全 文 ：广 西 植 物 Guihaia 26(6)：617— 620 2006年 11月
水稻抗褐飞虱基因 SCAR标记的获得
武 波，韦 东，欧 倩
(广西大学 生命科学与技术学院，广西 南宁 530005)
摘 要：采用 282个随机引物对药用野生稻 1665和栽培稻桂 99远缘杂交的抗褐飞虱近等基因系B3F4分离
群体的不抗池 DNA和抗池 DNA进行了特异性 RAPD标记筛选 ，从 中筛选到一个具有明显的特异性扩增带
谱的RAPD标记 SI159，序列分析表明，$1159序列长度为 1 408 bp，与基因库中已报道的水稻第四号染色体的
BAC克 隆(编号 OSJNBa0070011)序列(67114—69100)有 51．86 的同源性。为了提高所找到的 RAPD标记
S1159在应用上的稳定性，将 RAPD标记转化为 SCAR标记检测近等基因系群体 ，结果表明与 RAPD标记结果
一 致 ，说明该研究得到的 RAPD标记具有较好的稳定性和重复性，为进一步的研究打下了良好的基础。
关键词 ：药用野生稻 ；抗褐飞虱基因；RAPD标记 ；SCAR标记
中图分类号 ：Q943．2 文献标识码 ：A 文章编号 ：lO0O一3142(2006)06—0617-04
SCAR marker 0f j[；ph from rice
W U Bo，W EI Dong，OU Qian
(College of Life Sciences and Biotechnology，Guangxi University，Nanning 530005，China)
Abstract：282 arbitrary primers were used to amplify the genomic DNA of the near isogen~c lines(NIL)B4 F4
pools(cv 1665 of Oryza officinals舍×CV Gui99 of Oryza sativa)of resistance and nonresistance．The results
showed that RAPD primer S1 1 59 could generate a RAPD marker．The sequence length was 1 408 bp．Further-
more，SCAR marker transformed from RAPD marker was used to analyze progenies of inbred．The results are
in accordance with RAPD marker’S．
Key words：Oryza officinalis Wall EX Watt；Bph；RAPD marker；SCAR marker
水稻褐飞虱(Nilaparvata lugena Sta1)是亚洲
最严重的水稻害虫之一(秦学毅等，1999)，是一种以
稻属为食的单食性昆虫，除了直接危害水稻植株外，
还同时传播稻草状矮缩病等，引起水稻严重减产，一
般情况下，水稻褐飞虱危害造成的谷物损失为 15
以上，严重年份达到 5O 。而水稻是最重要的粮食
作物之一，全世界将近一半的人 口是以水稻为主要
粮食，所以选育和种植抗褐飞虱水稻品种就显得尤
为重要。目前已知的水稻抗褐飞虱基因共有 14个，
近年来利用分子标记技术标记定位的有第 12号染
色体上的Bphl和 Bph2、BphlO(￡)，及第 2号染色
体上的Bph13(t)(刘国庆等，2001)。药用野生稻对褐
飞虱具有很高的广谱抗性，我们通过药用野生稻和栽
培稻桂 99的远缘杂交和后代选择，已将药用野生稻
的抗源转入栽培稻中。本实验采用 RAPD标记技术
和SCAR标记技术对杂交后代自交分离群体筛选与
抗褐飞虱基因连锁的RAPD标记，作为辅助育种的分
子标记(刘雄伦等，2000)，同时通过将 RAPD标记转
换为S 标记作为标记辅助选择，解决 RAPD标
记稳定性差的缺点(王春望等，1999)。
1 材料与方法
1．1实验材料
本实验所用的材料为药用野生稻 1665(Oryza
officinals Wail Ex Watt)与栽培稻桂 99远缘杂交
收稿 日期：2005—05—27 修回日期：2005—10—24
基金项目：广西科 技攻关项 目(桂攻关 0228019—3)资助ESupported by Key Technologies Research and Development Program of
Guang xi(O228O19—3)]
作者简介：武波(1962一)，男 ，广西武宣人 ，博士，教授 ，主要从事微生物和植物的分子生物学研究 。
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6】8 广 西 植 物 26卷
的B3F{代自交分离群体(秦学毅等，2002)。
1．2水稻基 因组 DNA的提取
用 CTAB法提取水稻总 DNA，分别溶于 1×
TE中 20℃保存备用 ，经 1．0 的琼脂 糖凝胶 电泳
捡测水稻． DNA 的完整性，井根据 EB染色强度计
算其浓度(武波等 ，2001)。
1．3 RAPD多态性引物的筛选
PCR反应 所需 的 TaqDNA聚 台酶和 随机 引物
购自宝生物工 程(大 连)有限公 司，dNTP购 自 pro—
mega公 司，PCR仪为 PE公 司 9600型 。
选取 B3F4代自交分离群体中 l0株不抗褐飞
虱植株总DNA混台作为不抗池 DNA，10株抗褐飞
虱植株总 DNA混合作为抗 池 DNA，用每一条
RAPD引物分别对不抗池DNA和抗池 DNA分别
进行 RAPI~PCR．PCR扩增反应体系建立：10×
buffer 2 L 2．5raM dNTP 2 I．10pM RAPD prim
er l L总 DNA(20,～50 ng,／pL)1 L ExTaq(0 5
u L，2 L，加 ddH 2O补足至 20 L 95℃预变眭
5 min：94℃ 30,s，36℃ 30 s，72℃ 1 rain如 个循
环 ；然后 72℃延伸 l0 rain(袁 勇芳等．2000) PCR
反应扩增产物用 1．5 琼脂糖凝胶电泳然后经 EB
染色检测，并 已录每条扩增带谱在琼脂错凝胶上的
位置．筛选具有抗揭飞虱基因多态性的随机引物
1．4 RAPD标记 的克 隆和测 序分析
胶回收试剂盒购自上海华舜生物工程有限公
司 ．pGEMOR T Easy veclor kit购 自 Promega公
司 用筛选的 RAPD引物大量扩增 RAPD标记，
PCR产物用 1．5 琼脂糖 凝胶 电淋．再用柱离心式
M 1 2 ． 3 一 M
圈 l 随机引物 sII 59对自交分离群体的 RAPD指纹图谱
Fig l RAPD fingerprinting of inbred progenies 0r S1 159
M：1 DNA标准；1：冉变舟离群体DNA不抗池；2：门交分离群体 DNA机池；
3：自交分离群体不抗株1 1 0#；4：白室丹离群体抗株 1 l0#
M Ikb DN A marker；1：DNA p0o[of nanre~istant progenies of inbredI 2：DNA pool of resi slan progenies
of inbredl3：NonreMstan~progemes iabred 1一l04 ；4：Resi st0 t progenies of Inbr一 1-1c≯
小量胶回收试剂盒回收 RAPD特异性标记片段，并
连接克隆至克隆载体 pGEMOR—T Easy veetor上，
按照 BIO—RAD公司电脉冲仪的操作程序，采用电
激法转化 E．coli DH5a，在含有 X-gal和 IPTG 的氨
苄青霉素LA选择培养基上挑选白色菌落．并用限
制性内切酶EcoR I酶切鉴定重组质粒(顾红雅等，
1 997)，送宝生物工程大连有限公司测序。
1．5 SCAR标记检 测
根据 RAPD标记特异 性 片段 DNA测 序结果 ，
设计特异性引物 用特异性引物对 J 5株不抗株
DNA和l5株抗株 DNA进行 SCAR—PCR，体系为：
10×buffer 2 L 2．5nlM dN FP 2 L l 0pM primer
各 1 L总 DNA(20～50 ng．,pI )1 IzL Ex Faq(0．5
u／l cL)2【J【|，加 ddH：0补足至 20 L 0j℃预变性
5 rain；94℃ 30 S，50℃ 30 s，72℃ 1 mit 30个循
环；然后 72℃延伸 l0 rain。PCR反应扩增产物用
1．0 琼脂糖凝胶电泳然后经 EB染色检测
2 结果 与分析
2．1 RAPD引物筛选
在本实验中，我们选用了 Z82个随机引物分别
扩增水稻不抗池 DNA和抗池 DNA、进行 RAPD多
态性分析 ，选 取 8个在两 个 I)NA 池 中表 现 多态 性
比较明显的随机引物，分别对 10株不抗椿和 10株
抗株进行 RAPD分析 其中 随机引物 sl1 59在不
抗株中都没有扩增出RAPI)特异性片段．在抗性株
中有 8株扩增 出 RAPD特异性 片段 ．2株没有扩增
出RAPD特异性片段，实验结果表明，恢 RAPD标
记与抗揭 飞虱基因是连锁 的(图 1)。
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6期 武 波等 ：水稻抗揭飞虱基因 SCAR标记的获得 619
2．2 RAPD标记 的克 陛和测 序分析
用随机引 物 St159大量扩 增 RAPD特异 性片
段，回收】．4kh左右特异性片段，克隆至克隆载_I本
pGEM~一T Easy vector上 ，获 褥重组 质粒 pSI159，
DNA测 序结果 表 明，RAPD标记 st189片 段长 度
为 l 408 bp，用 BLAST软件与 Genbank中已知的
序列进行同源性比较发现，该片段序列基因库中已
报道的水稻第四号染色体的 BAC克隆(编号为 OS
』NBa0070011)序 列(67114—69100)有 51．86 的同
源性 ，其 中在该 序 列 中的 (671l 4-67684)、(67680—
68066)和 (68998 6 91O0)三 个 位 点 有 98％ 的 同源
性 ．证 明这 个位 在水 稻遗传 中具有 高度的保 守性
(图 2、3)。
2．3 SCAR标记检测
SCAR marker(seqtlence characterized amp[i—
lied region)序列特征化扩增区域标 记通常是由
RAPD标记转化而来的 为了提高所找到的某一
RAPD标记在应用上的稳定性．可将该RAPD标记
片段从凝胶上回收并进行克隆和耐序，根据其碱基
序列设计一对特异性引物(L8～24 bp)，也可只对该
RAPD标记 片段 的末端进 行测序，在原来的 l0个碱
基引物的基础上增加相邻的 1 4个左右的碱基，成为
固 2 重组质粒 ps1159 EeoR I酶 切电1泳分析
Fig．2 E】ectr0口h0res analysis of recomhinan
plasmid pSI 159 digested with EcoR I
M：1 kb DNA 标准 I i：重 组质较 pSl159。
M ：lkbDNA marinerI J Re~ombtnant plasmid pSl159
GTTCTCGGACAGATAACfAG7AAAOAGCTTT^AA A^e T^GGAAACATAGGTTGTTTGTCACT^ ¨ AAAG^ CAGT^ C盯 TATCAGCAGCATTAGGTAATA3
1 01 TG GTCTCT^ C^TA ATCACGCGTACC^ GCATGTACAGAT^ TATGCTCAATTGGTTGTT^ TAAGTACCTTCAAAACAAAAGdTGATCGAAATGCCAAA
201 TTGATCATAGTAGCAAACAAAAGAGATTAGGGITAGAGGAGATAGCAAACATGGAGATTAATGCTICTTCA6GTTCT^ ATTGCTTTTCTGTTGOACTATT
301 GCTTAAC rOCTCCTGTGGATCTTCCTOATOCTOACOA^ CCTCTTCTTCTTAACCCAAT^ GC^ TGTTT^ GTTTGATTTTACACTG^ TGCCCAGGGTAGTAT
401 TIA TSTCCACACTCCCCCAAAATCCACACTCCAATGTGTGACCCCTTTAGT TATCT^ CACCTCGCTCAG GGA^ GAAA^ AATG
5DI OAAGC-I]JGCCAATTJG11T7TATATAAICAGCGAIAI C1TCGAT^ ¨ GTGCTAAGAAM GAAe^ AGTAAAOIATTACATGGTCTTGTG^ G^CT6T
601 TTCGGGTCCG^ CTTAACTAT TGGTAGGTCTGACTATCTGTCTTTAOCTGOTATCG GTAAA^ CTGCCC¨ TGTGGCABCTCTGGTCCTOOCT TACA
70I TTACCAGTAGGTAATTTGTCTAGT6CCTGTACCCTTTCTTTTGA G^ GG^ GTC TGTAAGCCAATGCTTAGGTCTTCACCTCOAGCCAATCAGAATCT
801 GAAGTCA6CGGGGTATTCCAATATAGTCACTICTAAGGAGGTTOGCTAGCACTGAGAAACCCGBGAGGCCAGGCAGTGAAAOGTTCCGCAGACTGGTOA6
901 CCGGCCAC C^CTeGGAGCGGA GAAGGCTGGCAATACAAGCATCATCTBTCCAACAGOOTACTTGTCATCCGTAAACATCACAG TCGTTAGTGCAAGCG
OO1 GGAATGAGAACACC^ CTATCTT^ GAAGAAATTAGT TTATTTTTCCTGACTAGCA^ GTGGAeAGG
1 01 CTCAGATGGCGT ￡CTGATGTGTCATGCTAGGTATOTTTTATTGGCCATTTTGGATTTCTCTCAAGGGATTGAAGACTTTCCTCTATACTGACAGAAGCA
201GAGAGGGTGGTAAA# ．AG 5．ACT#．CTGGGCGTATAGTTAGGACOCTACAAAgCTATAGGA％ ATACGTTAGGTTCGTAXCCCTTGGCCCTACGTGACCTT
30’CTCCTATGCCATTCOOTCTTTCTCGGBCATTAGATTTTGCTTGCT$GTAOTAGAAGTTAACATCTTCATTACTOGATGGTG,AAACCTACTCTGGTGGGGT
401 CCGAGAAO
图 3 RAPD标记 sl1 59的核甘酸序列
Fig 3 Nucleic acid sequence Of RA I D marker S1 1 59
与原来RAPD标记片段末端招配对的特异性引物。
根据 RAPD标记 sl1 59 DNA测序结果，我们设计
了一对特异性引物，PCR产物大小 138lbp+序列为：
正向引物 rTcTcGGAcAGATAAcTA(jTAAA—
CAG，反向引物 CACCATCGAGTAA]、GAAGA_r_
GI’TAAC，实验结果表明，不抗株没有扩增出特异
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62D 广 西 植 物 26卷
面 2
圈 4 自交分离群体 SCAR标记电泳分析
Fig 4 Electrophoresis ana[ysis。f SCAR marker of inbred progenies
M ：lkb标 准}1，自交丹 离群怍 抗 株 J_1 5#；2：自主 离 群体抗 1 1 54
M 1kb DNA m arker：I：No~ esi stB t progenies ofinbred 1 1j# ：2：Res~．L 1 progenies ofinbred卜 1 5#
性DNA片段，抗植株有 l3株扩增出特异性 DNA
片段 ，两株设有扩增出特异性 DNA片段，实验结果
与 RAPD扩增结果完全一致 (图 4)。
3 讨论
野生稻由于长期经受各种自然灾害的影响和不
良环境的 自然选 择分化，产生 了不 同程度 的抗逆’睦，
例如，参与胁迫反应和衰老的基因在褐飞虱取食后
表达增强(f-I青，2005)，药用野生稻是我国三种野生
稻资源的重要组成部分 ，具 有对很 多种水稻 主要 痈
虫害的免疫高抗优质种质资源(钟代彬等．1§97)。
广西药用野生稻对褐 飞虱具 有很强 的抗 性 ，用栽培
稻桂 99连续不断地 与广西药用野生稻 1 665抗源后
代回交，然后自交获得自交分离群体．并进行抗揭飞
虱鉴定。研究中利用 282个 l0 bp随机引物分别扩
增 自交分离群体 的不抗林 DNA 池和抗株 DNA池，
结果筛选到 8个随机引物能扩增 抗褐飞 虱基 因的多
态性带，其中随机引物 sll5g特异性带与抗褐飞虱
基因的重组很少，说明该 RAPD标记与抗褐飞虱基
因是连锁 的：自动测序结果 分析表 明．RAPD标记
s1i59序列长度为 L 408 bp，该序 与 GenBank的
序列进行同源性比较发现与与基因库中已报道的水
稻 第 四 号 染 色 体 的 BAC 克 隆 (编 号 为
OSJNBa0070OL1)具有 51．86 的同源性，而且其中
三个 区 (67 L14—67684)、(67680—68056)和 (68998—
69100)有 98 以上的同源性。根据 RAPD标记序
列，转化为特异性和稳定性更好的 SCAR标记检测
自交分离群体．实验结果表明，与 RAPD标记结果
完全一致 ，说明该 RAPD标 记具有 比较 良好的稳定
性和重复性 进一步的研究工作正在进行当中。
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