全 文 ：广 西 植 物 Guihaia 23(3)：240—242 2003年 5月
影响油菜下胚轴外植体芽高频率再生的因素
卢龙斗1，张 胜2，段红英1，高武军1，魏开发
(1．河南师范大学生命科学学院，河南新乡 453002；2．漯河职业技术学院，河南漯河 462000)
摘 要：以芥菜型油菜DB3的下胚轴为外植体，分析了苗龄、激素、AgNO3对油菜外植体的高频率再生的影
响。结果发现，3～5 d的苗用于诱导愈伤组织较佳，6一BA 1．5 mg／L+NAA 0．1 mg／L的组合对下胚轴芽的分
化较好，AgNOa可提高下胚轴芽的分化率。
关键词：油菜；下胚轴；不定芽；影响因素
中图分类号：Q943．2 文献标识码：A 文章编号：1000—3142(2003)o3—0240一o3
Factors affecting shoot regeneration at
high frequency from in vitro culture
hypocotyl of Brassica j uncea
LU Long-douI，ZHANG Sheng2，DUAN Hong-ying ，GAO W url ，Wei Kai—fa
(1．College of Lfe Science，Henan Normal University，Xinxiang 453002，China；
2．College of Vocational Technology Luohe，I uohe 462000，China)
Abstract：We use the hypocotyls of Brassica juncea(DB3)for the explants and analyse the influence of seed
age，plant hormone，AgNOa on high frequency regeneration．Results show that 3～ 5 d seedlings are suited to
induce calus，6-BA 1．5 mg／L4-NAA 0．1 mg／L can well differentiat shoot of hypocotyls，AgNO3 can in—
crease frequency of differentiation of hypocotyls．
Key words：Brassica juncea；hypocotyls；shoot；affecting factors
自从 1985年 Horsch最早获得油菜转基因植
株以来，油菜转化的研究在国内外取得了一定的进
展。但是由于多种因素的影响，转化率都不高，尤其
是外植体的再生率不高，目前国内外关于油菜组织
培养方面的研究主要集中在如何提高外植体再生频
率这一点上。很多研究发现，激素组配和培养条件
是影响油菜外植体再生频率的因素(Jain，1988；
Khehra，1992)，而且许多研究结果存在着很大差
异，甚至是相互矛盾的。这就给油菜高频率再生技
术提出了更高的要求。本实验研究了一些影响油菜
下胚轴不定芽再生的因素，发现苗龄、激素、AgNO。
对下胚轴的芽再生都有不同程度的影响。
1 材料与方法
1．1材料
本研究以芥菜型油菜(Brassica juncea)的一个
品种DB (山西省农科院高寒所杨琪研究员提供)为
材料。
1．2培养基
以MS(1962)培养基为基本培养基，附加不同
浓度的 6-BA(6一Benzylaminopurine，6一苄基氨基嘌
呤)、NAA(Naphthalene acetic acid，萘乙酸)及 Ag—
NO 。蔗糖浓度为 3 、琼脂浓度为 0．6 、肌醇浓
收稿日期：2002-01-25} 修订 日期：2002-06-24
基金项目：河南省科委攻关项目(O124160310)
作者简介：卢龙斗(1954一)，男，河南宜阳人，教授，硕士生导师，从事植物分子遗传研究。
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3期 卢龙斗等：影响油菜下胚轴外植体芽高频率再生的因素 241
度为0．01％，pH为 5．8，并在 121℃、1．1 kg／cm。
的压力下灭菌。
1．3方法
1．3．1无菌苗的培养 将油菜种子用0．1 HgCL2
浸泡 10 rain，无菌水冲洗 4～6次后接种于 i／4 MS
+6 g琼脂的无菌苗培养基上，在 24℃、16／8 h的
光暗周期条件下培养。
1．3．2材料接种 切取无菌苗下胚轴(约0．5 cm)接
人含有不同浓度的 6一BA、NAA及 AgNO3的分化
培养基的三角瓶中，在 24} 光照、25℃条件下培
养，每次接种 30个，重复 3次。
1．3．3出愈率和分化率的计算：
出愈率= × 1o0
分化率= 糕 ×10。％
表 1 不同时期的外植体愈伤组织形成的情况
Table 1 The calus of explants in different ages
注：“+”代表愈伤组织的多少 Notel“+”represent the amount of calus
2 结果与分析
2．1苗龄对愈伤组织诱导的影响
将培养 2、3、5、7 d的油菜无菌苗的下胚轴，分
别接种在含 6一BA 3 mg／L、NAA 0．2 mg／L的诱导
愈伤组织的培养基上，3 d后，接种的下胚轴均有膨
大现象；1周后，3、5 d无菌苗的下胚轴长出愈伤组
织，随后，2、7 d的下胚轴也长出愈伤组织；2周后愈
伤组织生长情况较好，已经遍布切口处。3周时的
统计情况见表 1。
从表 1可知，培养 2 d的无菌苗的下胚轴出愈
率不高，且出愈量低；3、5 d的苗形成愈伤组织的时
间也不长，而且出愈率高，出愈量多；虽然 7 d的苗
出愈率不低，且出愈量多但是出愈时间稍长，愈伤组
织的长势也不好。总的来说，3～5 d的苗比较健
壮，形成愈伤组织的时间较短，且愈伤组织长势比较
好。
2．2植物激素对芽分化的影响
从诱导出的愈伤组织中选择生长良好、质地疏
松的作为再分化的材料，以MS为基本培养基，设计
5种不同的激素组合，比较它们对芽再分化的影响。
在再分化培养过程中，起初愈伤组织元明显变化，1
周后，开始有芽状体，l5 d后不定芽形成，30 d时，
成长为单个植株或丛生苗。实验结果见表 2。
由表 2可知，整体分化率不低，以 6一BA 1．5
mg／L+NAA 0．1 mg／L的组合效果好，其诱导分
化效率最高，且形成的多芽体稍多，苗生长也较健
壮；虽然 6-BA 1 mg／L+NAA 0．05 mg／L的组合
诱导分化率高，但是形成的苗较弱，平均出芽数也不
多。
表 2 激素对不定芽分化的影响
Table 2 The influence of hormone to
shoot differentiation
激素
Hormone
(mg／I )
接种个数 出芽个数 分化率( )
Inoculation Shoot Frequency of
number number differentiation
2．3 AgNOs对芽分化的影响
从诱导出的愈伤组织中选择生长良好、质地疏
松的作为再分化的材料，以 6-BA 1．5 mg／L+NAA
0．1 mg／L为分化培养基，加入不同浓度的 AgNO。，
比较它们对再分化芽的影响，实验结果见表 3。
由表 3可知，当没有加人 AgNO 时，芽的分化
率也不低(70 )，而加人 AgNO。后，芽的分化率明
显增加。当加人 30 M／L AgNO 时，芽的分化率
最高，为78．89％。另外，从上表也可以看出芽的分
化能力并不随 AgNO。浓度的升高而增加，当 Ag—
NO 为 40 M／L时，芽的分化率反而低，并且在离
体培养的过程中发现，下胚轴的褐化现象比较严重。
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242 广 西 植 物 23卷
表 3 AgNO3对芽分化的影响
Table 3 The influence of AgNO3 to
shoot differentiation
3 讨 论
前人研究表明，油菜下胚轴外植体的芽再生频
率除受基因型影响外，也受培养基中附加成分的影
响(Dale和 Bal，1991；Murata和 Orton，1987；秦明
辉等，1994)。本实验也得出相似的结论，当培养基
中不含 NAA时，下胚轴没有形成愈伤组织，而且没
有膨大、增粗，只在切口处生长出 1～3条典型的根。
大部分研究表明，培养基中加入 6一BA、NAA可以促
进油菜下胚轴的芽分化(钟蓉等，1997；Hachy等，
1991)。本研究还发现，在再分化过程中以 6-BA
1．5 mg／L+NAA 0．1 mg／L组合时诱导分化芽的
效果较好，而过高或过低其促进作用降低。另外，很
多研究发现，AgNO： 对于组织培养及转化中芽的再
生是有利和必要的，因为 Ag 是乙烯合成的抑制
剂，它可以通过竞争性结合细胞膜上的乙烯受体蛋
白从而阻止或降低乙烯的作用；而且对再生频率的
影响甚至大于基因型和激素的影响(De Block等，
1989；石淑稳等，1998；Deepak等，1993；Chi等，
1990)，另外，不同的研究所用的浓度差异很大(秦明
辉等，1994；程振东等，1994)。本实验以培养不同天
数的油菜下胚轴为研究对象，发现下胚轴的分化能
力随苗龄的增加而降低，5 d的下胚轴分化能力最
强(74．4 9，6)，3 d的次之(68．89 9，6)，2、7 d的较低
(分别为 6O 、62．2 )。总之，在进行油菜转基因
之前，有必要优化组培条件、激索组合浓度以及 Ag—
NOs浓度，以提高不定芽再生频率，进而获得较多
的转化植株。
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