刊的分布，而 他 包怍上就主要是端
航、符丝粒秆I核桥I』水DNA的重复序列的分m 对于
I 染 色作 K骨上 的 重复序列 的 信 呼 有 舒 -·f能
挂端 佶号(Diao等．2005)．仉H余的fi弓的蘸复
宁列的纽成9l懦 要地一步 f究
C }一1 DNA仅青有钶度和中度重复晌 DNA．小
l司的植物 复序列所I 比洲 ：同 从而导致f f-l
DNA f由J · 『叫．r般 f_I DNA J I植物 I)N^ 的
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5期 刁 英等 ：莲 Co￡一1 DNA的荧光原位杂交分析 463
G 一1 DNA仅含有高度和中度重复的 DNA，不
同的植物重复序列所占的比例不同，从而导致 Co￡一1
DNA的产量不同，一般 Co￡一1 DNA 占植物总 DNA
的 1／10至 1／20(Bennett等 ，1991)。因为莲的基因
组较小，从莲的 Co￡一1 DNA FISH 的结果看来 ，信号
分布的范围占整个染色体不多的区域，所以其重复
序列在基因组中的总量不多 。
Co￡一l DNA FISH 结果显示 ，同源染 色体上 的
信号相对一致，目前在人类中已经成功的进行了
C0 一1 DNA显带分析(Wang等，1995)，因此对于那
些染色体较小或是染色 体形态相近较难 区分的植
物，可以通过 Co￡一1 DNA FISH的结果进行同源染
色体的识别 ，为有效识别同源染色体 ，建立准确的核
型提供了一种较为新颖的方法。
目前 Co￡一1 DNA主要应用在 ISH上，通过其所
含的高度和中度重复序列与标记探针 中的重复序列
产生竞争性杂交 ，起到“封阻”的作用 ，从而避免探针
中重复序列与基 因组 DNA非 特异性 结合 ，避免了
许多假阳性信号的产生，在较大片段的探针如 BAC
和 YAC的染色体原位 杂交 中得 到了广泛 的运用
(覃瑞等，2000；R~yashri等，1998)。Cot-1 DNA作为
基因组的重要组成成分，对其 自身的研究和应用研究
开展的非常有限。在人类 的中期染色体上 Co 1
DNA带纹的发现，为染色体结构研究提供了一种新
的思路。重复序列 由于所受 的选择压力较小 因此具
有相对较高的可变性，其在近缘或远缘物种的基因组
之间的分布和组成存在着一定的差异 ，因此重复序列
在研究植物基因组结构和功能的关系，以及提示植物
基 因组在进化上 的关系上有重要作用 (柴 守诚等，
1999；Kato等 ，1998；Britten，等 ，1968)。由此看来 ，
研究 Cot-1 DNA及其在基因组中的分布可以成为研
究植物基因组组成和进化的一种有效的手段。莲是
一 种介于单子叶和双子叶之 间的植物 ，通过研究 比
较莲的 Co￡一1 DNA在其近缘种属及品种间的差异，
能够为分类学和进化研究提供新的手段和证据 。
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